耿耿 鹿洪亭 李慶浩 明明

［摘要］ ?目的 ?探討靶向調(diào)控張力蛋白同源物（PTEN）和磷脂酰肌醇激酶（PI3K）對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制。

方法選取15例腎母細(xì)胞瘤患兒的術(shù)后腫瘤組織及癌旁正常組織，采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)組織中

PTEN和PI3K蛋白及mRNA的表達(dá)水平；將腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞分為對(duì)照組（A組，轉(zhuǎn)染NC siRNA及Flag空載體）、PTEN過(guò)表達(dá)組（B組，轉(zhuǎn)染NC siRNA及Flag-PTEN表達(dá)載體）、PI3K敲低組（C組，轉(zhuǎn)染siPI3K及Flag空載體）、聯(lián)合靶向組（D組，轉(zhuǎn)染siPI3K及Flag-PTEN）。采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染24 h后SK-NEP-1細(xì)胞中PI3K、蛋白激酶A（AKT）及磷酸化蛋白激酶A（p-AKT）的表達(dá)水平；采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干預(yù)第24、48、72小時(shí)時(shí)SK-NEP-1細(xì)胞增殖情況；采用流式細(xì)胞術(shù)分析各組SK-NEP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期。

結(jié)果與癌旁正常組織相比，腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織中PI3K蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著升高（t=22.862、7.098，P<0.05），PTEN蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低（t=25.634、8.379，P<0.05）；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B、C、D組SK-NEP-1細(xì)胞中p-AKT蛋白水平明顯低于A組（t=8.386～11.900，P<0.05）；CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，干預(yù)第48、72小時(shí)時(shí)，B、C、D組SK-NEP-1細(xì)胞吸光度值明顯低于A組（t=5.163～8.647，P<0.05），干預(yù)第72小時(shí)時(shí)，D組SK-NEP-1細(xì)胞吸光度值明顯低于B、C組（t=3.982、4.021，P<0.05）；B、C、D組SK-NEP-1細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯高于A組（t=4.673～9.563，P<0.05），D組SK-NEP-1細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率明顯高于B、C組（t=5.829～8.075，P<0.05）；B、C、D組SK-NEP-1細(xì)胞G1期細(xì)胞比例明顯高于A組（t=7.518～14.747，P<0.05），S期細(xì)胞比例明顯低于A組（t=8.029～13.451，P<0.05），D組SK-NEP-1細(xì)胞G1期細(xì)胞比例明顯高于B、C組（t=9.930、9.732，P<0.05），S期細(xì)胞比例明顯低于B、C組（t=10.281、9.927，P<0.05）。

結(jié)論相比于單一靶向PTEN或PI3K，聯(lián)合靶向調(diào)控PTEN和PI3K可更顯著抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與其抑制PI3K/AKT信號(hào)通路、阻斷細(xì)胞周期有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ ?Wilms瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；PTEN磷酸水解酶；磷酸肌醇3-激酶類(lèi)

［中圖分類(lèi)號(hào)］ ?R737.11

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ ?A

Effect of targeted regulation of phosphatase and tensin homolog and phosphatidylinositol 3-kinase on the proliferation and apoptosis of nephroblastoma cells

GENG Geng， LU Hongting， LI Qinghao， MING Ming

（Department of Pediatric Surgery， The Affiliated Taian City Central Hospital of Qingdao University， Taian 271000， China）?;

［ABSTRACT］?Objective?To investigate the effect and mechanism of targeted regulation of phosphatase and tensin homolog （PTEN） and phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K） on the proliferation and apoptosis of nephroblastoma cells.

Methods?Posto-perative tumor tissue and normal paracancerous tissue were collected from 15 children with nephroblastoma， and Western blotting and quantitative real-time PCR were used to measure the protein and mRNA expression levels of PTEN and PI3K in tissue. Nephroblastoma SK-NEP-1 cells were divided into control group （group A， transfected with NC siRNA and Flag empty vector）， PTEN overexpression group （group B， transfected with NC siRNA and Flag-PTEN expression vector）， PI3K knockdown group （group C， transfected siPI3K and Flag empty vector）， a nd combined targeting group （group D， transfected siPI3K and FLAG-PTEN）. Western blotting was used to measure the expression levels of PI3K， protein kinase A （AKT）， and phosphorylated AKT （p-AKT） in SK-NEP-1 cells at 24 h after transfection; CCK-8 assay was used to observe the proliferation of SK-NEP-1 cells at 24， 48， and 72 h of intervention; flow cytometry was used to observe apoptosis rate and cell cycle at 24 h after transfection.

Results

Compared with normal paracancerous tissue， nephroblastoma tumor tissue showed significant increases in the protein and mRNA expression levels of PI3K （t=22.862，7.098，P<0.05） and significant reductions in the protein and mRNA expression levels of PTEN （t=25.634，8.379，P<0.05）. The results of in vitro cell experiments showed that compared with group A， groups B， C， and D had a significantly lower protein expression level of p-AKT （t=8.386-11.900，P<0.05）. CCK-8 assay showed that groups B， C， and D had a significantly lower absorbance value of SK-NEP-1 cells than group A at 48 and 72 h of intervention （t=5.163-8.647，P<0.05）， and at 72 h of intervention， group D had a significantly lower absorbance value of SK-NEP-1 cells than groups B and C （t=3.982，4.021，P<0.05）. Groups B， C， and D had significantly higher early and late apoptosis rates of SK-NEP-1 cells than group A （t=4.673-9.563，P<0.05）， and group D had significantly higher early and late apoptosis rates of SK-NEP-1 cells than groups B and C （t=5.829-8.075，P<0.05）. Compared with group A， groups B， C， and D had a significantly higher proportion of SK-NEP-1 cells in G1 phase （t=7.518-14.747，P<0.05） and a significantly lower proportion of cells in S phase （t=8.029-13.451，P<0.05）， and compared with groups B and C， group D had a significantly higher proportion of SK-NEP-1 cells in G1 phase （t=9.930，9.732，P<0.05） and a significantly lower proportion of cells in S phase （t=10.281，9.927，P<0.05）.

Conclusion?Compared with the targeted regulation of PTEN or PI3K alone， the targeted regulation of PTEN and PI3K can significantly inhibit the growth of nephroblastoma cells and promote cell apoptosis， possibly by inhibiting the PI3K/AKT signaling pathway and blocking cell cycle.

［KEY WORDS］?Wilms tumor; Cell proliferation; Apoptosis; Cell cycle; PTEN phosphohydrolase; Phosphatidylinositol 3-kinases

腎母細(xì)胞瘤又稱(chēng)維爾姆斯瘤，是臨床常見(jiàn)的兒童腎臟惡性腫瘤，主要采用手術(shù)、放化療等綜合方案進(jìn)行治療，但是少數(shù)患兒因?qū)熕幬锊幻舾?，?dǎo)致預(yù)后效果欠佳［1-3］。靶向基因治療的副作用相對(duì)較少，已有靶向治療腎母細(xì)胞瘤患兒的成功案例［4］，有望成為腎母細(xì)胞瘤一線治療方式。張力蛋白同源物（PTEN）基因是細(xì)胞內(nèi)重要的抑癌基因，可以通過(guò)抑制磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶A（AKT）信號(hào)通路，影響細(xì)胞遷移、增殖以及分化等重要生理過(guò)程［5-11］，是當(dāng)前腫瘤治療的熱門(mén)靶點(diǎn)。此前有研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在腎母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)水平顯著下調(diào)［12-13］，并且一些非編碼RNA可以通過(guò)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控而影響腎母細(xì)胞瘤的疾病進(jìn)展［14］。但目前通過(guò)聯(lián)合靶向PTEN和PI3K是否能有效抑制腎母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)仍缺乏直接的研究證據(jù)。鑒于此，本研究通過(guò)在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PTEN同時(shí)敲低PI3K，探討聯(lián)合靶向調(diào)控腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的PTEN及PI3K對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為該腫瘤靶向藥物的研發(fā)提供新方向。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

Lipofectamine 2000（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；組織總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBR green qPCR試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；鼠源抗Flag抗體、PI3K抗體、AKT抗體、p-AKT（S308）抗體和GAPDH抗體（美國(guó)CST公司），兔源抗PTEN抗體（武漢艾美捷科技有限公司）；HRP偶聯(lián)抗小鼠IgG抗體、HRP偶聯(lián)抗兔IgG抗體［生工生物工程（上海）股份有限公司］；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人腎母細(xì)胞瘤SK-NEP-1細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)典型菌種保存中心，接種于6孔板中，加入完全培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清及1%青鏈霉素），置于37 ℃ 含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。待培養(yǎng)至第2代時(shí)分為4組，對(duì)照組（A組）細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC siRNA及Flag空載體，PTEN過(guò)表達(dá)組（B組）細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC siRNA以及Flag-PTEN表達(dá)載體，PI3K敲低組（C組）細(xì)胞轉(zhuǎn)染siPI3K及Flag空載體，聯(lián)合靶向組（D組）細(xì)胞轉(zhuǎn)染siPI3K及Flag-PTEN。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染表達(dá)載體及siRNAs，轉(zhuǎn)染操作依照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組織和細(xì)胞當(dāng)中的PI3K、PTEN、Flag、AKT、p-AKT蛋白

收集2019年11月—2022年10月青島大學(xué)附屬泰安市中心醫(yī)院兒童外科收治的15例腎母細(xì)胞瘤患兒手術(shù)切除的腫瘤組織及癌旁正常組織，剪碎后加入PBS研磨，離心以后棄上清液，加入1～2 mL組織裂解液以后繼續(xù)研磨，待充分裂解后于4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，獲得組織總蛋白。取轉(zhuǎn)染24 h后的A～D組SK-NEP-1細(xì)胞置于1 mL Ep管中，加入PBS 500 μL重懸，以2 000 r/min離心3 min，棄去上清液，然后向其中加入500 μL RIPA細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min后，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，得到細(xì)胞總蛋白。采用BCA法檢測(cè)組織和細(xì)胞中的總蛋白濃度。從各組組織及細(xì)胞中選取30 μg的蛋白樣品進(jìn)行加熱變性，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜并封閉。在裝有PVDF膜的容器中加入一抗及GAPDH抗體，4 ℃下孵育過(guò)夜，洗膜后加入對(duì)應(yīng)的二抗， 室溫孵育1 h，最后加入化學(xué)發(fā)光底物，進(jìn)行蛋白條帶成像。采用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參，蛋白相對(duì)表達(dá)水平以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)組織當(dāng)中PI3K、PTEN mRNA的表達(dá)

取15例腎母細(xì)胞瘤患兒術(shù)后腫瘤組織及癌旁正常組織，采用Trizol法提取組織中總RNA，檢測(cè)RNA濃度與純度，引物名稱(chēng)及其序列見(jiàn)表1。取0.5 μg總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取轉(zhuǎn)染24 h后的A～D組SK-NEP-1細(xì)胞，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，加入胰酶消化細(xì)胞，然后將消化好的細(xì)胞加入1 mL Ep管中，2 000 r/min離心3 min，棄上清液，以DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，接種于96孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于接種后第24、48 和72小時(shí)時(shí)取出培養(yǎng)板，加入10 μL CCK-8反應(yīng)液，于37 ℃下孵育4 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取均值。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

取轉(zhuǎn)染24 h后的A～D組SK-NEP-1細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)基，用1 mL磷酸鹽緩沖液漂洗細(xì)胞1次，于37 ℃下用胰酶消化90 s，重懸細(xì)胞，收集至15 mL離心管中，4 ℃下1 000 r/min離心3 min，棄上清液，用500 μL磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL FITC-Annexin V溶液及1 μL PI溶液，室溫避光染色15 min，使用流式細(xì)胞儀分析FITC和PI標(biāo)記比例。采用FCSalyzer軟件分析流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)，得到Q1～Q4四個(gè)象限，其中Q3象限為早期凋亡率，Q2象限為晚期凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.7 細(xì)胞周期檢測(cè)

取轉(zhuǎn)染24 h后的A～D組SK-NEP-1細(xì)胞，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，加入胰酶消化細(xì)胞，然后將消化好的細(xì)胞加入1mL Ep管中， 2 000 r/min離心3 min，棄去上清液，以500 μL磷酸鹽緩沖液漂洗細(xì)胞1次，2 000 r/min離心3 min，棄去上清液，以體積分?jǐn)?shù)0.70的乙醇（已于-20 ℃預(yù)冷）重懸細(xì)胞后，置于-20 ℃固定1 h。取出后再以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液漂洗2次后，棄上清液，加入500 μL磷酸鹽緩沖液重懸，加入1 μL PI溶液，避光染色5 min以后，使用流式細(xì)胞儀分析PI通道脈沖積分信號(hào)，并用Flowjo軟件Dean-Jett-Fox擬合模型計(jì)算S期細(xì)胞比例、G2/M期細(xì)胞比例及G1期細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以 ±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。多組多時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1腎母細(xì)胞瘤患兒腫瘤組織和癌旁正常組織中PI3K、PTEN蛋白和mRNA表達(dá)水平

與癌旁正常組織相比，腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織中PI3K蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著性升高（t=22.862、7.098，P<0.05），PTEN蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低（t=25.634、8.379，P<0.05），詳見(jiàn)表2。

2.2各組SK-NEP-1細(xì)胞中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平

免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A～D組SK-NEP-1細(xì)胞中PI3K、p-AKT蛋白水平比較差異有顯著性（F=6.388、5.831，P<0.05），AKT蛋白水平比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。與A組相比，B、C、D組中PI3K和p-AKT蛋白水平均明顯降低（t=5.677～11.900，P<0.05），與B、C組相比，D組PI3K和p-AKT蛋白水平明顯降低（t=3.786～4.321，P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.3各組SK-NEP-1細(xì)胞中細(xì)胞增殖情況比較

重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析顯示，時(shí)間、組別及時(shí)間與組別交互作用均對(duì)SK-NEP-1細(xì)胞吸光度值有顯著影響

（F時(shí)間=464.912，F(xiàn)組別=25.201，F(xiàn)組別*時(shí)間=11.570，P<0.05）。單獨(dú)效應(yīng)分析結(jié)果顯示，與第24小時(shí)相比，A～D組SK-NEP-1細(xì)胞吸光度值在干預(yù)的第48、72小時(shí)時(shí)均明顯升高（F=83.021～195.72）；干預(yù)第24小時(shí)時(shí)，A～D組吸光度值差異無(wú)顯著性（P＞0.05）；干預(yù)第48小時(shí)時(shí)，與A組相比，B、C、D組吸光度值均顯著降低（F=4.067，t=5.452～7.821，P<0.05）；干預(yù)第72小時(shí)時(shí)，與A組相比，B、C、D組吸光度值均顯著降低（F=29.003，t=5.163～8.647，P<0.05），與B、C組相比，D組吸光度值均顯著降低（t=3.982、4.021，P<0.05）。詳見(jiàn)表4。

2.4各組SK-NEP-1細(xì)胞凋亡情況比較

A～D組的SK-NEP-1細(xì)胞早期凋亡率分別為（1.76±0.21）%、（3.16±0.44）%、（3.02±0.27）%、（4.60±0.38）%，其晚期凋亡率分別為（1.38±0.18）%、（2.85±0.23）%、（2.77±0.20）%、（4.42±0.35）%。四組之間細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率比較差異有顯著性（F=11.665、8.854，P<0.05）。與A組相比，B、C、D組細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率明顯升高（t=4.673～9.563，P<0.05）；與B組、C組相比，D組細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率明顯升高（t=5.829～8.075，P<0.05）。

2.5各組SK-NEP-1細(xì)胞的細(xì)胞周期比較

細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，A～D組SK-NEP-1細(xì)胞G1期細(xì)胞比例、S期細(xì)胞比例比較差異有顯著性（F=10.921、12.661，P<0.05），G2/M期細(xì)胞比例比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。與A組相比，B、C、D組G1期細(xì)胞比例明顯升高（t=7.518～14.747， P<0.05），S期細(xì)胞比例明顯降低（t=8.029～13.451，P<0.05）；與B、C組相比，D組G1期細(xì)胞比例明顯升高（t=9.930、9.732，P<0.05），S期細(xì)胞比例明顯降低（t=10.281、9.927，P<0.05）。見(jiàn)表5。

3 討 ?論

目前，腎母細(xì)胞瘤確診后的治療仍以常規(guī)外科手術(shù)及術(shù)后放療和化療為主，盡管這些常規(guī)治療方案可以一定程度上提高患者的生存率，但手術(shù)創(chuàng)傷及化療藥物的不良反應(yīng)會(huì)給患兒帶來(lái)極大痛苦［15］。由于腎母細(xì)胞瘤缺乏有效的早期診斷標(biāo)記物，因此，探究腎母細(xì)胞瘤的早期診斷方式，尋找新的靶向干預(yù)策略成為當(dāng)前該疾病研究的熱門(mén)方向。PTEN是重要的抑癌基因，許多泌尿系統(tǒng)腫瘤如前列腺癌、膀胱癌等的發(fā)生都伴隨PTEN基因的缺失或低表達(dá)，而PTEN低表達(dá)與腫瘤發(fā)生及不良預(yù)后均密切相關(guān)［5-10］。GRILL等［12］研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，腎母細(xì)胞瘤組織中PTEN表達(dá)及活性下降。CUI等［13］研究也發(fā)現(xiàn)低表達(dá)PTEN的腎母細(xì)胞瘤惡性程度更低，這些結(jié)果提示PTEN在腎母細(xì)胞瘤發(fā)生中應(yīng)該發(fā)揮著比較重要的作用，因此通過(guò)過(guò)表達(dá)載體靶向上調(diào)PTEN的表達(dá)水平，對(duì)于PTEN低表達(dá)的腎母細(xì)胞瘤患者的治療可能有益。

PI3K/AKT信號(hào)通路是經(jīng)典的被PTEN抑制的下游信號(hào)通路，PTEN低表達(dá)可能會(huì)引起PI3K、AKT的活性升高，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移［16-19］。PI3K由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基（p85）以及一個(gè)催化亞基（p110）構(gòu)成。胞外信號(hào)作用于受體酪氨酸激酶，進(jìn)一步催化PI3K調(diào)節(jié)亞基磷酸化，激活的PI3K將細(xì)胞質(zhì)膜上的PIP2轉(zhuǎn)變成為PIP3，PIP3進(jìn)一步與AKT及磷脂酰肌醇依賴(lài)的蛋白激酶1（PDK1）的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促使PDK磷酸化AKT?；罨腁KT可進(jìn)一步促進(jìn)下游諸多信號(hào)分子如mTOR、p27、GSK3等蛋白的磷酸化，影響下游蛋白的生理活動(dòng)［20-22］。PTEN可以將PIP2轉(zhuǎn)變成為PIP3，進(jìn)而抑制PDK1對(duì)AKT的磷酸化［23］。因此，在細(xì)胞當(dāng)中過(guò)表達(dá)PTEN或敲低PI3K都可以實(shí)現(xiàn)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可以使mTOR和GSK-3β等關(guān)鍵蛋白磷酸化，磷酸化的GSK-3β激酶活性受到抑制，進(jìn)而促進(jìn)β-catenin的激活并增強(qiáng)細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白如Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化及細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡［24-25］。然而PI3K/AKT信號(hào)通路在腎母細(xì)胞瘤中的作用仍缺少研究，在過(guò)表達(dá)PTEN的同時(shí)抑制PI3K是否更能有效抑制腎母細(xì)胞瘤的增殖活性，尚待進(jìn)一步研究。

為了驗(yàn)證PTEN及PI3K是否在腎母細(xì)胞瘤組織中異常表達(dá)，本研究使用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)及RT-qPCR實(shí)驗(yàn)對(duì)15例腎母細(xì)胞瘤患兒的腫瘤組織及癌旁正常組織中的PI3K、PTEN蛋白及mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，腎母細(xì)胞瘤腫瘤組織中PI3K蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著升高，PTEN蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低。該結(jié)果提示腎母細(xì)胞瘤腫瘤的發(fā)生可能與PI3K和PTEN表達(dá)異常有關(guān)。為了進(jìn)一步研究PI3K和PTEN在腎母細(xì)胞瘤腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究又通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PTEN以及敲低PI3K，觀察PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PTEN或敲低PI3K都抑制了p-AKT，但并不影響AKT蛋白的表達(dá)，且過(guò)表達(dá)PTEN并同時(shí)敲低PI3K的細(xì)胞中，p-AKT表達(dá)水平最低，這說(shuō)明聯(lián)合靶向調(diào)控PTEN和PI3K能增強(qiáng)p-AKT表達(dá)下調(diào)，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路。

隨后本研究對(duì)各組腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期等情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞通過(guò)表達(dá)PTEN或敲低PI3K都可抑制細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率，提高細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞比例，降低細(xì)胞周期中S期細(xì)胞比例；另外本研究又對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了過(guò)表達(dá)PTEN的同時(shí)敲低PI3K的處理，發(fā)現(xiàn)相比單一靶向PTEN或PI3K，聯(lián)合靶向的細(xì)胞吸光度值、S期細(xì)胞比例顯著下降，早期凋亡率、晚期凋亡率、G1期細(xì)胞比例顯著升高。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的吸光度值可反映細(xì)胞增殖活性，吸光度值越高代表增殖活性越強(qiáng)，所以該結(jié)果提示，聯(lián)合靶向調(diào)控PTEN和PI3K能增強(qiáng)抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻斷細(xì)胞周期。聯(lián)合靶向調(diào)控PTEN和PI3K的細(xì)胞被阻斷在有絲分裂G1期，細(xì)胞周期的阻斷會(huì)減慢細(xì)胞的增殖，細(xì)胞無(wú)法通過(guò)細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)則會(huì)激活細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究初步揭示了靶向PTEN以及PI3K影響腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡的作用及其機(jī)制。相較于單一靶向PTEN或PI3K，聯(lián)合靶向調(diào)控PTEN和PI3K可更顯著抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與其抑制PI3K/AKT信號(hào)通路、阻斷細(xì)胞周期有關(guān)。后續(xù)的研究可以嘗試開(kāi)發(fā)靶向調(diào)控PTEN和PI3K的病毒載體，為PTEN低表達(dá)的腎母細(xì)胞瘤患者的基因治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。

倫理批準(zhǔn)和知情同意： 本研究涉及的所有試驗(yàn)均已通過(guò)泰安市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)，文件號(hào)為（2019）倫審第（18）號(hào)。所有試驗(yàn)過(guò)程均遵照《赫爾辛基宣言》的條例進(jìn)行。受試對(duì)象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書(shū)。

作者聲明： 耿耿、李慶浩參與了研究設(shè)計(jì)；耿耿、鹿洪亭、明明參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波 厲建強(qiáng)）