史文軍 王學(xué)江 李 峰 劉正一 遲 艷 張志凱 黎慧 王李寶 孫林 萬夕和 秦松

摘要：為了探究飼料中添加褐藻寡糖（AOS）對脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）免疫和抵抗二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidate）能力的影響，試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)不同褐藻寡糖添加量處理，分別為0 mg/kg（CK）、500 mg/kg（T1）、1 000 mg/kg（T2）和2 000 mg/kg（T3），在相同條件下飼養(yǎng)60 d。結(jié)果表明：T2處理脊尾白蝦的終末質(zhì)量、總質(zhì)量增長率和特定生長率極顯著高于CK（P＜0.01）；T3處理脊尾白蝦存活率極顯著高于CK（P＜0.01）。相較于CK，T2處理脊尾白蝦肝胰腺中SOD活性、肝胰腺和肌肉中ACP活性、肝胰腺和肌肉中AKP活性、肝胰腺中PO活性均極顯著提高（P＜0.01）。T1處理LGBP基因在脊尾白蝦肝胰腺中相對表達(dá)量極顯著高于CK（P＜0.01），T2處理SOD、LGBP基因在脊尾白蝦肝胰腺中相對表達(dá)量均極顯著高于CK（P＜0.01），各處理LZM、SR和CTSB基因在脊尾白蝦肝胰腺中相對表達(dá)量與CK均無顯著差異（P>0.05）。表明飼料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖可以有效提高脊尾白蝦體內(nèi)部分抗氧化和免疫相關(guān)基因的表達(dá)量，提高脊尾白蝦的抗氧化水平和免疫能力?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量檢測結(jié)果與酶活性檢測結(jié)果一致。攻毒試驗(yàn)中，T1、T2和T3處理脊尾白蝦存活率在第3～5 d均極顯著高于CK（P＜0.01），但各處理脊尾白蝦最終存活率和CK相同，表明褐藻寡糖對二尖梅奇酵母MQ2101具有一定的防控作用，但并不能提高感染后的最終存活率。

關(guān)鍵詞：脊尾白蝦；褐藻寡糖；二尖梅奇酵母；免疫能力

中圖分類號：S917.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2024）04-0698-13

Effects of alginate oligosaccharides supplementation on immunity of Exopalaemon carinicauda

SHI Wen-jun1，2，3，WANG Xue-jiang4，LI Feng4，LIU Zheng-yi1，3，CHI Yan4，ZHANG Zhi-kai4，LI Hui2，WANG Li-bao2，SUN Lin1，WAN Xi-he2，QIN Song1，3

（1.Yantai Institute of Coastal Zone Research， Chinese Academy of Sciences， Yantai 264003， China；2.Jiangsu Institute of Oceanology & Marine Fisheries， Nantong 226007， China；3.University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China；4.Wuzhoufeng Agricultural Science & Technology Co.， Ltd.， Yantai 264000， China）

Abstract：In order to investigate the effects of alginate oligosaccharides （AOS） on the immunity and resistance of Exopalaemon carinicauda to Metschnikowia bicuspidate， four treatments were set up， the addition levels of AOS were 0 mg/kg （CK）， 500 mg/kg （T1）， 1 000 mg/kg （T2） and 2 000 mg/kg （T3）， respectively. The shrimps were fed under the same conditions for 60 days. The results showed that the terminal weight， total weight growth rate and specific growth rate of Exopalaemon carinicauda of T2 treatment were significantly higher than those of CK （P＜0.01）， and the survival rate of Exopalaemon carinicauda of T3 treatment was significantly higher than that of CK （P＜0.01）. Compared with CK， the SOD activity in hepatopancreas， ACP activity in hepatopancreas and muscles， AKP activity in hepatopancreas and muscles， and PO activity in hepatopancreas of Exopalaemon carinicauda of T2 treatment were significantly increased （P＜0.01）. The relative expression level of LGBP in hepatopancreas of Exopalaemon carinicauda of T1 treatment was significantly higher than that of CK （P＜0.01）. The relative expression levels of SOD and LGBP in hepatopancreas of Exopalaemon carinicauda of T2 treatment were significantly higher than those of CK （P＜0.01）. The relative expression levels of LZM， SR and CTSB genes in hepatopancreas of Exopalaemon carinicauda were not significantly different from those of CK （P>0.05）. The results showed that the addition of 1 000 mg/kg alginate oligosaccharides in the diet could effectively increase the expression of some anti-oxidation and immune related genes， and enhance the anti-oxidation level and immune ability of Exopalaemon carinicauda. The results of relative gene expression were consistent with the results of enzyme activity detection. ?In the challenge experiment， the survival rate of Exopalaemon carinicauda in T1， T2 and T3 treatments was significantly higher than that in CK （P＜0.01） in 3-5 d. But the final survival rate of Exopalaemon carinicauda in each treatment was the same as that in CK， which indicated that alginate oligosaccharides could prevent and control Metschnikowia bicuspidate MQ2101， but could not improve the final survival rate after infection.

Key words：Exopalaemon carinicauda；alginate oligosaccharides；Metschnikowia bicuspidate；immunity

脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）隸屬于甲殼亞門（Crustacea）、十足目（Decapoda）、長臂蝦科（Palaemonidae）、白蝦屬，又名小白蝦、五須蝦，是中國特有的經(jīng)濟(jì)蝦類之一[1]。由于其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，生長速度快、繁殖能力強(qiáng)、適應(yīng)性廣，且具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在江蘇沿海地區(qū)被快速推廣養(yǎng)殖[2]，目前江蘇省養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量均居全國首位。然而近些年一種被當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶稱為“僵尸病”的新疾病在江蘇省沿海脊尾白蝦養(yǎng)殖區(qū)開始流行，本課題組前期已經(jīng)開展了該病的流行病學(xué)和病原學(xué)研究，分離純化出致病原，致病原鑒定為二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata），命名為MQ2101[3]。目前有關(guān)二尖梅奇酵母的致病機(jī)制及其在養(yǎng)殖環(huán)境中的感染傳播途徑、具體的防治措施都尚不明確。當(dāng)脊尾白蝦出現(xiàn)“僵尸病”典型癥狀時(shí)，已經(jīng)進(jìn)入感染后期，患病蝦活動減少且不再攝食，這增加了該病的治療難度。因此在脊尾白蝦養(yǎng)殖過程中需要加強(qiáng)預(yù)防意識，深入貫徹防大于治的原則。

脊尾白蝦屬于無脊椎動物，不具有獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠先天性免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞免疫和體液免疫來抵抗外源病原體的侵染。細(xì)胞免疫主要是依靠血淋巴進(jìn)行吞噬和包囊等一系列過程，血細(xì)胞中的半顆粒細(xì)胞主導(dǎo)包囊過程，顆粒細(xì)胞介導(dǎo)機(jī)體的凝集作用，同時(shí)它們也參與吞噬作用[4-5]。體液免疫主要包括抗氧化酶系統(tǒng)、酚氧化酶原激活系統(tǒng)和一些抗菌肽等[6-8]。因此提高脊尾白蝦先天性免疫能力是目前養(yǎng)殖生產(chǎn)中常用病害防治方法之一。

褐藻寡糖（Alginate oligosaccharides，AOS）是褐藻膠通過褐藻膠裂解酶降解得到的低分子聚合物，是一種無支鏈陰離子寡糖，由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）（比例2∶1）構(gòu)成，其相對分子質(zhì)量一般低于2×103 [9-11]。褐藻寡糖具有溶解性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、易被吸收、安全無毒和多種生物活性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、食品和農(nóng)業(yè)等方面[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)褐藻寡糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性，適宜的攝入量可以提高水產(chǎn)動物機(jī)體免疫能力。在草魚（Ctenopharyngodon idella）的日糧中添加適量含量的褐藻寡糖可以顯著提高其體內(nèi)溶菌酶（LZM）、堿性磷酸酶（AKP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）的活性，從而提高抗氧化性能增強(qiáng)草魚的非特異性免疫能力[15-17]。在大菱鲆（Scophthalmus maximus）飼料中添加褐藻寡糖可以顯著增加大菱鲆血液中白細(xì)胞數(shù)量和酸性磷酸酶（ACP）活性，進(jìn)而提高大菱鲆的非特異性免疫能力[18-20]。在大黃魚（Larimichthys crocea）和石斑魚的日糧中添加褐藻寡糖可以顯著提高大黃魚血清中的CAT和LZM活性與石斑魚血清中CAT、ACP、AKP和LZM的活性，從而提高大黃魚和石斑魚的免疫能力[14]。褐藻寡糖投喂刺參（Apostichopus japonicus）可以顯著提高其體腔液和體壁中ACP、AKP、LZM和過氧化物酶（POD）活性，從而提高刺參的非特異性免疫能力[21]。

為了探究褐藻寡糖增強(qiáng)脊尾白蝦免疫能力的效果及防控“僵尸病”的可行性，本研究給脊尾白蝦飼喂不同含量褐藻寡糖的日糧，在相同條件下飼養(yǎng)脊尾白蝦60 d后，統(tǒng)計(jì)和觀察各處理脊尾白蝦生長性能、組織超微結(jié)構(gòu)、免疫酶活性、免疫基因表達(dá)，并通過二尖梅奇酵母MQ2101攻毒試驗(yàn)檢測各處理脊尾白蝦對二尖梅奇酵母MQ2101的抗性，以評價(jià)日糧中添加褐藻寡糖對脊尾白蝦免疫能力的影響。本研究為褐藻寡糖在脊尾白蝦免疫調(diào)節(jié)和防控“僵尸病”方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究試驗(yàn)用褐藻寡糖來自五洲豐農(nóng)業(yè)科技有限公司；二尖梅奇酵母MQ2101來自本實(shí)驗(yàn)室分離保存的菌株；總蛋白質(zhì)（TP）含量、SOD活性、酚氧化酶（PO）活性、ACP活性、AKP活性以及LZM活性檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司。

在江蘇省海洋水產(chǎn)研究所江蘇省脊尾白蝦良種場養(yǎng)殖池塘內(nèi)用地籠收集5 kg種蝦，運(yùn)回養(yǎng)殖車間，于室內(nèi)水泥池中暫養(yǎng)穩(wěn)定2 d后，從中挑選規(guī)格一致的雌蝦[（5.0±0.2） cm]和雄蝦[（4.0±0.2） cm]，活力好、無損傷、且性腺發(fā)育同步的種蝦250尾 （雌雄比3∶1），轉(zhuǎn)移至1 000 L圓形塑料桶中。在溫度（25±1） ℃，鹽度25±1，溶解氧（7.8±0.5） mg/L，pH 8.1±0.2條件下繼續(xù)飼養(yǎng)，期間用鮮活沙蠶和四角蛤蜊肉投喂進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化，每天分3次投喂，時(shí)間分別為7：00、18：00、21：00，其中后2次的投喂量占投喂總量的80%。每天換水1/3，并及時(shí)清理殘餌、糞便和死蝦等污染物。

挑選受精卵快孵化的抱卵雌蝦50尾，轉(zhuǎn)入1 000 L圓形孵化桶中飼養(yǎng)，用燈光引誘的方法收集剛孵化的脊尾白蝦幼體，經(jīng)計(jì)數(shù)后，隨機(jī)選取20 000尾剛孵化的幼體轉(zhuǎn)入2個(gè)500 L圓形塑料桶中，培養(yǎng)7 d，然后再轉(zhuǎn)入2個(gè)1 000 L圓形塑料桶中，繼續(xù)培育14 d后獲得試驗(yàn)用脊尾白蝦。脊尾白蝦幼體培養(yǎng)條件為溫度（26±1） ℃，鹽度25±1，溶解氧（7.8±0.5） mg/L，pH 8.1±0.2，餌料主要為剛孵化的豐年蟲無節(jié)幼體，每天投喂4次。每天換水量為50%，并及時(shí)清理殘餌、糞便和死蝦等污染物。

1.2脊尾白蝦褐藻寡糖添加飼料的制備

選取粒徑0.8 mm不含褐藻寡糖的南美白對蝦配合飼料（南通海大生物科技有限公司產(chǎn)品）作為基礎(chǔ)飼料，其主要營養(yǎng)成分為粗蛋白質(zhì)42.67%、粗脂肪6.15%、鈣2.27%、磷1.59%、鹽分1.18%、賴氨酸2.45%、蛋氨酸0.71%和蘇氨酸1.66%等。將0 g、0.5 g、1.0 g和2.0 g的褐藻寡糖分別充分溶于150 ml超純水中，然后分別與999.9 g、999.4 g、998.9 g和997.9 g基礎(chǔ)飼料充分混合，再用溶解有0.1 g水產(chǎn)專用黏合劑的100 ml水溶液進(jìn)行充分黏合，制備成0 mg/kg、500 mg/kg、1 000 mg/kg和2 000 mg/kg 4個(gè)不同褐藻寡糖添加量的試驗(yàn)用飼料，-20 ℃冷凍保存，使用期限為30 d。

1.3不同含量褐藻寡糖添加飼料的投喂試驗(yàn)

選取規(guī)格大小基本一致培育21 d的仔蝦，從中隨機(jī)挑選30尾，再隨機(jī)分為3組，每組10尾，經(jīng)吸水紙充分擦干體表水分后，用千分之一的天平稱量每組蝦的質(zhì)量，再計(jì)算平均每尾蝦的初始質(zhì)量。

從上述挑選的規(guī)格一致的蝦中隨機(jī)選取200尾蝦，放入500 L圓柱形塑料桶中。試驗(yàn)分為飼料中0 mg/kg褐藻寡糖處理即對照（CK）、500 mg/kg褐藻寡糖處理（T1）、1 000 mg/kg褐藻寡糖處理（T2）和2 000 mg/kg褐藻寡糖處理（T3）4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3桶為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。飼養(yǎng)條件為溫度（25±1） ℃，鹽度25±1，溶解氧（7.8±0.5） mg/L，pH 8.1±0.2，早6點(diǎn)、晚6點(diǎn)各投喂1次，每天及時(shí)調(diào)整投喂量，以保證所有蝦均處于飽食狀態(tài)，期間每日換水30%～50%，及時(shí)清理殘餌、糞便和死蝦等污染物，試驗(yàn)周期持續(xù)60 d。

1.4生長參數(shù)測定

統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)桶中存活蝦的個(gè)數(shù)。從各試驗(yàn)桶中隨機(jī)挑選30尾存活蝦，立即放在冰水中麻醉，用吸水紙充分擦干體表水分后，稱量每尾蝦的質(zhì)量，計(jì)算各試驗(yàn)組平均每尾蝦的最終質(zhì)量。存活率（SR）、特定生長率（SGR）和總質(zhì)量增長率（TWG）計(jì)算公式如下：

SR=Nt/N0×100%

SGR=（lnWt-lnW0）/t×100%

TWG=（TWt-TW0）/ TW0×100%

式中，Nt表示試驗(yàn)結(jié)束時(shí)試驗(yàn)蝦存活數(shù)量；N0表示試驗(yàn)開始時(shí)試驗(yàn)蝦存活數(shù)量；Wt表示試驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦的質(zhì)量；W0表示試驗(yàn)開始時(shí)蝦的質(zhì)量；t表示試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間；TWt表示試驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦的總質(zhì)量；TW0表示試驗(yàn)開始時(shí)蝦的總質(zhì)量。

1.5試驗(yàn)樣品采集

從各試驗(yàn)桶中隨機(jī)挑選1尾蝦，經(jīng)冰水麻醉后，取其肝胰腺、肌肉、腸和鰓用2.5%戊二醛（電鏡專用）固定后，用于后續(xù)透射電鏡觀察。

從各試驗(yàn)桶中隨機(jī)挑選5尾活蝦，經(jīng)冰水麻醉后，用酒精棉球擦拭體表，取其肝胰腺和肌肉分別混合，迅速置于液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)測定相關(guān)免疫酶活性。再從各試驗(yàn)桶中隨機(jī)挑選5尾活蝦，經(jīng)冰水麻醉后，用酒精棉球擦拭體表，取其肝胰腺和肌肉分別混合，迅速置于液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)測定相關(guān)免疫基因表達(dá)情況。

1.6透射電鏡觀察

取經(jīng)2.5%戊二醛（電鏡專用）固定的各試驗(yàn)組脊尾白蝦肝胰腺、肌肉、腸和鰓組織樣品，磷酸漂洗液漂洗3次，1%鋨酸4 ℃固定2 h；ddH2O漂洗3次后，分別用濃度梯度為30%、50%、70%、80%、95%、100%的乙醇溶液脫水2次，每次15 min，在環(huán)氧丙烷中過渡，812樹脂梯度滲透后包埋，60 ℃聚合，包埋塊用Leica UC7型超薄切片機(jī)進(jìn)行半薄定位及超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色切片，用透射電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)。

1.7免疫酶活性測定

取肝胰腺和肌肉樣品分別稱質(zhì)量，按照1∶9 （g/ml）的比例加入經(jīng)4 ℃過夜預(yù)冷的0.86%生理鹽水，高速振蕩研磨制備10%組織勻漿液，將制備好的勻漿液于4 ℃、2 000 r/min條件下離心15 min，取上清液置于冰上，先測定總蛋白質(zhì)（TP）含量，然后用0.86%生理鹽水稀釋至適宜的濃度后，根據(jù)各酶活性檢測試劑盒說明書中的方法測定脊尾白蝦肝胰腺和肌肉中的SOD、PO、ACP、AKP和LZM活性。

1.8免疫基因表達(dá)量測定

使用Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司產(chǎn)品），根據(jù)說明書中的方法分別提取脊尾白蝦肝胰腺和肌肉中的總RNA，用安捷倫2100微量紫外分光光度計(jì)（美國Agilent Technologies公司產(chǎn)品）和瓊脂糖凝膠電泳（無RNA酶）評估RNA質(zhì)量。使用Oligo（dT）磁珠富集mRNA，用裂解緩沖液裂解mRNA，隨后使用Prime Script RT reagent Kit（中國TaKaRa公司產(chǎn)品）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

以脊尾白蝦18S rRNA作為內(nèi)參，檢測8個(gè)脊尾白蝦免疫相關(guān)基因的表達(dá)量，引物采用AlleleID軟件（v 6.0）設(shè)計(jì)，所檢測基因及引物序列如表1所示。

使用TBGreen Premix Ex Taq TM試劑盒（中國TaKaRa公司產(chǎn)品），按照說明書中的方法進(jìn)行定量分析，基因相對表達(dá)量采用2-△△Ct方法表示。

1.9二尖梅奇酵母MQ2101攻毒試驗(yàn)

從上述各試驗(yàn)桶中隨機(jī)挑選20尾存活蝦分別轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好的100 L圓形塑料桶中，穩(wěn)定2 d，穩(wěn)定條件為溫度由（25±1） ℃逐步降至（18±1） ℃并保持，鹽度25±1，溶解氧（7.8±0.5） mg/L，pH 8.1±0.2。管理方法同材料與方法1.3中的方法。

攻毒開始前MQ2101先在PDA平板上活化3次，再接種于PDB培養(yǎng)基中，于搖床中28 ℃、150 r/min培養(yǎng)36 h，在4 ℃，3 000 r/min的條件下離心5 min，棄上清，用無菌生理鹽水重懸清洗3次，經(jīng)計(jì)數(shù)后用無菌生理鹽水稀釋至1.0×106 CFU/ml，獲得菌體使用液。每只蝦肌肉注射10 μl MQ2101菌液。注射后正常飼養(yǎng)，并觀察各組中蝦的狀態(tài)，及時(shí)撈出死蝦，統(tǒng)計(jì)7 d攻毒存活率。

1.10數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3），試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 8.1、GraphPad Prism 8和SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)組間差異，P＜0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1生長表現(xiàn)

各處理脊尾白蝦生長性能如表2所示，T2處理脊尾白蝦終末體質(zhì)量、總質(zhì)量增長率、特定生長率均極顯著高于CK（P＜0.01）。T3處理脊尾白蝦存活率極顯著高于CK及其他處理（P＜0.01）。說明飼料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖對脊尾白蝦的生長性能具有顯著增強(qiáng)效果，而2 000 mg/kg 褐藻寡糖的添加可以顯著提高脊尾白蝦存活率。

2.2透射電鏡觀察結(jié)果

通過透射電鏡觀察各處理脊尾白蝦不同組織超微結(jié)構(gòu)變化情況，結(jié)果如圖1所示，各處理脊尾白蝦肝胰腺中細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰、無明顯的空泡和病變；肌肉中肌纖維完整呈彎曲狀、無斷裂和溶解現(xiàn)象；腸中腸絨毛清晰可見、排列緊密，腸壁中細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰、無明顯病變；鰓中鰓軸和鰓絲完整、細(xì)胞排列整齊，無破裂現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器清晰。說明CK和T1、T2、T3處理脊尾白蝦各組織超微結(jié)構(gòu)基本一致，即在本試驗(yàn)添加量下褐藻寡糖對脊尾白蝦是安全且無毒副作用的。

2.3免疫酶活性

如圖2所示，T2和T3處理脊尾白蝦肝胰腺中SOD活性極顯著高于CK（P＜0.01），T1處理脊尾白蝦肝胰腺中SOD活性顯著高于CK（P＜0.05）；T3處理脊尾白蝦肌肉中SOD活性極顯著高于CK（P＜0.01），T1和T2處理脊尾白蝦肌肉中SOD活性顯著高于CK（P＜0.05），說明3種添加量的褐藻寡糖對脊尾白蝦肝胰腺和肌肉中SOD活性起到增強(qiáng)的效果。如圖3所示，T1、T2和T3處理脊尾白蝦肝胰腺中ACP活性極顯著高于CK（P＜0.01）；T2和T3處理脊尾白蝦肌肉中ACP活性極顯著高于CK（P＜0.01），T1處理脊尾白蝦肌肉中ACP活性顯著高于CK（P＜0.05），說明3種添加量的褐藻寡糖對脊尾白蝦肝胰腺和肌肉中ACP活性起到增強(qiáng)的效果。圖4結(jié)果顯示，T2處理脊尾白蝦肝胰腺中AKP活性顯著高于CK（P＜0.05），T1和T3處理脊尾白蝦肝胰腺中AKP活性與CK無顯著性差異（P>0.05）；T2和T3處理脊尾白蝦肌肉中AKP活性極顯著高于CK（P＜0.01），T1處理脊尾白蝦肌肉中AKP活性顯著高于CK（P＜0.05），說明飼料中添加褐藻寡糖對脊尾白蝦AKP活性可以起到增強(qiáng)效果，但這種增強(qiáng)效果存在組織間差異性。圖5結(jié)果顯示，T1、T2和T3處理對脊尾白蝦LZM活性不具有增強(qiáng)效果。圖6結(jié)果表示，T2和T3處理脊尾白蝦肝胰腺中PO活性極顯著高于CK（P＜0.01）；T3處理脊尾白蝦肌肉中PO活性極顯著高于CK（P＜0.01），說明提高飼料中褐藻寡糖含量可以顯著提高脊尾白蝦PO的活性。

2.4免疫基因相對表達(dá)量

脊尾白蝦肝胰腺和肌肉中各免疫基因表達(dá)檢出結(jié)果如表3所示，ALF基因在2種組織中均未表達(dá)，SOD、proPO、LZM、CTSB和CTL基因在2種組織中均表達(dá)，LGBP、SR僅在肝胰腺中表達(dá)，說明這些免疫基因在不同組織中的表達(dá)存在差異。

如圖7所示，T2處理脊尾白蝦肝胰腺中SOD基因的相對表達(dá)量極顯著高于CK（P＜0.01），T3處理肝胰腺中SOD基因的相對表達(dá)量顯著高于CK（P＜0.05），說明飼料中添加褐藻寡糖可以提高脊尾白蝦的抗氧化能力。圖8結(jié)果顯示，T1和T2處理肝胰腺中proPO基因的相對表達(dá)量與CK無顯著差異（P>0.05），而T3處理肝胰腺中proPO基因的相對表達(dá)量顯著高于CK（P＜0.05），說明飼料中添加褐藻寡糖可以提高脊尾白蝦proPO基因的表達(dá)量，提高其機(jī)體免疫能力，但可能存在一定的劑量依賴性。圖9、圖10和圖11結(jié)果顯示，T1、T2和T3處理脊尾白蝦肝胰腺中LZM、SR、CTSB基因以及肌肉中CTSB基因的相對表達(dá)量與CK無顯著差異（P>0.05），說明飼料中3種含量褐藻寡糖的添加對脊尾白蝦中LZM、SR、CTSB這3個(gè)免疫基因的表達(dá)不具有增強(qiáng)效果。圖12結(jié)果顯示，T1、T2處理肝胰腺中LGBP基因的相對表達(dá)量極顯著高于CK（P＜0.01），T3處理肝胰腺中LGBP基因的相對表達(dá)量顯著高于CK（P＜0.05），說明飼料中添加褐藻寡糖可以提高脊尾白蝦LGBP基因的表達(dá)量，提高其機(jī)體免疫能力。圖13顯示T1處理肝胰腺中CTL基因的相對表達(dá)量極顯著高于CK（P＜0.01）、T2和T3處理肝胰腺中CTL基因的相對表達(dá)量顯著高于CK（P＜0.05），肌肉中CTL基因的相對表達(dá)量與CK均無顯著差異（P>0.05），說明飼料中添加褐藻寡糖可以提高CTL的表達(dá)量，但可能存在組織差異性。

2.5二尖梅奇酵母攻毒試驗(yàn)結(jié)果

各處理脊尾白蝦人工注射二尖梅奇酵母MQ2101后脊尾白蝦的存活率如圖14所示，試驗(yàn)結(jié)果顯示，CK的脊尾白蝦感染后1 d就開始出現(xiàn)死亡，此時(shí)T1、T2和T3處理的脊尾白蝦幾乎無死亡。各處理的脊尾白蝦感染后2 d均出現(xiàn)死亡，且此時(shí)脊尾白蝦攝食減少、活力減弱。感染3～5 d，T1、T2和T3處理的脊尾白蝦存活率均顯著高于CK（P＜0.05），且CK在第3 d死亡率達(dá)到50%，而T1、T2和T3處理的脊尾白蝦在第5 d死亡率才達(dá)到50%；第6～7 d各處理的脊尾白蝦存活率無顯著差異（P>0.05），第7 d CK和各處理存活率均接近10%。說明飼料中添加褐藻寡糖可以短期內(nèi)提高脊尾白蝦對MQ2101的抗性，但不能提高感染后的最終存活率。

3討論

3.1飼料中添加褐藻寡糖對脊尾白蝦生長的影響

飼料中添加適量的褐藻寡糖對水產(chǎn)動物的腸道具有很好的調(diào)節(jié)作用，有助于其生長性能的提高。Hu等[17]發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖可以顯著提高草魚的存活率、增質(zhì)量率和特異生長率。Yang等[16]的研究結(jié)果也表明飼料中添加褐藻寡糖可以顯著提高草魚的生長性能，但這種作用存在劑量依賴性。Ashouri等[22]發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖可以顯著提高尖嘴鱸魚（Lates calcarifer）體內(nèi)胰蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶的活性，這說明飼料中添加褐藻寡糖可以提高尖嘴鱸魚的消化能力，對其生長性能的提高是有意義的。潘金露等[23]研究結(jié)果也表明飼料中添加褐藻寡糖可以提高大菱鲆脂肪酶的活性。而霍圃宇等[19]發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖對大菱鲆幼魚的生長無顯著提高效果。本研究T2處理脊尾白蝦的終末質(zhì)量、總質(zhì)量增長率和特定生長率極顯著高于CK（P＜0.01），說明飼料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖對脊尾白蝦生長性能具有顯著提高作用；而T3處理脊尾白蝦生長性能與CK無顯著差異（P>0.05），但存活率極顯著高于CK（P＜0.01），說明飼料中添加2 000 mg/kg褐藻寡糖對脊尾白蝦的生長可能不具有調(diào)節(jié)作用，但可以提高蝦體對外界環(huán)境變化的抵抗力。

3.2飼料中添加褐藻寡糖對脊尾白蝦免疫酶活性的影響

病原侵入后會導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），造成蛋白質(zhì)等生物大分子損傷，引起生理機(jī)能的改變[24]。甲殼動物的抗氧化防御系統(tǒng)酶能夠清除機(jī)體內(nèi)過量的活性氧，從而維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)[25]。SOD是甲殼動物抗氧化防御系統(tǒng)酶中重要的成員之一，在清除多余的氧自由基與防止細(xì)胞損傷方面起著重要作用，是衡量甲殼類動物抗氧化系統(tǒng)狀況的重要指標(biāo)[26]。AKP和ACP都是巨噬細(xì)胞溶酶體的重要組成部分，在機(jī)體免疫方面起到重要作用，其活力水平常被作為評價(jià)甲殼類動物健康水平的重要指標(biāo)[27]。ACP在酸性條件下能破壞表面帶有的磷酸酯異物，并通過修飾外源性病原表面的分子結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)機(jī)體對其識別效應(yīng)，促進(jìn)吞噬細(xì)胞發(fā)揮作用[28]。AKP能夠調(diào)節(jié)機(jī)體鈣磷平衡，參與機(jī)體免疫應(yīng)答、角蛋白分泌等生物進(jìn)程[29]。LZM又稱胞壁質(zhì)酶，是一種堿性酶，能夠水解細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵，致使細(xì)胞壁破裂、細(xì)菌溶解[30-31]，常被用作甲殼類動物免疫能力檢測指標(biāo)[32]。proPO系統(tǒng)是甲殼類動物體內(nèi)重要的免疫系統(tǒng)，其主要存在于血細(xì)胞的半顆粒及顆粒細(xì)胞中[33]，當(dāng)機(jī)體受到病原侵染時(shí)，半顆粒細(xì)胞能夠識別外源性微生物的多糖分子并與之結(jié)合來激活系統(tǒng)，將非活化的酚氧化酶原轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨腜O，最終形成黑色素參與免疫反應(yīng)[34-36]。Hu等[17]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖可以顯著提高草魚體內(nèi)SOD、POD、GSH-Px和谷胱甘肽還原酶（GR）等抗氧化酶和LZM、AKP等免疫酶活性。Ashouri等[22]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖可以顯著提高尖嘴鱸魚肝臟中抗氧化水平。Wang等[37]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖對刺參中LZM、POD和ACP等免疫相關(guān)酶活性具有顯著增強(qiáng)效果。Yang等[16]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖可以顯著提高草魚的抗氧化水平。杜以帥[38]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖可以顯著提高刺參體腔液和體壁組織中LZM、ACP、AKP和溶血素的活性?；羝杂畹萚19]的研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖可以增強(qiáng)大菱鲆幼魚體內(nèi)SOD、ACP和AKP活性。江曉路等[21]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖可以提高刺參體腔液和體壁中POD、ACP、AKP和LZM的活性，但體壁中的增幅要小于體腔液中的增幅。本研究條件下，飼料中添加褐藻寡糖后脊尾白蝦體內(nèi)SOD的活性較CK顯著增強(qiáng)，說明飼料中添加褐藻寡糖能夠增強(qiáng)其體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)的水平，提高其在外界病原入侵時(shí)對ROS清除的能力，減少機(jī)體可能受到的損傷。相較于CK，T2處理脊尾白蝦肝胰腺中SOD活性、肝胰腺和肌肉中ACP活性、肝胰腺和肌肉中AKP活性、肝胰腺中PO活性均極顯著提高（P＜0.01）?？偟膩碚f，飼料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖對脊尾白蝦的抗氧化水平和免疫酶活性提升效果最為顯著。

3.3飼料中添加褐藻寡糖對脊尾白蝦免疫基因表達(dá)的影響

SOD基因編碼的蛋白質(zhì)是抵御ROS誘導(dǎo)損害的第一道防線，同時(shí)也是抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分[39]。在環(huán)境脅迫等條件下，SOD將O2-轉(zhuǎn)化為分子氧或歧化H2O2以清除應(yīng)激誘導(dǎo)的過量ROS，從而保護(hù)組織和細(xì)胞免受氧化損傷[40]。proPO系統(tǒng)是甲殼動物體液免疫的重要組成部分，主要參與抵御病原體的免疫過程[41]。LZM是一種重要的非特異性免疫因子，通過殺死細(xì)菌以防止細(xì)菌感染[42]，還能誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)其他免疫因子的合成和分泌[43-44]。LGBP是一種重要的模式識別受體，通過激活先天免疫防御在無脊椎動物中發(fā)揮重要作用[45]。LGBP具有促進(jìn)血淋巴細(xì)胞的吞噬、黑化、包囊、凝集等作用，還可以激活proPO級聯(lián)反應(yīng)，清除入侵微生物[46]。SR由骨髓細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）和某些內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，是一種大型的膜結(jié)合受體超家族，配體廣泛[47]，且能與細(xì)菌和凋亡細(xì)胞結(jié)合并內(nèi)吞[48]。Qin等[49]利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）被副溶血弧菌感染后，血淋巴中SR的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，敲除該基因后發(fā)現(xiàn)蝦體抗菌能力顯著降低，表明SR在先天免疫中起重要作用。CTSB是一種蛋白質(zhì)水解酶，以酶原形式存在于溶酶體中，具有水解多種蛋白質(zhì)的功能[50]，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[51-52]。CTL是Ca2+依賴性碳水化合物識別蛋白的一大家族[53]，是甲殼類動物中一種具有識別病原體特殊糖識別結(jié)構(gòu)域的模式受體[54-55]，具有細(xì)胞黏附、細(xì)菌清除、吞噬和proPO激活等功能[56-57]。Thaimuangphol等[58]對感染嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的仙蝦（Streptocephalus sirindhornae）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，感染組的CTL表達(dá)量是對照組的3倍，說明其在機(jī)體的先天免疫中扮演重要角色。Hu等[17]發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖可以顯著提高草魚體內(nèi)白介素-10、白介素-1β、白介素-8和腫瘤壞死因子-α的基因表達(dá)水平。Ashouri等[22]發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖可以提高尖嘴鱸魚體內(nèi)c和g型溶菌酶基因的表達(dá)水平。本研究中T1處理LGBP基因在脊尾白蝦肝胰腺中相對表達(dá)量極顯著高于CK（P＜0.01），T2處理SOD、LGBP基因在脊尾白蝦肝胰腺中相對表達(dá)量均極顯著高于CK（P＜0.01），各處理LZM、SR和CTSB基因在脊尾白蝦肝胰腺中相對表達(dá)量與CK均無顯著差異（P>0.05）。雖然CTSB基因和CTL基因在脊尾白蝦肌肉中可以被檢測出，但相對表達(dá)量與CK均無顯著差異（P>0.05）?？偟膩碚f，飼料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖可以提高脊尾白蝦體內(nèi)部分抗氧化和免疫相關(guān)基因的表達(dá)量，提高脊尾白蝦的抗氧化水平和免疫能力，這一結(jié)果與上述酶活性結(jié)果一致。

3.4飼料中添加褐藻寡糖對脊尾白蝦抗二尖梅奇酵母MQ2101能力的影響

Hu等[17]發(fā)現(xiàn)飼料中添加褐藻寡糖增強(qiáng)了草魚的免疫能力，并提高了草魚對嗜水氣單胞菌的抗性。本研究中，二尖梅奇酵母MQ2101攻毒感染后，飼料中添加褐藻寡糖的脊尾白蝦存活率在第3～5 d均極顯著高于CK（P＜0.01），且各組達(dá)到半數(shù)死亡率的時(shí)間也遲于CK，說明飼料中添加褐藻寡糖對脊尾白蝦抵抗二尖梅奇酵母MQ2101的能力具有一定的提高作用，這與上述其對脊尾白蝦抗氧化和免疫能力的增強(qiáng)作用一致。感染6～7 d時(shí)，飼料中添加褐藻寡糖的脊尾白蝦存活率和CK幾乎一致，均接近10%，說明隨著病原菌在脊尾白蝦體內(nèi)的大量增殖，突破其免疫調(diào)節(jié)能力范疇后，飼料中添加褐藻寡糖也無法使脊尾白蝦長期存活。

綜上所述，飼料中添加1 000 mg/kg褐藻寡糖對脊尾白蝦的生長性能和免疫能力具有提高效果，且無毒副作用，對二尖梅奇酵母MQ2101具有一定的防控作用。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）

收稿日期：2023-03-07

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項(xiàng)目（PZCZ201747）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（22）3083]；江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項(xiàng)目[JBGS（2021）122]；江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目[JATS（2022）419、JATS（2022）164]

作者簡介：史文軍（1987-），男，安徽壽縣人，博士，副研究員，主要從事海水蝦類品種選育和綠色健康養(yǎng)殖研究。（E-mail）muzhiye080326@126.com

通訊作者：萬夕和，（E-mail）wxh1708@163.com；秦松，（E-mail）sqin@yic.ac.cn