摘要：［目的］本研究旨在通過(guò)對(duì)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）經(jīng)連續(xù)傳代后的毒株（PEDV-BJ-150）進(jìn)行全面研究，探究其生物學(xué)特性、遺傳變異、致病能力和細(xì)胞適應(yīng)性，以評(píng)估其作為潛在減毒疫苗株的潛力。［方法］通過(guò)對(duì)PEDV-BJ-150 和原始PEDV-BJ-01 毒株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物感染試驗(yàn)和基因組測(cè)序，評(píng)估其在不同細(xì)胞系中的增殖能力、病毒滴度、致病性以及基因組的核苷酸序列變異并利用動(dòng)物模型評(píng)估其感染特性和病理變化。［結(jié)果］PEDV-BJ-150 經(jīng)連續(xù)傳代后在Vero-M 細(xì)胞中表現(xiàn)出更高的增殖能力和滴度，尤其在懸浮適應(yīng)株Vero-M 和貼壁適應(yīng)株Vero-M 中表現(xiàn)出顯著的滴度差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其在體內(nèi)感染后的致病性降低，尤其在肺部未檢測(cè)到病毒存在，鼻翼和小腸部位顯示更高的病毒滴度。此外，基因組測(cè)序結(jié)果表明PEDV-BJ-150 的S 蛋白存在多個(gè)位置的氨基酸突變，可能影響其細(xì)胞嗜性和致病能力。［結(jié)論］本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)連續(xù)傳代的PEDV-BJ-150 在體內(nèi)表現(xiàn)出的毒力和致病能力明顯降低，表明其有作為減毒疫苗株的潛力。特別是S 蛋白中的連續(xù)性氨基酸缺失可能導(dǎo)致病毒致病性降低，這為疫苗研發(fā)提供了新的思路。此外，研究發(fā)現(xiàn)不同組織對(duì)PEDV 的感染特性不同，這對(duì)于深入了解病毒傳播機(jī)制具有重要意義。本研究的創(chuàng)新之處在于發(fā)現(xiàn)了PEDV 經(jīng)連續(xù)傳代后的致病性變化和S 蛋白突變對(duì)病毒特性的影響，為病毒進(jìn)化和疫苗設(shè)計(jì)提供了新的見(jiàn)解。這項(xiàng)研究為了解PEDV 的病毒學(xué)特性和毒力變化提供了重要線索，對(duì)于病毒疫苗研發(fā)和應(yīng)對(duì)疫情具有潛在的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：豬流行腹瀉病毒； 減毒突變株； 動(dòng)力學(xué)特征； 基因組分析

中圖分類號(hào)：S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-8151（2024）02-0080-10

豬流行性腹瀉（PED）是豬急性和高度傳染性的腸道疾病，其由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起，其廣泛傳播嚴(yán)重影響著全球養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益［1-2］。該疾病的主要特征包括乳豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水、食欲不振、體重下降以及高死亡率［2-4］。盡管臨床上大部分豬流行性腹瀉病毒感染多出現(xiàn)在夏季和冬季，但偶爾也可能在春季發(fā)生［5］。值得注意的是，在仔豬中發(fā)生的豬流行性腹瀉病毒感染常伴有極高的死亡率［6-7］。

PEDV 屬于Nidovirales 目、冠狀病毒科和Al?pha 冠狀病毒屬，為一種單股正鏈RNA 病毒［8］。PEDV 的基因組長(zhǎng)度約為28 kb 核苷酸（nts），在其兩端具有5 ′-帽和3 ′-聚腺苷尾；其基因組還包括5 ′和3 ′非翻譯區(qū)域（UTR），至少有7 個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF1a、ORF1b 和ORF2-6）［9-11］。ORF1a 和ORF1b 分別編碼復(fù)制酶多蛋白1a 和1ab，這些蛋白經(jīng)病毒蛋白酶自體蛋白水解形成16 種非結(jié)構(gòu)蛋白（Nspl-16），這些酶參與病毒RNA 的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制［12-13］。而ORF2-6 主要編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白（刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N），以及輔助蛋白ORF3；這些蛋白在基因組中按照以下順序排列：5 ′-ORF（la/lb）-S-ORF3-EM-N-3 ′［13-15］。

1978 年，于比利時(shí)首次發(fā)現(xiàn)PEDV 毒株CV777［16-17］。2010 年11 月，中國(guó)境內(nèi)發(fā)現(xiàn)1 種高致病性PEDV 毒株，在隨后幾個(gè)月內(nèi)快速傳播至全國(guó)各地［3， 18］。這一變種隨后在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)，并傳播至加拿大、墨西哥等地，同時(shí)迅速在亞洲多個(gè)國(guó)家傳播，給這些地區(qū)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［19-21］。

疫苗接種被認(rèn)為是預(yù)防豬場(chǎng)PEDV 感染的有效方法［22］。針對(duì)經(jīng)典PEDV 毒株，如CV777、DR13 和KPEDV-9，已開(kāi)發(fā)出多種減毒活化和滅活疫苗，并在許多國(guó)家成功上市。然而，在病毒快速傳播的過(guò)程中，毒株不斷變異，導(dǎo)致疫苗株與流行株之間存在抗原和遺傳差異［23-25］。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)針對(duì)新變異株的新型PEDV 疫苗。

本研究通過(guò)將分離的PEDV G2 毒株在Vero-M 細(xì)胞中進(jìn)行連續(xù)傳代，獲得了1 株突變毒株，并確定了該毒株在不同細(xì)胞系中的生物學(xué)特性。此外，使用5 日齡的仔豬評(píng)估了這些毒株的致病性。隨后利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代后的PEDV-BJ-01 株進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定。最終，我們獲得了1 株安全的減毒PEDV 毒株，旨在為制備減毒疫苗提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1. 1 細(xì)胞和病毒培養(yǎng)

懸浮適應(yīng)株Vero-M 在VP-SFM AGT?培養(yǎng)基中培養(yǎng)；懸浮適應(yīng)株ST 在DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37 ℃、5% CO2、140 r·min-1 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁適應(yīng)株Vero-M 和貼壁細(xì)胞株ST，在補(bǔ)充有7% 胎牛血清的低葡萄糖的Dul?becco 改良杜爾貝科培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2 的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以上細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

PEDV G2 毒株P(guān)EDV-BJ-01 之前由本實(shí)驗(yàn)室于病料組織中分離，測(cè)序比對(duì)后確定為FJzz1 毒株（GenBank：MK288006）。將分離獲得的FJzz1毒株接種在單層Vero-M 細(xì)胞上，連續(xù)傳代3 次。當(dāng)發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清液，并將其命名為PEDV-BJ-01。隨后在Vero-M細(xì)胞上盲傳150 代，收集盲傳后病毒液。收集病毒儲(chǔ)液，分裝儲(chǔ)存在?80 ℃冰箱中，將該毒株命名為PEDV-BJ-150。

針對(duì)PEDV N 基因設(shè)計(jì)如下引物，

正向引物PED-N-F（5 ′-TGCGGTTCTCACAGATAGTG）和反向引物PED-N-R（5 ′-AAGTCGCTAGAAAAACACTCAGTAAT）。

將以上引物用于RT-PCR。檢測(cè)病毒是否存在，并在確認(rèn)后測(cè)定收集到的病毒液的病毒滴度。

1. 2 PEDV 毒株在Vero-M 細(xì)胞中的連續(xù)傳代

將Vero-M 細(xì)胞在T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至60%～70% 匯合度。將PEDV 毒株原液稀釋在含有10 g·mL-1胰蛋白酶的2 mL 無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基中，隨后使用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗2 次單層培養(yǎng)的Vero-M 細(xì)胞。將病毒液感染Vero-M細(xì)胞，病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）為0. 01，每隔15 min 震蕩混勻，孵育1 h 后，棄去病毒溶液，使用PBS 洗滌細(xì)胞培養(yǎng)瓶2 次，加入含有5 g·mL-1 胰蛋白酶的DMEM 培養(yǎng)基5 mL。隨后置于37℃、5% CO2 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生可見(jiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）時(shí)，凍融裂解感染的細(xì)胞，并在4 ℃下以3000×g 離心1 min 以收獲培養(yǎng)液上清。然后將收集的病毒液以同樣的方式繼續(xù)接種Vero-M細(xì)胞，直到第150 次傳代結(jié)束。

1. 3 PEDV 復(fù)制動(dòng)力學(xué)測(cè)定

使用含有10 μg·mL-1 胰蛋白酶的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基將懸浮適應(yīng)株Vero-M 和懸浮適應(yīng)株ST 傳代至無(wú)菌細(xì)胞搖瓶中，細(xì)胞密度105 Cells·mL-1，體積30 mL。以病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）為0. 01 分別接種2 種病毒。放置于140 r·min-1、37 ℃、5% CO2 溫箱中培養(yǎng)，分別于病毒感染后24、48、72、96 h 共4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，測(cè)定病毒滴度。

將貼壁Vero-M、ST 細(xì)胞均勻鋪至48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80% 匯合度時(shí)，以多重感染復(fù)數(shù)（MOI）為0. 01 分別接種2 種病毒。

將病毒和細(xì)胞在37 ℃、5% CO2 的溫箱中吸附1 h后，棄去病毒液，每孔加入500 μL 無(wú)菌PBS 清洗2 次，每孔加入含有10 μg·mL-1 胰蛋白酶的DMEM 培養(yǎng)基250 μL。

將感染后的細(xì)胞放置于37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)，分別于感染后24、48、72 和96 h，收取細(xì)胞上清液，分別測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒滴度。期間，觀察致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。

1. 4 病毒滴度與拷貝數(shù)的測(cè)定

取正常培養(yǎng)的Vero-M 細(xì)胞，將細(xì)胞按適當(dāng)比例稀釋后均勻鋪至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至匯合度約為70%～80% 左右時(shí)接種病毒。將上述收取的病毒液（細(xì)胞培養(yǎng)上清液）使用含有10 μg·mL-1 胰蛋白酶的接毒培養(yǎng)液作連續(xù)10倍的梯度稀釋，從10-1～10-9 連續(xù)9 個(gè)稀釋度，每組重復(fù)6 次試驗(yàn)。將稀釋好的病毒接種到9 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每1 稀釋度接種1 縱排，共9 孔，每孔接種1 0 0 μL。并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。接毒48 h 后觀察細(xì)胞病變情況并記錄結(jié)果。按Reed-Muench 法計(jì)算結(jié)果。

通過(guò)RT-qPCR 分析病毒顆粒釋放，使用RNA 病毒試劑盒提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）分析。使用靶向PEDV N基因的RT-qPCR 測(cè)定培養(yǎng)液上清中的病毒載量。PEDV 正向引物PEDN-F （5 ′-CGCAAAGACTGAACCCACTAAC-3 ′） ，反向引物PEDN-R（5 ′-TTGCCTCTGTTGTGTTACTTGGAGAT-3 ′）和PEDV 探針（FAM-TGYYACCAYYACCACACGACTCCTGC-BHQ3） ， QuantStudio ? Real-Time PCR 軟件用于數(shù)據(jù)采集和分析。

1. 5 基因組測(cè)序與遺傳變異分析

使用RNAsimple 總RNA 提取試劑盒（DP419）提取，然后使用HiScript II 1st StrandcDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以該cDNA 為模板和16 對(duì)重疊的引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證（補(bǔ)充表S1）。PEDV-BJ-150 變異株的基因組序列采用二代測(cè)序技術(shù)測(cè)定。病毒S 蛋白的氨基酸序列使用MegAlign（DNAStar Laser?gene）中的Clustal W 方法進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)完成后通過(guò)手動(dòng)鑒定基因組序列上的不同毒株之間核苷酸/aa 變化的位置。如前所述。利用MEGA 7. 0將基于PEDV-BJ-150 毒株S 基因的和GenBank中提供的另外50 個(gè)具有完整S 基因序列的參考毒株，采用鄰域連接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1. 6 毒株的致病性評(píng)價(jià)

選取15 頭體重相仿的5 d 齡仔豬，隨機(jī)分配為3 組，分為A 組、B 組和C 組。每組飼養(yǎng)在1 個(gè)單獨(dú)的房間。A 組和B 組的試驗(yàn)動(dòng)物分別滴鼻感染PEDV-BJ-01 毒株和PEDV-BJ-150 毒株，劑量為104 TCID50。C 組給予等量生理鹽水滴鼻。

在試驗(yàn)過(guò)程中，每天監(jiān)測(cè)和記錄臨床癥狀，包括精神狀況和體重的變化。病毒感染后第3 和5天對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物實(shí)行安樂(lè)死，收集鼻甲骨、肺部、小腸樣品。將部分收集樣品低溫研磨后12 000 r·min-1 離心，檢測(cè)組織上清液的病毒滴度含量。

1. 7 組織病理學(xué)和HE 染色分析

在實(shí)驗(yàn)中，首先收集小腸腸段并將其在10%福爾馬林中室溫固定36 h。隨后，制備石蠟包埋的組織樣本，完成后進(jìn)行切割、脫蠟、再水化處理。最后，采用標(biāo)準(zhǔn)的蘇木精和伊紅（Hamp;E）染色方法對(duì)樣本進(jìn)行染色，然后進(jìn)行掃描切片分析［26］。這些步驟用于準(zhǔn)備和分析小腸腸段的組織樣本。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Origin2018 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。使用t 檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，當(dāng)Plt;0. 05 時(shí)，認(rèn)為差異是顯著的。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PEDV-BJ-150 毒株在連續(xù)傳代后的生物學(xué)特性

將PEDV-BJ-01 毒株和PEDV-BJ-150 毒株分別以多重感染復(fù)數(shù)（MOI）0. 01 接種懸浮適應(yīng)株Vero-M、貼壁適應(yīng)株Vero-M、懸浮適應(yīng)株ST、貼壁細(xì)胞株ST 共4 種細(xì)胞。定時(shí)取樣以分析體外連續(xù)傳代過(guò)程后其生物學(xué)特性的變化。

結(jié)果如圖1 所示，當(dāng)不同的細(xì)胞系感染2 種毒株時(shí)，2 株毒株沒(méi)有呈現(xiàn)顯著的拷貝數(shù)差異，僅在感染后的部分時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨后基于病毒滴度（TCID50）的多步生長(zhǎng)動(dòng)力曲線如圖2 所示。當(dāng)細(xì)胞感染兩種毒株后，懸浮適應(yīng)株Vero-M、貼壁適應(yīng)株Vero-M、懸浮適應(yīng)株ST 在感染后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)明顯的病毒滴度差異。在ST 貼壁細(xì)胞系中2 株毒株的病毒滴度差異較小。2 株毒株在懸浮適應(yīng)株Vero-M 和貼壁適應(yīng)株Vero-M 中病毒滴度差異最高。病毒滴度的最大差距約為103。

PEDV-BJ-150 和PEDV-BJ-01 毒株在懸浮適應(yīng)株ST 中滴度差異較小，病毒滴度的最大差距約102 左右。而在貼壁細(xì)胞株ST 中病毒滴度差異相較于其它3 株細(xì)胞系，其各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度的差距最小。

總之，這些結(jié)果表明PEDV-BJ-150 毒株相比PEDV-BJ-01 毒株在懸浮適應(yīng)株Vero-M、貼壁適應(yīng)株Vero-M 中的敏感性和適應(yīng)性在體外連續(xù)傳代過(guò)程中明顯更強(qiáng)。并且PEDV-BJ-150 毒株對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞系敏感程度更高。

2. 2 PEDV-BJ-150 的遺傳變異分析

為了進(jìn)一步分析突變株病毒的遺傳變異，在MegAlign 軟件中使用Clustal W 對(duì)這些變異的全基因組序列進(jìn)行了比對(duì)。結(jié)果如圖3 表明，相較于PEDV-BJ-01，PEDV-BJ-150 變異株在S 蛋白上有14 個(gè)位置的氨基酸發(fā)生改變。在其它結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白部分也有不同程度的突變。PEDVBJ-150 突變株中S 蛋白的氨基酸變化分散在S1和S2 亞基中。

為了探究PEDV-BJ-150 變異株在連續(xù)傳代過(guò)程后的氨基酸變異，構(gòu)建了PEDV-BJ-01 和PEDV-BJ-150 中翻譯出的S 糖蛋白氨基酸的序列比對(duì)。如圖4 顯示，在體外連續(xù)傳代后，高傳代PEDV-BJ-150 突變株在S1-NTD 區(qū)域表現(xiàn)出特

征性的連續(xù)aa 缺失（55I56G57E → 55△56△57△）這與Chen 等［27］的研究結(jié)果相似。并且在144-145處也發(fā)現(xiàn)了氨基酸的缺失（144T145G→144△145△）。在877-878 位氨基酸也發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的改變（877V878L→877R878R）。

在其它位置14、223、265、490、710、773、820、1120、1212、1338、1353 也發(fā)現(xiàn)了氨基酸的突變，但這些變化對(duì)于病毒的增殖和致病能力的影響仍有待研究。

此外，基于PEDV-BJ-150 突變株的S 基因和另外50 個(gè)參考毒株構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，GenBank中提供了完整的基因序列。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，PEDV-BJ-150 毒株和50 株參考菌株形成2 個(gè)基因型：G1 基因型主要包含CV777 和DR13 等經(jīng)典菌株，而G2 基因型包含PEDV-BJ-150 株和其它變異大流行菌株。

2. 3 感染PEDV 突變毒株仔豬的臨床體征

為了評(píng)估PEDV-BJ-150 變異毒株的毒力是否發(fā)生變化，并分析突變毒株與原始毒株在5 d 齡仔豬體內(nèi)的致病能力，分別接種了這2 株毒株到試驗(yàn)組A 和試驗(yàn)組B 中，并監(jiān)測(cè)了仔豬每日的體重變化。在接種前，3 組動(dòng)物的體重差異沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。但在病毒接種后，A 組的仔豬體重增長(zhǎng)速度較慢。相比之下，B 組的大多數(shù)動(dòng)物保持了相對(duì)穩(wěn)定的體重，盡管與對(duì)照組相比仍然存在一定程度的下降。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，未觀察到任何仔豬死亡的情況。正如圖5A 所示，PEDVBJ-150 株對(duì)仔豬體重的影響較PEDV-BJ-01 株更小。這些結(jié)果表明，PEDV-BJ-150 株在5 d 齡仔豬中具有一定毒性，但在體外連續(xù)傳代后，其致病能力明顯減弱。

2. 4 腸道和肺部不同病毒株的病毒滴度

2 株毒株感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，對(duì)收集的樣本檢測(cè)病毒滴度，如圖5B 和5C 顯示，PEDV-BJ-150 與PEDV-BJ-01 在鼻甲骨和小腸組織感染第3 天和第5 天存在一定的滴度差異。而在肺部組織樣本2株毒株在不同時(shí)間點(diǎn)均沒(méi)有檢測(cè)病毒滴度的存在。當(dāng)感染3 d 后，PEDV-BJ-150 株在小腸部位的滴度約為105. 4TCID50，相應(yīng)PEDV-BJ-01 株滴度約為103. 5TCID50，二者統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。而在感染第5 天，2 株毒株的病毒滴度均有不同程度的下降，二者差異約為10 倍。而在鼻翼部位，感染3d 后，兩株毒株的病毒滴度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有趣的是，當(dāng)感染第5 天后，2 株毒株的病毒滴度在鼻翼部位產(chǎn)生了統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，2 株毒株產(chǎn)生了約10 倍的滴度差異。這可能是由于2 株毒株在不同感染部位滴度衰減速度不同導(dǎo)致的。當(dāng)對(duì)肺部樣本的病毒滴度進(jìn)行測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)在感染后3 d 和5 d，2 株病毒均沒(méi)有檢測(cè)到病毒滴度。

這些結(jié)果表明，雖然實(shí)驗(yàn)采取滴鼻感染兩株毒株，但肺部沒(méi)有檢測(cè)到病毒滴度的存在。這些結(jié)果表明，PEDV-BJ-150 株在仔豬體內(nèi)的增殖能力高于PEDV-BJ-01 株；并且滴鼻也是PEDV 的一種有效感染方式。

2. 5 感染PEDV-BJ-150 變異株的仔豬組織病理學(xué)病變

進(jìn)行病理學(xué)和組織學(xué)檢查，系統(tǒng)、直觀地評(píng)價(jià)經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代后的PEDV-BJ-01 和PEDV-BJ-150 毒株的致病性。如圖6 所示，2 株毒株感染均引起小腸的病理變化。其特征是腸壁變薄，腸腔內(nèi)有淡黃色液體存在。相比之下，PEDV-BJ-01感染組相比PEDV-BJ-150 毒株顯示出更強(qiáng)的病理變化。HE 染色顯示，PEDV-BJ-01 感染組在小腸段引起較為嚴(yán)重的組織病理學(xué)病變，其特征是腸黏膜結(jié)構(gòu)崩解，溶解消失，僅殘留結(jié)締組織和壞死的細(xì)胞碎片，黏膜下水腫。在PEDV-BJ-150 感染組中，小腸也檢測(cè)到了組織病理學(xué)病變，但其病變程度略低于PEDV-BJ-01 感染組，其特征為腸黏膜固有層水腫，伴有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)變性，壞死等變化。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)變性，壞死等變化，黏膜下層及肌層均未見(jiàn)明顯異常變化。

綜上所述，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代后的PEDV-BJ-150毒株的致病性低于PEDV-BJ-01。

3 討論

PEDV 的爆發(fā)給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，疫苗接種是應(yīng)對(duì)病毒傳播的有效方法，然而由于PEDV 在傳播過(guò)程中極易發(fā)生氨基酸突變，造成經(jīng)典減毒疫苗不能提供有效的免疫保護(hù)［28-29］。因此，必須加快對(duì)該病毒流行毒株的研究進(jìn)度，以制備新的減毒疫苗株。在世界各地，許多研究人員通過(guò)在Vero 細(xì)胞中連續(xù)傳代經(jīng)典PEDV 毒株，從而人為產(chǎn)生減毒疫苗株［30-32］。在本研究中，原始的PEDV 毒株在經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代后發(fā)生大量突變，尤其在其S 蛋白基因中有14 個(gè)位置的氨基酸發(fā)生了改變，這些位置氨基酸的改變可能導(dǎo)致病毒滴度和致病能力發(fā)生了明顯改變。與最初分離的PEDV-BJ-01 毒株相比，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代的PEDV-BJ-150 毒株在懸浮適應(yīng)株Vero-M、貼壁適應(yīng)株Vero-M 和懸浮適應(yīng)株ST 中有著滴度差異，滴度差異在102～103 左右（圖2）。并且研究顯示，PEDV-BJ-150 毒株在Vero-M 細(xì)胞中有著更為迅速的擴(kuò)增能力，更快的達(dá)到病毒滴度的峰值。

之后，為了評(píng)估經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代后的PEDV 在體內(nèi)的致病能力和毒力，分別將PEDV-BJ-01 和PEDV-BJ-150 毒株感染仔豬。結(jié)果顯示PEDVBJ-150 毒株對(duì)于體重的影響能力弱于PEDV-BJ-01 毒株（圖5A）。其次，通過(guò)測(cè)定PEDV-BJ-150和PEDV-BJ-01 毒株在鼻翼、肺部和小腸的滴度。結(jié)果顯示，PEDV-BJ-150 毒株在鼻翼和小腸部位有著更高的病毒滴度（圖5B 和5C），而在肺部，均沒(méi)有檢測(cè)到病毒的存在。

另一方面結(jié)果顯示，接種PEDV-BJ-150 毒株的臨床體征和組織病理學(xué)病變程度較輕，表明PEDV-BJ-150 毒株在體內(nèi)的致病能力更弱（圖6）。

因此，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為通過(guò)在細(xì)胞上對(duì)PEDV 的連續(xù)傳代，導(dǎo)致了PEDV-BJ-150 毒株在Vero-M 細(xì)胞系上的增殖能力和病毒滴度有著明顯提高，并且能夠降低PEDV 在體內(nèi)感染后的嚴(yán)重程度和病毒致病力。

對(duì)PEDV-BJ-01 和PEDV-BJ-150 毒株的全部基因組進(jìn)行了測(cè)序，以進(jìn)一步評(píng)估毒力變化。測(cè)序結(jié)果顯示在其S 蛋白的多個(gè)位置發(fā)生了氨基酸的改變，這些位置的改變可能共同改變了PEDV 的細(xì)胞嗜性和毒力［27，33］。在毒株S 蛋白的其它位置發(fā)生的氨基酸的改變對(duì)于毒株的影響還需驗(yàn)證。總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，PEDV 毒株的細(xì)胞嗜性和毒力是基因組中多個(gè)核苷酸突變組合的結(jié)果，并且可以通過(guò)多種分子機(jī)制發(fā)生。

PEDV 的S 蛋白一直被視為病毒變異的標(biāo)志［34-35］。S 蛋白在接受免疫壓力時(shí)很容易變異。S蛋白中的突變（包括缺失和/或插入）可能會(huì)改變冠狀病毒的致病性和組織嗜性［36-38］。與PEDVBJ-01 毒株相比，PEDV-BJ-150 毒株的S 基因中發(fā)生了大量的核苷酸突變和缺失。我們發(fā)現(xiàn)PEDV-BJ-150 毒株的S 蛋白序列中存在3 個(gè)位置的特征性氨基酸突變（圖4）（55I56G57E→55△56△ 57 △ ，144T145G→144 △ 145 △ 和877V878L→877R878R），懷疑S 基因的這些突變可能與病毒致病性有關(guān)。

之前的研究稱，口服途徑為PEDV 的主要感染途徑［39-40］。病毒可以通過(guò)口腔直接進(jìn)入腸道，腸道蛋白酶可能幫助病毒在腸道釋放［41］。最近的一項(xiàng)研究表明，PEDV 病毒可以被鼻上皮細(xì)胞的DC細(xì)胞識(shí)別和呈遞，然后輸送到頸部淋巴結(jié)的CD3T細(xì)胞，通過(guò)血液和淋巴循環(huán)到達(dá)腸道，感染腸上皮細(xì)胞［41-42］。本試驗(yàn)通過(guò)將PEDV 滴鼻感染5 d 齡仔豬，但在感染后測(cè)定試驗(yàn)動(dòng)物各部位的病毒滴度時(shí)，未在肺部檢測(cè)到病毒滴度的存在，而在腸道等部位檢測(cè)到了病毒的存在。這印證了之前的結(jié)論，鼻部也可以作為PEDV 的感染途徑，也印證了PEDV 對(duì)于不同組織有著不同的嗜性，但具體的分子機(jī)制尚未闡明［43-45］。

在這項(xiàng)研究中，PEDV-BJ-150 毒株在Vero-M 和ST 細(xì)胞中傳代時(shí)表現(xiàn)出不同的滴度變化情況。這一結(jié)果表明，PEDV 病毒的細(xì)胞適應(yīng)性在不同的細(xì)胞系中存在差異，并且顯示出懸浮適應(yīng)細(xì)胞株對(duì)于毒株的敏感程度更高。對(duì)于經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代的PEDV 在不同細(xì)胞系中的細(xì)胞嗜性，這種不同敏感程度的機(jī)制尚不清楚，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證PEDV 病毒核苷酸序列改變對(duì)細(xì)胞嗜性的影響。

總的來(lái)說(shuō)，本研究報(bào)告了PEDV 病毒經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代后，毒力和致病能力都發(fā)生了明顯的改變。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代后的PEDV-BJ-150 毒株是安全的，并且有可能作為制備減毒疫苗的候選毒株。

4 結(jié)論

綜上所述，在本項(xiàng)研究中通過(guò)對(duì)毒株在Vero-M 細(xì)胞中連續(xù)傳代后獲得了一株細(xì)胞適應(yīng)性更好、滴度更高的PEDV 減毒毒株。并且在感染懸浮適應(yīng)株的細(xì)胞系后病毒毒價(jià)更高。我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEDV-BJ-150 毒株的致病性降低，感染該毒株后，所有試驗(yàn)動(dòng)物均沒(méi)有死亡。并且說(shuō)明滴鼻感染可能也是PEDV 的一種感染方式。此外，全基因組分析的結(jié)果顯示PEDV-BJ-150 毒株中的氨基酸突變，這可能有助于病毒毒力減弱。因此，減毒菌株可能適用于疫苗制備。

補(bǔ)充表S1 見(jiàn)知網(wǎng)。

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（編輯：呂俊俐）