摘要：［目的］生物病害侵蝕露天石質(zhì)文物，使其發(fā)生表面變色及風(fēng)化等不可逆變化。龍門(mén)石窟是世界上造像最多、規(guī)模最大的石刻藝術(shù)寶庫(kù)，敬善寺區(qū)域是龍門(mén)石窟的重要組成部分，了解該區(qū)域石質(zhì)文物的生物病害情況，對(duì)石質(zhì)文物保護(hù)及病害防治措施的提出具有重要意義。［方法］本研究對(duì)該區(qū)域31 個(gè)樣點(diǎn)石質(zhì)文物的生物病害進(jìn)行樣品采集?；谛螒B(tài)觀察，結(jié)合ITS、16S rDNA 特征片段的測(cè)序分析，對(duì)生物病害物種地衣、微型真菌、細(xì)菌、苔蘚和藻類(lèi)等進(jìn)行鑒定；對(duì)受生物侵蝕的文物本體通過(guò)掃描電鏡進(jìn)行形貌觀察；采用薄層層析法檢測(cè)地衣體中的化學(xué)酸，結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定地衣和由生物結(jié)皮狀復(fù)合物與沉積物中分離真菌的化學(xué)酸含量。［結(jié)果］形態(tài)觀察和高通量測(cè)序結(jié)果顯示，龍門(mén)石窟敬善寺區(qū)域內(nèi)生物病害種類(lèi)主要為地衣、苔蘚、藻類(lèi)、真菌和細(xì)菌，其中地衣7 種，苔蘚3 種，藻類(lèi)1 種，真菌20種，可培養(yǎng)細(xì)菌7 種，主要包括藍(lán)細(xì)菌和放線(xiàn)菌門(mén)等，高通量測(cè)序結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果具有高度一致性和互補(bǔ)性。掃描電鏡觀察到不同侵害生物對(duì)石質(zhì)文物的侵蝕深度不同，其中非地衣型真菌菌絲深入巖石深度可達(dá)100 μm。調(diào)查區(qū)域內(nèi)常見(jiàn)、具明顯特征結(jié)構(gòu)且覆蓋度較大的主要生物病害為地衣和苔蘚，其中中華石果衣（Endocarpon sinense）最為明顯；同時(shí)地衣和真菌樣品中可檢測(cè)到檸檬酸，琥珀酸、草酸，乳酸、富馬酸等有機(jī)酸。［結(jié)論］本研究首次較為系統(tǒng)地調(diào)查了龍門(mén)石窟敬善寺區(qū)域石質(zhì)文物生物病害的物種和分布，從細(xì)胞侵入和有機(jī)酸產(chǎn)生2 方面分析了其中代表性生物產(chǎn)生的病害及程度；生物病害的發(fā)育與石窟所處環(huán)境密切相關(guān)，研究結(jié)果為石窟微環(huán)境控制和石質(zhì)文物生物病害防治提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：龍門(mén)石窟； 石質(zhì)文物； 中華石果衣； 地衣； 苔蘚； 有機(jī)酸

中圖分類(lèi)號(hào)：S182；K879.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-8151（2024）02-0119-11

文物是人類(lèi)歷史發(fā)展過(guò)程中遺留下來(lái)的具有歷史、文化及科學(xué)價(jià)值的實(shí)物。其中不可移動(dòng)的石質(zhì)文物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)石質(zhì)文物）如：石窟、石雕、巖畫(huà)等，因其歷史悠久，分布范圍廣泛，具有重要的歷史與科學(xué)價(jià)值，為研究古代文明提供了完善的實(shí)物資料［1］。石質(zhì)文物往往由于體量較大，不宜整體進(jìn)行移動(dòng)，因此隨著環(huán)境條件的復(fù)雜多變，會(huì)遭受各種因素引發(fā)的破壞，生物病害即是其中最為常見(jiàn)的一類(lèi)［2］。可引發(fā)石質(zhì)文物生物病害的如細(xì)菌、藻類(lèi)、真菌和地衣等生命體，它們?cè)谑|(zhì)文物表面及其裂隙中繁衍生長(zhǎng)，掩蓋石刻精美紋飾，導(dǎo)致石質(zhì)文物表面變色及表層風(fēng)化等不可逆變化［2-4］。

龍門(mén)石窟是全國(guó)重點(diǎn)文物保護(hù)單位，世界文化遺產(chǎn)，是具有極高藝術(shù)價(jià)值和歷史價(jià)值的中國(guó)皇家石窟，被聯(lián)合國(guó)教科文組織評(píng)價(jià)為：“ 龍門(mén)石窟是中國(guó)北魏晚期至唐代（公元493 年～907 年）期間，最具規(guī)模和最為優(yōu)秀的造型藝術(shù)，代表了中國(guó)石刻藝術(shù)的最高峰?！本瓷扑聟^(qū)域作為龍門(mén)石窟重要的組成部分，共有編號(hào)洞窟97 個(gè)，包括由唐太宗李世民之妃韋氏出資營(yíng)造的皇家洞窟敬善寺、對(duì)我國(guó)早期佛教傳播影響深遠(yuǎn)的21 個(gè)優(yōu)填王造像龕［5］、龍門(mén)石窟刻有《金剛經(jīng)》的3 處洞窟之一429窟等。敬善寺區(qū)域坡面徑流造成地表水無(wú)序排放，洞窟存在不同程度滲漏現(xiàn)象，生物病害發(fā)育，對(duì)石窟寺的安全保存不利。研究引發(fā)石窟寺生物病害的物種類(lèi)型，揭示其對(duì)石窟文物的侵蝕機(jī)理，從而實(shí)施針對(duì)性的保護(hù)，對(duì)石窟寺保護(hù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。國(guó)際上對(duì)石質(zhì)文物生物病害尤其微生物病害的研究已有一個(gè)多世紀(jì)，在微生物多樣性、生態(tài)功能、退化機(jī)理及防治技術(shù)等方面取得了較大進(jìn)展。我國(guó)近年來(lái)對(duì)包括龍門(mén)石窟［6］、云岡石窟［7］、樂(lè)山大佛［8］、麥積山石窟［9］等石質(zhì)文物的微生物病害開(kāi)展了一定的研究，但研究主要集中在對(duì)砂巖質(zhì)文物生物病害種類(lèi)、侵蝕機(jī)理方面，對(duì)石灰?guī)r質(zhì)文物生物病害的研究相對(duì)較少。龍門(mén)石窟對(duì)生物病害的研究主要涉及部分區(qū)域的調(diào)查和腐蝕機(jī)理的探討［10］，未涉及敬善寺區(qū)域，亟需借助新型多學(xué)科手段進(jìn)一步開(kāi)展研究。

因此，本研究以龍門(mén)石窟敬善寺區(qū)域生物病害調(diào)查為切入點(diǎn)，對(duì)調(diào)查區(qū)域采集到的生物病害樣品進(jìn)行分析，進(jìn)一步揭示生物病害物種種類(lèi)及分布，探究損傷機(jī)理，旨在為后續(xù)的生物病害控制提供依據(jù)，并為石窟寺修復(fù)和減緩生物病害進(jìn)程等方面提供借鑒和參考。

1 材料和方法

1. 1 研究區(qū)域及采樣點(diǎn)

本調(diào)查研究以龍門(mén)石窟西山敬善寺區(qū)域?yàn)檎w，隨機(jī)選取31 個(gè)采樣點(diǎn)（圖1），采樣點(diǎn)類(lèi)型涉及洞窟內(nèi)巖壁與地表、洞窟門(mén)口、洞窟間巖面、佛像表面等，采集樣品的原則為生物病害肉眼可見(jiàn)，即已明顯引發(fā)石窟表面顏色變化或直接可見(jiàn)生物體（個(gè)體或群體）。

1. 2 試劑材料

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSA，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、孟加拉紅培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、PCR 試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）、CTAB（純度99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）等。

1. 3 試驗(yàn)方法

1. 3. 1 生物病害樣品采集

采集生物病害樣品共64 份，包含地衣9 份，苔蘚9 份，附著于石窟表面的沉積物9 份，生物結(jié)皮狀復(fù)合物30 份，與石窟具有緊密接觸特征的疑似微型真菌及地衣樣品7 份。采集時(shí)用無(wú)菌手術(shù)刀在石窟表面輕輕刮取，放入無(wú)菌袋或無(wú)菌離心管中，置于盛放干冰的樣品箱中，次日帶回實(shí)驗(yàn)室，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3. 2 微生物分離與純化

稱(chēng)取生物結(jié)皮狀復(fù)合物和沉積物各0. 5 g，移入離心管中與100 μL 無(wú)菌水混合，在離心管內(nèi)用玻璃研磨棒研磨，加入1000 μL 無(wú)菌水混勻，制成1100 μL 混合溶液。從中吸取100 μL，分別滴加在PDA、TSA 與孟加拉紅培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基2 個(gè)重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，長(zhǎng)出菌落后用劃線(xiàn)法純化，直至出現(xiàn)單菌落，取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。

1. 3. 3 DNA 提取、測(cè)序和片段分析

DNA 提取采用改良CTAB 法［11］。真菌擴(kuò)增ITS 片段，細(xì)菌擴(kuò)增16SrDNA 片段。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ L ：DNA 2 μL ，2×Taq PCR Mas?terMix 13 μL ，上下游引物各1 μL（表1），超純水8 μL 。真菌DNA 擴(kuò)增的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸72 s，33 個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸2 min；細(xì)菌DNA 擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1. 5 min，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，委托北京天一輝遠(yuǎn)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 3. 4 系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI 網(wǎng)站下載參考序列，與本研究所獲得的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并選擇合適的外群，利用BioEdit v. 7. 0. 5［12］ 中的ClustalW MultipleAlignment［13］進(jìn)行序列比對(duì)。對(duì)單基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行最大似然法［14］分析，使用在線(xiàn)網(wǎng)站Cipres ScienceGateway （http：//www. phylo. org）中的RAxMLHPC v. 8. 2. 6［15］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，運(yùn)算方法選擇GTR+I+G 模型，每個(gè)節(jié)點(diǎn)假設(shè)1000 次重復(fù)來(lái)評(píng)價(jià)自展值，得到的樹(shù)文件用FigTreeV. 1. 4. 2 查看和編輯，自展支持值（Bootstrap support values）≥75% 的分枝具有可信度。

1. 3. 5 物種鑒定

地衣物種鑒定基于形態(tài)學(xué)觀察和ITS 片段分析；苔蘚物種鑒定及由生物結(jié)皮狀復(fù)合物和沉積物中分離培養(yǎng)出的真菌物種鑒定基于形態(tài)學(xué)觀察；生物結(jié)皮狀復(fù)合物和沉積物高通量測(cè)序的物種鑒定基于USEARCH 方法，對(duì)各樣品的Effec?tive Tags 進(jìn)行聚類(lèi)，將序列相似性達(dá)到97% 的序列聚類(lèi)成1 個(gè)OTU，OTU 即分類(lèi)操作單元（Op?erational Taxonomic Unit）。

1. 3. 6 生物病害程度檢測(cè)

利用掃描電子顯微鏡（Hitachi SU8010）對(duì)部分代表微生物侵蝕文物本體的情況進(jìn)行了形貌觀察。利用薄層層析方法［19-21］檢測(cè)地衣體中的化學(xué)酸。利用高效液相色譜法測(cè)定地衣和由生物結(jié)皮狀復(fù)合物與沉積物中分離培養(yǎng)出的真菌中化學(xué)酸的含量。色譜條件為：XSelect HSS T3 色譜柱（250 mm×4. 6 mm，5 μm，Waters 公司，美國(guó)），流動(dòng)相為20 mmol·L-1磷酸水溶液，流速1. 0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

2 結(jié)果與分析

2. 1 微生物在內(nèi)的生物病害種類(lèi)組成

本研究調(diào)查的龍門(mén)石窟敬善寺區(qū)域內(nèi)的生物病害由地衣、微型真菌、細(xì)菌、苔蘚和藻類(lèi)組成（表2～表3）。其中最具明顯個(gè)體結(jié)構(gòu)特征的為地衣和苔蘚，經(jīng)鑒定確認(rèn)地衣7 種，隸屬于子囊菌門(mén)（Ascomycota）3 綱（茶漬綱Lecanoromycetes，異極衣綱Lichinomycetes 和散囊菌綱Eurotiomycetes）3目（黃枝衣目Teloschistales，異極衣目Lichinales 和瓶口衣目Verrucariales）3 科（黃枝衣科Teloschista?ceae，異極衣科Lichinaceae 和瓶口衣科Verrucaria?ceae）3 屬；苔蘚4 種，隸屬于真蘚門(mén)（Bryophyta）真蘚綱（Bryopsida）叢蘚目（Pottiales）叢蘚科（Pottia?ceae）4 屬。

從生物群體構(gòu)成的結(jié)皮狀復(fù)合物和沉積物中分離培養(yǎng)出綠藻、微型真菌和細(xì)菌，其中：綠藻共1目（膠毛藻目Chaetophorales）；微型真菌20 種，隸屬于子囊菌門(mén)3 綱（座囊菌綱Dothideomycetes，散囊菌綱Eurotiomycetes，糞殼菌綱Sordariomyce?tes）5 目（煤炱目Capnodiales，散囊菌目Eurotiales，肉座菌目Hypocreales，格孢腔菌目Pleosporales，糞殼菌目Sordariales）8 科（格孢腔菌科Pleospora?ceae，曲霉科Aspergillaceae，枝孢霉科Cladosporia?ceae，毛殼科Chaetomiaceae，麥角菌科Clavicipita?ceae，Neopyrenochaetaceae，線(xiàn)蟲(chóng)草科Ophiocordy?cipitaceae，球腔菌科Phaeosphaeriaceae）11 屬；細(xì)菌包括藍(lán)細(xì)菌門(mén)共3 目（擬色球藻目Chroococcidiop?sidales， 念珠藻目Nostocales， 顫藻目Oscillatoria?les）4 科（擬色球藻科Chroococcidiopsidaceae， 微鞘藻科Microcoleaceae，念珠藻科Nostocaceae，偽枝藻科Scytonemataceae）；細(xì)菌門(mén)2 目（腸桿菌目En?terobacterales，芽孢桿菌目Bacillales）2 科（腸桿菌科Enterobacteriaceae，芽孢桿菌科Bacillaceae），放線(xiàn)菌門(mén)1 目（小單孢菌目Micromonosporales）1 科（小單孢菌科Micromonosporaceae）。通過(guò)高通量測(cè)序復(fù)合物和沉積物中未檢測(cè)到綠藻，但檢測(cè)到了大量微型真菌和細(xì)菌，檢測(cè)到的真菌占比最大的為子囊菌門(mén)，種類(lèi)組成與上述培養(yǎng)結(jié)果具有高度一致性（表3）；檢測(cè)到的細(xì)菌多樣性相比培養(yǎng)方法更強(qiáng)，包括變形菌門(mén)（Proteobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、黏球菌門(mén)（Myxococcota）、芽單孢菌門(mén)（Gemmatimon?adetes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、Patescibacte?ria、厚壁菌門(mén)（Firmicutes），另外還包括古菌中的泉古菌門(mén)（Crenarchaeota）。高通量測(cè)序結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果具有互補(bǔ)性，完整地反映了結(jié)皮狀的復(fù)合物和沉積物中的生物組成（表3）。

2. 2 微生物在內(nèi)的生物病害物種主要分布情況

在采樣區(qū)域內(nèi)（圖1）采集到的不同種類(lèi)生物病害樣品分布情況為：9 份具明顯結(jié)構(gòu)特征的地衣分布于敬善寺區(qū)域的303～306 窟之間的巖面、331～307 窟之間巖表的裂隙、415～414 窟之間的分界石以及摩崖三佛龕南側(cè)壁面。

9 份苔蘚分布于443 窟的洞口，307 窟南造像底部裂隙處、332 窟南壁、403 窟洞口南側(cè)底部和413 窟南壁。

9 份沉積物分布于284～260 窟之間、289 窟、284 窟壁面、305 窟、362 窟北壁、363 窟、403 窟、443窟內(nèi)壁面和445 窟地面。

7 份待進(jìn)一步確定的微型真菌和地衣分布于286 窟下側(cè)、288 窟南側(cè)、292 窟、440 窟壁面、445 窟和303 窟和306 窟之間的巖面。

30 份生物結(jié)皮復(fù)合物分布于261 窟造像周邊、285 窟～260 窟之間、288 窟內(nèi)正壁造像下地面、443窟內(nèi)壁面、437 窟造像底部和墻壁、439 窟地面和壁面上、445 窟壁面、地面和水道處、307 窟內(nèi)南側(cè)造像底部、332 窟造像右臂處、362 窟窟口、404 窟窟口、416 窟地面、418 窟內(nèi)壁、419 窟壁面、422 窟北側(cè)、摩崖三佛龕地面、摩崖三佛龕最南側(cè)造像水溝內(nèi)、摩崖三佛龕說(shuō)明牌旁地面、摩崖三佛龕主佛上。

調(diào)查顯示主要生物病害為地衣和苔蘚，原因?yàn)槠湓谡{(diào)查區(qū)域內(nèi)常見(jiàn)，具明顯特征結(jié)構(gòu)，且蓋度較大。

2. 3 代表生物病害的致害程度檢測(cè)

本研究選擇了6 份具代表性的微生物和植物病害樣品，包括地衣、微型真菌和綠藻，因?yàn)榈匾率怯烧婢驮孱?lèi)或藍(lán)細(xì)菌組成的聯(lián)合共生體，也是調(diào)查區(qū)域內(nèi)常見(jiàn)的生物病害。從外部形態(tài)觀察，這些生物樣品與石窟接觸緊密。對(duì)這6 份樣品進(jìn)行掃描電鏡觀察，檢測(cè)其對(duì)石窟巖石的侵蝕程度（圖2、圖3），結(jié)果表明位于采樣點(diǎn)4（286 窟）石窟表面的地衣（樣品號(hào)20200206），其菌絲進(jìn)入白云巖巖石內(nèi)部約50 μm，菌絲與淺表層巖石顆粒之間發(fā)生接觸，且出現(xiàn)纏繞現(xiàn)象，證明存在侵蝕；圖2C 和2D 顯示：位于采樣點(diǎn)8（292 窟）石窟的地衣（樣品號(hào)20200215）在白云巖上未深入內(nèi)部，但可見(jiàn)菌絲與接觸的巖石顆粒有相互作用，推測(cè)其有潛在侵蝕作用；圖2E 和2F 顯示：位于采樣點(diǎn)14（445 窟）石窟的非地衣型真菌（樣品號(hào)20200241）的菌絲與白云巖淺表層的巖石顆粒有接觸，伴有菌絲相互纏繞現(xiàn)象，深入巖石內(nèi)部約100 μm，說(shuō)明其對(duì)巖石有明顯的侵蝕作用。

圖3A 和3B 顯示，位于采樣點(diǎn)13（440 窟）石窟表面附著物的綠藻（樣品號(hào)20200240），藻細(xì)胞深入至白云巖巖石內(nèi)部50 μm 處，與巖石顆粒有相互接觸，兩者之間接觸的緊密程度較高，推斷該附著物對(duì)巖石的侵蝕作用較為明顯；圖3C 和3D 顯示，位于采樣點(diǎn)14（445 窟）石窟的非地衣型真菌（樣品號(hào)20200245）僅限于表面而未深入巖石內(nèi)部，但與巖石顆粒有相互接觸，推測(cè)其對(duì)巖石仍存在侵蝕作用；圖3E 和3F 顯示，位于采樣點(diǎn)16（洞窟303 和洞窟306 之間）石窟的中華石果衣Endocarpon si?nense（樣品號(hào)20200249）中的菌絲不僅與巖石表面有緊密接觸，而且可見(jiàn)已延伸至巖石內(nèi)部，與巖石顆粒有相互接觸，推測(cè)對(duì)巖石有一定侵蝕作用。

生物侵蝕的產(chǎn)生原因除了物理作用，也與化學(xué)作用有很大關(guān)系［22-23］?；瘜W(xué)作用一般利用生物產(chǎn)生的有機(jī)酸等化合物，使石窟表面發(fā)生層狀片狀剝落、風(fēng)化裂隙等病害。高效液相色譜系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示（表4），在8 份地衣樣品中，石果衣En?docarpon pusillum（樣品號(hào)20200254）、石果衣En?docarpon sp.（樣品號(hào)20200255）和麗石黃衣Xan?thoria elegans（樣品號(hào)20200272）含有檸檬酸；地衣待定物種（樣品號(hào)20200273、20200291、20200293）和黑邊石果衣Endocarpon nigromarginatum（樣品號(hào)20200294）含有琥珀酸；黑邊石果衣Endocar?pon nigromarginatum（樣品號(hào)20200296）含有乳酸和琥珀酸。對(duì)從生物結(jié)皮復(fù)合物中分離培養(yǎng)出的5 種非地衣型真菌進(jìn)行液體培養(yǎng)后，極細(xì)枝孢Cladosporium tenuissimum（樣品號(hào)20200202）含有檸檬酸，淡紫擬青霉Purpureocillium lilacinum（樣品號(hào)20200231）、聚多曲霉Aspergillus sydowii（樣品號(hào)20200226）、葡萄汁曲霉Aspergillus uvarum（樣品號(hào)20200274）和桔青霉Penicillium citrinum"（樣品號(hào)20200284）含有2～3 種以上的有機(jī)酸。

3 討論

龍門(mén)石窟敬善寺區(qū)域的生物病害種類(lèi)多樣，其中主要的生物病害如地衣對(duì)石窟的侵蝕既有物理作用，又有化學(xué)作用。本研究選擇了包括地衣在內(nèi)的6 份與石窟相關(guān)且連帶巖石的生物樣品進(jìn)行了掃描電鏡觀察（圖2、圖3），發(fā)現(xiàn)不同生物對(duì)石窟巖石的侵害深度不同，真菌菌絲或藻細(xì)胞通過(guò)石窟巖石紋理由巖石表面的間隙向巖石內(nèi)部滲透，在濕度影響下發(fā)生膨脹或收縮，使文物表面出現(xiàn)碎裂、剝落、空鼓以及崩解等現(xiàn)象。石窟碎裂同時(shí)也伴隨著化學(xué)作用，對(duì)地衣以及生物結(jié)皮復(fù)合物中的真菌檢測(cè)結(jié)果顯示，它們至少能分泌1 種有機(jī)酸，且呼吸產(chǎn)生的CO2等氣體與巖石發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，加速對(duì)石窟的腐蝕過(guò)程。地衣是由真菌和藻類(lèi)或藍(lán)細(xì)菌組成的共生聯(lián)合體［24-25］，被稱(chēng)為先鋒生物，因地衣重要的生物學(xué)特性之一即為風(fēng)化巖石，助力原始土壤的形成［22，26］。但因?yàn)榈匾戮哂胁煌纳L(zhǎng)型，其含有的有機(jī)酸種類(lèi)也不盡相同，因此石質(zhì)文物上生長(zhǎng)的不同種類(lèi)的地衣致害程度也不完全相同，這也是本研究對(duì)不同地衣樣品以及代表性的真菌和藻類(lèi)樣品通過(guò)掃描電鏡觀察和高效液相色譜法進(jìn)行化學(xué)酸檢測(cè)的原因，以期通過(guò)藻細(xì)胞、真菌菌絲細(xì)胞在巖石上向下生長(zhǎng)的深度以及地衣和真菌產(chǎn)生的有機(jī)酸情況進(jìn)行綜合判斷。

在本研究調(diào)查的敬善寺區(qū)域中，還鑒定出4 種苔蘚，分別為灰土對(duì)齒蘚、卷葉濕地蘚、銅綠凈口蘚、小扭口蘚，均屬于叢蘚科。這4 種苔蘚的化學(xué)相關(guān)資料欠缺，因此本研究無(wú)法對(duì)其產(chǎn)生的化合物進(jìn)行定向檢測(cè)。已有研究表明苔蘚植物具有多種生物活性，主要含有萜類(lèi)、甾醇、芳香族化合物、黃酮類(lèi)化合物及脂類(lèi)［27-28］。苔蘚植物還可以分泌一些酸性物質(zhì)［29］，溶解巖石中的礦物質(zhì)，降低巖石顆粒之間的凝聚力。據(jù)此推斷敬善寺區(qū)域的4 種苔蘚也具有潛在的化學(xué)侵蝕作用。此推斷基于有關(guān)其它苔蘚的相關(guān)報(bào)道，并結(jié)合了現(xiàn)場(chǎng)觀察。苔蘚與地衣的物理侵蝕作用類(lèi)似，利用假根向石質(zhì)文物內(nèi)部侵蝕，具有很強(qiáng)的侵蝕深度。本研究中苔蘚樣品20200217（灰土對(duì)齒蘚）對(duì)石窟表層巖石具有明顯的侵蝕作用，該苔蘚假根延伸能力較強(qiáng)，與石窟土層形成了高度約38 mm 的蜂窩狀形貌。苔蘚是一類(lèi)不可忽視的石窟常見(jiàn)植物，敬善寺白云巖石質(zhì)的高含鈣量石材能夠?yàn)樘μ\提供適宜的生長(zhǎng)條件，但石窟文物表面苔蘚的研究尚不充足，對(duì)石窟的作用有待深入研究。

龍門(mén)石窟敬善寺調(diào)查區(qū)域的生物病害除了以個(gè)體形式存在的地衣和苔蘚外，還包括以結(jié)皮形式存在的復(fù)合物和沉積物。2 種類(lèi)型的生物病害在石窟的分布情況不同，地衣和苔蘚主要覆蓋在石窟外周的巖面，以結(jié)皮形式存在的復(fù)合物和沉積物主要覆蓋在石窟內(nèi)部的巖壁或地面?；谂囵B(yǎng)和高通量測(cè)序綜合分析，發(fā)現(xiàn)生物結(jié)皮主要由包括藍(lán)細(xì)菌在內(nèi)的細(xì)菌和真菌組成。雖然生物結(jié)皮內(nèi)的細(xì)菌和真菌的生物量相比地衣和苔蘚較小，且與石窟接觸連接不緊密，隨著時(shí)間推移，這些生物群落在石質(zhì)文物上可能會(huì)形成連續(xù)程度不一的生物膜，從而產(chǎn)生生物腐蝕［2］；但最近也有研究指出，以藍(lán)細(xì)菌為主要組分的生物結(jié)皮覆蓋于夯土長(zhǎng)城城墻表面，顯著增強(qiáng)了城墻抗壓強(qiáng)度等系列特性，對(duì)長(zhǎng)城起到了很好的保護(hù)作用［30］。生物結(jié)皮內(nèi)的藍(lán)細(xì)菌屬于自養(yǎng)微生物，兼具固碳和固氮的重要生態(tài)學(xué)功能，可以為生物群落中的異養(yǎng)微生物（如異養(yǎng)細(xì)菌和真菌）提供有機(jī)物質(zhì)，而本研究顯示由生物結(jié)皮中分離培養(yǎng)出的真菌，當(dāng)其大量生長(zhǎng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，因此石質(zhì)文物上的生物結(jié)皮存在危害隱患。

龍門(mén)石窟依山而建，置于戶(hù)外環(huán)境中，因此石窟生物病害受所在周邊環(huán)境的影響，灰塵及植物殘?bào)w在石窟上的堆積會(huì)為生物提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)源從而有助于生物定殖?，F(xiàn)場(chǎng)勘察發(fā)現(xiàn)真菌和藻類(lèi)在石窟內(nèi)外壁面及佛像本身的水跡處更加明顯，加之洞窟內(nèi)地面及角落處存在積水現(xiàn)象，真菌和藻類(lèi)產(chǎn)生的孢子在潮濕的環(huán)境中會(huì)進(jìn)一步定殖在石窟及周邊環(huán)境，加劇石窟的生物病害。

雖然相比石窟風(fēng)化、洞窟滲漏水以及危巖體崩塌病害，生物病害破壞程度看似相對(duì)較小，但在長(zhǎng)期累積效應(yīng)作用下，其對(duì)文物的破壞作用仍不容忽視［3］。

4 結(jié)論

本研究首次較為系統(tǒng)的查明了敬善寺區(qū)域生物病害物種種類(lèi)主要由地衣、苔蘚、藻類(lèi)、真菌和細(xì)菌組成，其中地衣7 種，苔蘚3 種，藻類(lèi)1 種，真菌20 種，可培養(yǎng)細(xì)菌7 種。地衣和苔蘚以個(gè)體形式存在，主要覆蓋于石窟外周巖壁，與巖壁接觸緊密，它們具有明顯特征結(jié)構(gòu)，且蓋度較大，是敬善寺區(qū)域最主要的生物病害，它們對(duì)石窟的侵蝕既有物理作用，又有化學(xué)作用；不同地衣對(duì)石窟巖體的物理侵蝕深度不同，含有的有機(jī)酸種類(lèi)也不盡相同，因此對(duì)石窟造成的損傷亦有不同。藍(lán)細(xì)菌等細(xì)菌、真菌以生物結(jié)皮形式存在，主要覆蓋在石窟內(nèi)部的巖壁或地面，與基物接觸不緊密，雖然生物量低，但由于生物群落穩(wěn)定，隨時(shí)間累積，仍存在危害隱患。生物病害的發(fā)育與石窟所處環(huán)境密切相關(guān)，應(yīng)通過(guò)對(duì)石窟微環(huán)境控制并定期對(duì)生物病害的發(fā)展進(jìn)行監(jiān)測(cè)，有效防治生物病害。

參考文獻(xiàn)

［1］Bar-Oz G， Lev-Yadun S. Paleolithic cave rock art， animal

coloration， and specific animal habitats［J］. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America，

2012， 109（20）： E1212.

［2］Tretiach M， Bertuzzi S， Candotto Carniel F. Heat shock

treatments： a new safe approach against lichen growth on

outdoor stone surfaces ［J］. Environmental Science amp;

Technology， 2012， 46（ 12）： 6851-6859.

［3］魏鑫麗， 蔣淑華， 魏江春. 石質(zhì)文物地衣生物腐蝕及防治的研

究進(jìn)展［J］. 菌物學(xué)報(bào)，2015， 34（5）：863-870.

Wei X L， Jiang S H， Wei J C. Research progress of lichen

biodeterioration and its treatment on stone cultural relics［J］.

Mycosystema， 2015， 34（5）： 863-870.

［4］中華人民共和國(guó)國(guó)家文物局，WW/T002-2007，石質(zhì)文物病害

分類(lèi)與圖示［S］. 北京： 文物出版社，2008：1-13.

National Cultural Heritage Administration. WW/T002-2007，

The classification and symbols for the diseases of ancient stone

objects［S］. Beijing： Cultural Relics， 2008： 1-13.

［5］李文生. 我國(guó)石窟中的優(yōu)填王造像——龍門(mén)石窟優(yōu)填王造像

之早之多為全國(guó)石窟之最［J］. 中原文物， 1985， 4： 102-106.

Li W S. Statues of Udayana in China’s grottoes-there are as

many status of Udayana in Longmen grottoes as there are in

China［J］. Cultural Relics of Central China， 1985，4：102-106.

［6］范子龍. 龍門(mén)石窟微生物病害調(diào)查與腐蝕機(jī)理探討［C］. 中國(guó)

化學(xué)會(huì)，2012.

Fan Z L. Investigation of microbial diseases and discussion of

corrosion mechanism in Longmen Grottoes ［C］. Chinese

Chemical Society， 2012.

［7］顏菲，葛琴雅，李強(qiáng)，等. 云岡石窟石質(zhì)文物表面及周邊巖石樣

品中微生物群落分析［J］. 微生物學(xué)報(bào)， 2012，52（5）：629-636.

Yan F， Ge Q Y， Li Q， et al. Analysis of microbial community

on the surface of the historic stone and nearby rock samples in

Yungang Grottoes［J］. Acta Microbiologica Sinica， 2012， 52

（5）： 629-636.

［8］Bai F Y， Chen X P， Huang J Z， et al. Microbial biofilms on

agiant monolithic statue of Buddha： The symbiosis of

microorganisms and mosses and implications for bioweatherring

［J］. International Biodeterioration amp; Biodegradation， 2021，

156：105106.

［9］Duan Y L， Wu F S，， He D P， et al. Bacterial and fungal

communities in the sandstone biofilms of two famous Buddhist

grottoes in China ［J］. International Biodeterioration amp;

Biodegradation，2021，163：105267.

［10］武發(fā)思，李潔. 石質(zhì)文物微生物研究現(xiàn)狀與展望［J］. 石窟與

土遺址保護(hù)研究，2022，1（4）：14-33.

Wu F S， Li J. The current status and future prospects for

microbial research on stone cultural relics［J］. Research on the

Conservation of Cave Temple and Earthen Sites， 2022， 1（4）：

14-33.

［11］Rogers S O， Bendich A J. Extraction of DNA from plant

tissues［M］//Plant Molecular Biology Manual A6. Boston：

Kluwer Academic Publishers， 1988： 1-10.

［12］Hall T A. BioEdit： a user-friendly biological sequence

alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT

［C］. Nucleic Acids Symposium， 1999. 41（41）： 95-98.

［13］Thompson J D， Higgins D G， Gibson T J. CLUSTAL W：

improving the sensitivity of progressive multiple sequence

alignment through sequence weighting， position-specific gap

penalties and weight matrix choice ［J］. Nucleic Acids

Research， 1994. 22（22）： 4673-4680.

［14］Miller M A， Pfeiffer W T， Schwartz T. Creating the CIPRES

Science Gateway for inference of large phylogenetic trees［C］.

Gateway Computing Environments Workshop （GCE）. New

Orleans LA， USA. IEEE， 2010： 1-8.

［15］Stamatakis A. RAxML version 8： a tool for phylogenetic

analysis and post-analysis of large phylogenies ［J］.

Bioinformatics， 2014， 30（9）： 1312-1313.

［16］White T J， Bruns T， Lee S， et al. Amplification and direct

sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics

［M］//PCR Protocols： a guide to methods and applications.

San Diego： Academic Press. 1990： 315-322.

［17］Gardes M， Brun T D. ITS primers with enhanced specificity

for basidiomycetes - application to the identification of

mycorrhizae and rusts［J］. Molecular Ecology， 1993， 2（2）：

113-118.

［18］Heuer H， Krsek M， Baker P， et al. Analysis of actinomycete

communities by specific amplification of genes encoding 16S

rRNA and gelelectrophoretic separation in denaturing gradients

［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1997， 63（8）：

3233-3241.

［19］Culberson C F， Kristinsson H D. A standardized method for

the identification of lichen products ［J］. Journal of

Chromatography A， 1970， 46： 85-93.

［20］Culberson C F. Improved conditions and new data for

identification of lichen products by standardized thin-layer

chromatographic method［J］. Journal of Chromatography A，

1972， 72（1）： 113-125.

［21］Orange A， James P W， White F J. Microchemical methods for

the identification of lichens ［M］. London： British Lichen

Society， 2001： 1-101.

［22］Chen J， Blume H P， Beyer L. Weathering of rocks induced by

lichen colonization—a review［J］. CATENA， 2000， 39 （2）：

121-146.

［23］Wilson M J. Weathering of rocks by lichens with special

reference to stonework： a review［M］//Stone Deterioration in

Polluted Urban Environments. Boca Raton： CRC Press，

2004： 67-76.

［24］Honegger R. Functional aspects of the lichen symbiosis［J］.

Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular

Biology， 1991， 42： 553-578.

［25］Hawksworth D L， Grube M. Lichens redefined as complex

ecosystems［J］. New Phytologist， 2020， 227（5）： 1281-1283.

［26］Lindsay D C. The role of lichens in Antarctic ecosystems［J］.

The Bryologist， 1978， 81（2）： 268-276.

［27］Asakawa Y. Chemical constituents of the bryophytes［M］//

Progress in the Chemistry of Organic Natural Products.

Vienna： Springer， 1995： 1-562.

［28］吳秀禎， 婁紅祥. 苔蘚植物的化學(xué)生態(tài)學(xué)［J］. 天然產(chǎn)物研究

與開(kāi)發(fā)， 2007， 19（6）： 1073-1078.

Wu X Z， Lou H X. Chemical ecology of bryophytes［J］.

Natural Product Research and Development， 2007， 19（6）：

1073-1078.

［29］劉吉開(kāi)，曾隴梅，吳大剛. 苔蘚植物活性成分研究進(jìn)展［J］. 化

學(xué)通報(bào)， 1993， 56（2）： 1-5.

Liu J K， Zeng L M， Wu D G. Research progress on active

components of bryophytes［J］， Chemistry， 1993， 56（2）：： 1-5.

［30］Cao Y S， Bowker M A， Delgado-Baquerizo M， et al.

Biocrusts protect the Great Wall of China from erosion［J］.

Science Advances， 2023， 9： eadk5892.

（編輯：郭玥微）