黎鳳炎 劉澤峰 夏雨艷 王文娟 李琪 唐利瑕 張國

摘要： 目的 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白激酶RNA樣ER激酶 （PERK） /真核生物翻譯起始因子2α （eIF2α） 信號通路對肝星狀細(xì)胞（HSC） 活化的影響。方法 收集11例肝穿刺病理提示S1～S4肝纖維化患者和9例肝血管瘤、 肝腺瘤患者術(shù)后周圍正常肝組織病理切片， 進(jìn)一步行組織免疫組化檢測PERK、 eIF2α、 C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白 （CHOP） 表達(dá)情況； 使用不同濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素 （0、 125、 250、 500、 1 000 nmol/L） 作用于人HSC-LX2， 使用qRT-PCR檢測PERK mRNA及Western Blot檢測PERK、 肌醇需要酶1（IRE1）、 激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）、 CHOP及α平滑肌肌動蛋白（α-SMA） 表達(dá)水平。使用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建PERK穩(wěn)定過表達(dá)LX-2組及對照組， 并通過qRT-PCR檢測PERK、 eIF2α、 α-SMA mRNA， Western Blot檢測PERK、 p-eIF2α、 α-SMA蛋白表達(dá)， 免疫熒光檢測膠Ⅰ型原蛋白 （COL1A1） 表達(dá)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)， 多組間比較采用單因素方差分析， 進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)； 不符合正態(tài)分布的計(jì)數(shù)資料， 兩組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。結(jié)果 與正常肝組織相比， 肝纖維化患者肝組織中PERK、 eIF2α及CHOP表達(dá)升高， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Z=?3. 56、 t=?5. 75、 Z=?3. 52， P值均<0. 001）。不同濃度毒胡蘿卜素作用后， 與溶媒組相比， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白PERK、 CHOP、 IRE1、 ATF6及α-SMA蛋白表達(dá)顯著升高 （P值均<0. 05）。與對照空載慢病毒組相比， PERK穩(wěn)定過表達(dá)組PERK mRNA、 eIF2α mRNA、 α-SMA mRNA表達(dá)及PERK、 p-eIF2α、 α-SMA蛋白表達(dá)明顯升高 （P值均<0. 05）。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果提示， PERK過表達(dá)組COL1A1表達(dá)升高 （P<0. 05）。結(jié)論 PERK過表達(dá)可誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞α-SMA、 膠原蛋白COL1A1表達(dá)， 提示PERK信號通路可能是HSC活化的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞： ?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； ?真核細(xì)胞起始因子2； ?肝星狀細(xì)胞； ?膠原Ⅰ型

基金項(xiàng)目： ?廣西自然科學(xué)基金 （2023GXNSFBA026056）； ?廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院青年基金 （QN2020-1）

Effect of the protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase pathway in endoplasmic reticulum stress on?hepatic stellate cell activation and collagen type I expression

LI Fengyan ， LIU Zefeng ， XIA Yuyan ， WANG Wenjuan ， LI Qi ， TANG Lixia ， ZHANG Guo .

（1. Graduate School， Youjiang Medical University for Nationalities， Bose， Guangxi 533000， China； 2. Department of Gastroenterology， The People s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530021， China； 3. Department of Gastroenterology， Guangxi Hospital Division of The First Affiliated Hospital， Sun Yat-sen University， Nanning 530022， China）

Corresponding author： ?ZHANG Guo， ?zhangguogx@hotmail.com ?（ORCID： ?0000-0001-7755-443X）

Abstract： Objective To investigate the effect of the protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase （PERK） /eukaryotic initiation factor 2α （eIF2α） pathway in endoplasmic reticulum stress on the activation of hepatic stellate cells （HSC） . Methods Pathological sections of normal liver tissue after surgery were collected from 11 patients with hepatic fibrosis （S1-S4） and 9 patients with hepatic hemangioma and hepatic adenoma confirmed by liver biopsy， and immunohistochemistry was used to measure the protein expression levels of PERK， eIF2α， and C/EBP homologous protein （CHOP） . Human HSC-LX2 cells were treated with different concentrations of the endoplasmic reticulum stress inducer thapsigargin （0， 125， 250， 500， and 1 000 nmol/L）， and qRT-PCR was used to measure the mRNA expression level of PERK， while Western blot was used to measure the protein expression levels of PERK， inositol requiring protein 1 （IRE1）， activating transcription factor 6 （ATF6）， CHOP， and α-smooth muscle actin （α-SMA） . The method of lentivirus transfection was used to construct a PERK stable overexpression LX-2 group and a control group； qRT-PCR was used to measure the mRNA expression levels of PERK， eIF2α， and α -SMA， Western blot was used to measure the protein expression levels of PERK， phosphorylated eIF2α （p-eIF2α）， and α-SMA， and immunofluorescence assay was used to measure the expression of collagen type I alpha 1 （COL1A1） . The independent samples t-test was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups； a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. The Mann-Whitney U test was used for comparison of non-normally distributed continuous data between two groups. Results Compared with normal liver tissue， the liver tissue of patients with hepatic fibrosis had significantly higher expression levels of PERK， eIF2α， and CHOP （Z=?3.56，t=?5.75， Z=?3.52， all P<0.001） . Compared with the solvent group， the groups treated with different concentrations of thapsigargin had significant increases in the expression levels of the endoplasmic reticulum-associated proteins PERK， CHOP， IRE1， ATF6， and α-SMA （all P<0.05） . Compared with the control group， the PERK stable overexpression group had significant increases in the mRNA expression levels of PERK， eIF2α， and α-SMA and the protein expression levels of PERK， p-eIF2α， and α-SMA （all P<0.05）， and immunofluorescence assay showed a significant increase in the expression level of COL1A1 in the PERK stable overexpression group （P<0.05） . Conclusion PERK overexpression can induce the expression of α-SMA and COL1A1 in LX-2 cells， suggesting that the PERK signaling pathway might be one of the important mechanisms of HSC activation.

Key words： Endoplasmic Reticulum Stress； Eukaryotic Initiation Factor-2； Hepatic Stellate Cells； Collagen Type I

Research funding： Guangxi Natural Science Foundation Project （2023GXNSFBA026056）； The People s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region Youth Fund project （QN2020-1）

肝纖維化是許多慢性肝病的共同表現(xiàn)， 各種不良因素持續(xù)刺激造成肝臟結(jié)構(gòu)和功能改變， 病變持續(xù)發(fā)展將最終引起肝硬化、 肝癌等嚴(yán)重并發(fā)癥［1］ 。全球健康負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)［2］ 顯示， 肝硬化和其他慢性肝病仍是全球發(fā)病率和病死率的主要原因。因此， 深入研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制對疾病早期干預(yù)和阻斷肝纖維化進(jìn)程意義重大。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊能力失衡， 引起非折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔聚集的現(xiàn)象。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能受損時(shí)將引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激， 并通過3種不同跨膜蛋白， 即蛋白激酶RNA樣ER激酶 （protein kinase RNA-like endoplasmicreticulum kinase， PERK）， 肌醇需要蛋白1 （inositol requiringprotein1， IRE1）及激活轉(zhuǎn)錄因子 6（activating transcriptionfactor 6， ATF6）， 啟動非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response， UPR） ［3］。近年研究［4］發(fā)現(xiàn)， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展及逆轉(zhuǎn)過程， 可引起肝細(xì)胞凋亡、 促進(jìn)肝星狀細(xì)胞 （HSC） 活化引起肝纖維化發(fā)生發(fā)展； 另一方面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致HSC凋亡， 利于肝纖維化逆轉(zhuǎn)。因此， 本研究聚焦于PERK信號通路對肝纖維化影響， 通過構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激HSC-LX2細(xì)胞模型， 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對HSC激活及Ⅰ型膠原蛋白 （collagens type Ⅰ，COL1A1） 表達(dá)的影響； 同時(shí)通過過表達(dá)PERK蛋白， 探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK信號通路在HSC活化及COL1A1表達(dá)中的作用。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及主要試劑 HSC-LX2細(xì)胞由紐約西奈山醫(yī)學(xué)院Friedman教授贈送。主要試劑： 毒胡蘿卜素（Thapsigargin， Tg， Sigma公司）； 攜帶PERK的Tet-on過表達(dá)慢病毒和對照慢病毒 （上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司）；免疫組化通用二步法試劑盒 （中杉金橋）； RNA快速提取試劑盒 （上海奕杉生物）； 熒光定量PCR試劑盒、 cDNA逆轉(zhuǎn)錄體系試劑盒 （TaKara生物公司）； 一抗： α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）（CST 19245S）、 PERK（CST 3192S）、 IRE1（CST 3294S）、 磷酸化真核生物翻譯起始因子2α （phospho eukaryotic initiation factor 2α， p-eIF2α）、 C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白 （C/EBP homologous protein，CHOP）（CST 2895S）、ATF6（CST 65880S）；COL1A1 （武漢三鷹 67288-1-lg）、 β-actin （武漢三鷹 10077-1-AP）、 α-Tublin （武漢三鷹 66031-1-lg）、 ATF-4 （武漢三鷹 10835-1-AP）； Alexa Fluor 555 （Cell Signaling公司）； 山羊抗鼠、 山羊抗兔二抗及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒 （Affinity公司）； 聚偏二氟乙烯膜 （Millipore公司）； 高糖DMEM培養(yǎng)基 （Gibco）， 澳洲胎牛血清 （Gibco）， 4%組織細(xì)胞固定液、TritonX-100、 青鏈霉素 （penicillin-streptomycin， PS， Solarbio）qRT-PCR所用引物均由武漢金開瑞公司設(shè)計(jì)合成。

1. 2 方法

1. 2. 1 患者分組及組織取樣 收集廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院既往診斷為慢性病毒性肝炎且病理診斷為肝纖維化的患者， 排除HIV或酗酒、 由于其他原因引起的肝損傷及合并肝癌患者。根據(jù)慢性肝炎分級分期標(biāo)準(zhǔn)對患者肝纖維化程度進(jìn)行分級分期。本研究共收集11例慢性乙型肝炎合并肝纖維化患者的病理切片， 其中G2S1患者3例， G3S3患者4例， G3S4患者2例， G4S4 2例。此外， 收集了9例行手術(shù)切除肝血管瘤或肝腺瘤周圍的正常肝組織病理切片。

1. 2. 2 免疫組化 將肝組織經(jīng)過福爾馬林固定、 乙醇脫水、 石蠟包埋、 切片、 烘烤 （68 ℃ 120 min）、 二甲苯脫蠟、 100%～70%梯度乙醇水化、 抗原修復(fù) （檸檬酸鹽高壓修復(fù)4 min）、 封閉、 孵育一抗 （4 ℃過夜）、 孵育二抗、 DAB染色5 min、 蘇木素復(fù)染5 min、 乙醇脫水后使用中性樹脂膠封片。于顯微鏡下觀察并拍照， 結(jié)果由2位研究者在未知切片信息的情況下進(jìn)行， 每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野 （×200）， 排除非特異性染色后進(jìn)行評分； 結(jié)合細(xì)胞著色比例及染色顏色強(qiáng)度進(jìn)行評分： 細(xì)胞著色比例<5%為0分； 5%～25%為1分； 26%～50%為2分； 51%～75%為3分； 76%～100%為4分。陽性強(qiáng)度按照如下方式進(jìn)行打分： 無色記為0分， 淺黃色記1分， 棕黃色記2分， 棕褐色記3分； 將上述2個(gè)評分乘積作為該視野得分； 計(jì)算2位研究者評出每個(gè)視野的平均分， 若評分接近取平均值為最終得分， 若評分相差較遠(yuǎn)， 則請第3位研究者進(jìn)行評分， 再計(jì)算平均值。最終獲得3分以上者判斷為陽性表達(dá)。

1. 2. 3 HSC-LX2細(xì)胞的分組及干預(yù) 細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后， 用含10%胎牛血清+1%PS的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的LX2細(xì)胞分5組接種在6孔培養(yǎng)板； 待細(xì)胞貼壁生長后， 按溶媒對照組， Tg 125 nmol/L、 Tg 250 nmol/L、 Tg 500 nmol/L、Tg 1 000 nmol/L組加入藥物干預(yù)24 h。

1. 2. 4 慢病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將生長良好的LX2細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板， 接種密度為3×105/孔， 當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度30%～40%時(shí)感染慢病毒， 同時(shí)將培養(yǎng)基更換為不含血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基， 培養(yǎng)8～16 h后， 更換成完全培養(yǎng)基， 同時(shí)設(shè)置對照空載慢病毒 （NC） 組。48 h后加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選， 獲得穩(wěn)定株后， 根據(jù)Tet-on載體要求， 加入多西環(huán)素 （終濃度為0. 6 ?g/mL） 誘導(dǎo)48 h。隨后提取總蛋白及RNA行qRT-PCR及蛋白免疫印跡法 （Western Blot） 驗(yàn)證。

1. 2. 5 Western Blot實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞鋪板干預(yù)24 h結(jié)束后，應(yīng)用高效RIPA裂解液提取總蛋白， 用BCA法測定蛋白濃度， 經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)， 經(jīng)轉(zhuǎn)膜后將分離后的條帶轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上， 用快速封閉液 （碧云天公司） 室溫下封閉15 min， TBST洗膜3次， 每次5 min，4 ℃下孵育一抗過夜。TBST洗膜3次， 每次10 min， 37 ℃孵育二抗1 h， TBST洗膜3次， 每次10 min， 應(yīng)用雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描， 以β-actin或α-Tublin為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

1. 2. 6 細(xì)胞免疫熒光 將生長良好的PERK過表達(dá)及空載病毒組細(xì)胞接種于裝有蓋玻片的6孔板內(nèi)， 完全貼壁后， 用4%組織細(xì)胞固定液固定15 min后PBS洗3次，0. 5% TritonX-100通透30 min， PBS洗3次， 10%山羊血清封閉30 min， 4 ℃下孵育一抗過夜。PBST洗3次， 熒光二抗避光37 ℃孵育1 h， PBST洗3次， 加入DAPI復(fù)染， PBST洗2次， 熒光猝滅劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察。

1. 2. 7 qRT-PCR 細(xì)胞鋪板干預(yù)24 h后， 按RNA快速提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA， 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA， 然后以cDNA為模板進(jìn)行 qRT-PCR， 反應(yīng)體系 TB Green ? Premix Ex Taq ? Ⅱ 10 ?L， 上下引物各0. 8 ?L， dH2O 6 ?L， cDNA 2 ?L。反應(yīng)程序： 95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s， 擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參， 應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算目標(biāo)因子的相對表達(dá)量。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24. 0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x ˉ±s表示， 兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)， 多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)； 不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以 M（P25～P75）表示， 兩組間比較采用 MannWhitney U秩和檢驗(yàn)。P<0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 肝組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α/CHOP通路蛋白的表達(dá) 肝纖維化患者肝組織病理切片中PERK、 eIF2α、CHOP細(xì)胞著色比例及染色強(qiáng)度得分均大于非肝纖維化患者 （P值均<0. 001）。與非肝纖維化肝組織相比， 肝纖維化患者肝組織樣本中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路相關(guān)蛋白PERK、 eIF2α及CHOP在纖維化擴(kuò)大的匯管區(qū)HSC細(xì)胞漿表達(dá)異常升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0. 001）（表2， 圖1）， 提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與肝纖維化過程。

2. 2 Tg誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用下HSC-LX2中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)情況 不同濃度Tg在不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)后， LX-2細(xì)胞形態(tài)變化不明顯， 但LX-2細(xì)胞生長速度明顯被抑制， 且作用時(shí)間越長， Tg濃度越大， 細(xì)胞被抑制越明顯 （圖2a）。Tg誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后行qRT-PCR檢測， 結(jié)果顯示，相較于空白組 （0 nmol/L）， 250、 500、 1 000 nmol/L的Tg誘導(dǎo)下跨膜蛋白PERK表達(dá)升高， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P值均<0. 05）（圖2b）。Western Blot結(jié)果顯示， 不同濃度Tg誘導(dǎo)下IRE1、 PERK、 CHOP表達(dá)均升高， 500、 1 000 nmol/L的Tg誘導(dǎo)下ATF6表達(dá)升高， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P值均<0. 05）， 提示Tg誘導(dǎo)LX2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型構(gòu)建成功 （圖2c、 d）。

2. 3 Tg誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下HSC-LX2中α-SMA表達(dá)情況qRT-PCR結(jié)果顯示， 相較于空白組， 不同濃度的Tg誘導(dǎo)下α-SMA表達(dá)水平升高， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P值均<0. 01）（圖3a）。Western Blot結(jié)果顯示， 不同濃度Tg刺激后LX2細(xì)胞α-SMA表達(dá)水平升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0. 05）（圖3b）， 提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與LX2細(xì)胞活化過程。

2. 4 PERK信號通路對HSC-LX2細(xì)胞活化的影響 過表達(dá)PERK慢病毒轉(zhuǎn)染LX2細(xì)胞后， 光學(xué)顯微鏡觀察LX2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生微小改變， 無細(xì)胞區(qū)較對照組增加 （圖4a）； qRT-PCR結(jié)果顯示， PERK過表達(dá) （PERK OE） 組中PERK和eIF2αmRNA表達(dá)明顯升高 （圖4b、 c）； 進(jìn)一步行Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示， PERK OE組中PERK及p-eIF2α表達(dá)升高 （P<0. 05）（圖4d）， 提示PERK信號通路被激活。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果提示， 與 NC 組相比， 過表達(dá)PERK組COL1A1表達(dá)升高 （P<0. 05）（圖5a）； qRT-PCR及Western Blot結(jié)果提示， PERK信號通路激活后LX2活化指標(biāo)α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)升高（P<0. 05）（圖5b、 c）。提示激活PERK相關(guān)通路能促進(jìn)LX2細(xì)胞的活化及增加COL1A1表達(dá)。

3 討論

肝纖維化是繼發(fā)于各種慢性肝損傷的組織修復(fù)反應(yīng)， 持續(xù)的肝纖維化可引起肝細(xì)胞功能障礙、 門靜脈高壓等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥［5］ 。肝纖維化的本質(zhì)主要是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì) （ECM） 過度沉積， 而ECM主要由活化的HSC產(chǎn)生［6］。當(dāng)肝損傷或體外培養(yǎng)時(shí)， HSC被激活分化為肌成纖維細(xì)胞， 肌成纖維細(xì)胞的大量增殖使ECM生成增加， 加之其降解失衡， 最終發(fā)展為肝纖維化［7］。而ECM相關(guān)成分α-SMA、 COL1A1和Ⅲ型膠原蛋白也隨著纖維化程度加深而表達(dá)升高［8］。因此， α-SMA 及COL1A1均可作為HSC的活化標(biāo)志物。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是生物細(xì)胞的重要細(xì)胞器， 廣泛參與蛋白質(zhì)合成、 脂質(zhì)合成轉(zhuǎn)運(yùn)及Ca2+平衡的維持等重要生物學(xué)過程中。當(dāng)細(xì)胞受到缺氧、 損傷、 炎癥等有害刺激時(shí)， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑Tg是SERCA （sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase） 泵特異性抑制劑， 可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶， 阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)從細(xì)胞質(zhì)中重吸收Ca2+， 導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的消耗， 從而抑制鈣依賴性分子伴侶， 導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的累加， 繼而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。目前常用UPR判斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生［9-10］ 。本研究采用Tg誘導(dǎo)LX2細(xì)胞建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型， 探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與HSC活化之間的潛在關(guān)系。結(jié)果表明， 從125～1 000 nmol/L不同濃度Tg刺激下均可明顯增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白PERK/CHOP、 IRE1、 ATF6表達(dá)升高， 3條UPR通路激活， 表明Tg誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型構(gòu)建成功。LX2細(xì)胞活化標(biāo)志物α-SMA表達(dá)升高， 提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與LX2細(xì)胞的活化過程。

PERK相關(guān)通路是UPR的經(jīng)典途徑， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，PERK被葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78釋放并激活， 隨后催化eIF2α，使其發(fā)生磷酸化， 抑制翻譯的啟動及抑制蛋白合成， 促進(jìn)CHOP的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［11］ 。研究［12］ 發(fā)現(xiàn)， 相較于輕度肝纖維化組織， 嚴(yán)重肝纖維化組織中PERK磷酸化水平升高；在小鼠肝纖維化模型中的PERK磷酸化增加與HSC激活標(biāo)記的表達(dá)升高呈正相關(guān)［13］ ； 小分子多肽激素鳶尾素可通過抑制原代HSC內(nèi)PERK/eIF2α/CHOP途徑抑制異質(zhì)核磷酸化A1的降解緩解肝纖維化 ［14］ 。本研究發(fā)現(xiàn)， 相較于非肝纖維化患者， 肝纖維化患者PERK/eIF2α/CHOP通路相關(guān)蛋白表達(dá)升高， 提示PERK通路可能參與肝纖維化發(fā)生。為進(jìn)一步驗(yàn)證， 本研究采用慢病毒干擾技術(shù)構(gòu)建PERK過表達(dá)的LX2細(xì)胞株， 結(jié)果顯示， 相較于空載病毒組， PERK過表達(dá)組PERK、 p-eIF2α表達(dá)水平升高， PERK通路被激活， 同時(shí)HSC活化標(biāo)志物α-SMA及COL1A1表達(dá)水平升高， 提示PERK介導(dǎo)的信號通路參與HSC活化過程及增加Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。

本研究存在一定不足， 未針對Tg誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)一步干預(yù)觀察， 也缺少動物模型上相應(yīng)表型的進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述， 本研究通過對比肝纖維化患者與非肝纖維化患者病理切片免疫組化結(jié)果， 構(gòu)建LX2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型以及構(gòu)建PERK過表達(dá)LX2細(xì)胞株， 初步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK信號通路在HSC活化及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)中的影響， 為探索肝纖維化發(fā)病機(jī)制及臨床尋找逆轉(zhuǎn)肝纖維的治療靶點(diǎn)提供新思路。

倫理學(xué)聲明： 本研究方案于2022年8月12日經(jīng)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審批， 批號： KY-KJT-2023-310。

利益沖突聲明： 本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明： 黎鳳炎負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)論文框架， 實(shí)驗(yàn)實(shí)施， 收集數(shù)據(jù)， 資料分析， 撰寫論文； 劉澤峰參與課題設(shè)計(jì)， 資料分析； 夏雨艷參與實(shí)驗(yàn)實(shí)施， 收集數(shù)據(jù)； 王文娟參與資料分析； 李琪、 唐利瑕參與統(tǒng)計(jì)分析； 張國負(fù)責(zé)研究選題， 指導(dǎo)文章撰寫及修改。黎鳳炎、 劉澤峰對本文貢獻(xiàn)等同， 同為第一作者。

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收稿日期：2023-10-12； 錄用日期：2023-11-30

本文編輯：邢翔宇