王彩霞

【摘 要】 目的：觀察艾灸對D-半乳糖致亞急性衰老模型大鼠皮膚組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量及雌二醇水平的影響，探討艾灸延緩皮膚衰老的作用機(jī)制。方法：大鼠頸背部皮下注射D-半乳糖制備亞急性衰老模型，連續(xù)42 d。造模第22天，實驗組予以艾灸“足三里”“關(guān)元”穴。42 d后，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠膠原蛋白含量及皮膚雌二醇（Estradiol）水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠皮膚組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量和雌二醇水平顯著下降（P<0.01）。與模型組比較，艾灸可增加大鼠皮膚組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量和雌二醇水平（P<0.01）。結(jié)論：艾灸能顯著緩解D-半乳糖所致的亞急性皮膚衰老。

【關(guān)鍵詞】 艾灸療法；皮膚衰老；膠原蛋白；雌二醇；大鼠

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2024）09-0024-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.09.zgmzmjyyzz202409007

Effects of Moxibustion on Collagen Content and Estradiol Level in Skin

Tissue of Subacute Aging Model Rats Induced by D-galactose

WANG Caixia

Institute of Traditional Chinese medicine， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004，China

Abstract：Objective To observe the effects of moxibustion on the contents of type Ⅰ， type Ⅲ collagen and the level of estradiol in skin tissue of subacute aging rats induced by D-galactose，and to explore its mechanism of delaying skin aging．Methods Subacute aging model was established by subcutaneous injection of D-galactose into the neck and back of rats for 42 days. On the 22th modeling day， the rats of the experimental group accepted moxibustion at Zusanli and Guanyuan points.Forty-two days later， The contents of typeⅠ， type Ⅲ collagen and estradiol in skin of rats were determined by ELISA.Results Compared with the normal group， the content of type Ⅰ， type Ⅲ collagen and the level of estradiol in skin tissue of model group were significantly decreased （P<0.01）．Compared with the model group，moxibustion could significantly increase the content of type Ⅰ， type Ⅲ collagen and the level of estradiol level in skin tissue of rats（P<0.01）．Conclusion Moxibustion can significantly alleviate subacute skin aging induced by D-galactose.

Keywords：Moxibustion Therapy; Skin Aging; Collagen; Estradiol; Rat

目前，人口老齡化已成為社會面臨的難題，延緩衰老亦成為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究的熱點課題之一。皮膚是最早反映機(jī)體衰老的組織，隨著人們對美的需求日益增長，永葆青春成了人們追求的目標(biāo)。衰老是一種不可抗拒的自然規(guī)律，而皮膚作為生物衰老過程中變化最為明顯的器官之一，主要表現(xiàn)為皮膚松弛、粗糙、彈性下降、皺紋增多、色素沉著等［1-2］。目前認(rèn)為，皮膚衰老與氧自由基增多、端粒酶活性降低、膠原降解增加、免疫力衰退、炎性浸潤等有關(guān)［3-4］。皮膚衰老不僅有損于容貌，亦影響社交，而且與許多皮膚病如日光性角化病、脂溢性皮炎、基底細(xì)胞癌的發(fā)生也有著病因?qū)W的關(guān)系［5-6］。在延緩皮膚衰老方面，西醫(yī)學(xué)運(yùn)用皮膚提緊術(shù)、自體脂肪填充術(shù)、肉毒素注射等方法治療，但有一定的風(fēng)險及副作用。再加上化學(xué)合成化妝品的涌入和濫用以及化學(xué)合成抗氧化劑的毒性和致癌作用對人體造成的傷害，人們的自我保護(hù)意識不斷增強(qiáng)，向往“綠色”的呼聲越來越高，對“老而不衰”的渴望也愈加強(qiáng)烈。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人體衰老與臟腑氣血盛衰有著密切關(guān)系。陽氣衰弱，陰精不足，氣血虧虛，臟腑功能減退，經(jīng)絡(luò)運(yùn)行不暢，均能引起陰陽失調(diào)，從而導(dǎo)致衰老進(jìn)程加快。因此，將傳統(tǒng)中醫(yī)保健抗衰手段與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前延緩衰老的重要課題。

艾灸是中醫(yī)學(xué)的傳統(tǒng)療法，其保健抗衰老作用歷史悠久，早在兩千多年前的醫(yī)學(xué)著作《黃帝內(nèi)經(jīng)》中，就對抗衰老理論及艾灸臨床治療有著十分詳細(xì)的記載。艾灸具有溫通經(jīng)絡(luò)、補(bǔ)益氣血、防病保健、延年益壽等作用，歷來被認(rèn)為是養(yǎng)生保健抗衰老的重要方法 ［7］。南宋醫(yī)家竇材在《扁鵲心書》中曰：“人于無病時常灸關(guān)元、氣海、命門、中脘，雖未得長生，亦可保百余年壽矣?！薄锻馀_秘要》記載：“三里養(yǎng)先后天之氣，灸三里可使元?dú)獠凰ィ史Q長壽之灸?！庇纱丝梢钥闯?，艾灸在調(diào)節(jié)身體機(jī)能、抗衰老、延年益壽中發(fā)揮了重要作用。

現(xiàn)代研究［8］表明，艾灸可通過清除自由基、提高免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、調(diào)整脂質(zhì)代謝等以延緩衰老?！白闳铩焙汀瓣P(guān)元”穴是防病抗衰的要穴，具有健運(yùn)脾胃、強(qiáng)壯機(jī)體之功，也是治療諸虛百損的常用穴位。本研究通過觀察艾灸“足三里”“關(guān)元”穴對D-半乳糖致衰老模型大鼠膠原蛋白、雌二醇含量及皮膚組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的影響，從而探討艾灸抗衰老作用及機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 動物與分組 SPF級SD雌性健康大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、陽性對照組（維生素E組）和艾灸組，每組各10只。各組動物在同等條件下常規(guī)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持在（24±2）℃，濕度40%～60%，保持光照充足、通風(fēng)良好。

1.2 藥品與試劑 艾條（北京國醫(yī)研醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司），維生素E（北京綠健園科技有限公司）；D-半乳糖生化試劑（源葉生物）；Ⅰ型膠原（COL1）、Ⅲ型膠原（COL3）測定試劑盒（Elabscience公司）；雌二醇（Estradiol）測定試劑盒（Elabscience公司）。

1.3 儀器 ?C2500-R-230V微型高速離心機(jī)（美國Labnet公司）；ICV-450電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本ASONE）；FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司）。

2 方法

2.1 動物模型制備與給藥 實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開始給藥造模，模型組、陽性對照組和艾灸組大鼠每日頸背部皮下注射10%D-半乳糖（1000 mg/kg）［9］制備亞急性衰老模型，正常組皮下注射同等劑量的0.9%生理鹽水，連續(xù)注射給藥42 d。

2.2 取穴與艾灸方法 從注射的第22天開始實施艾灸治療。時間選擇在每日上午9時至12時，大鼠穴位定位參照余曙光主編《實驗針灸學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜［10］。足三里穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下方約5 mm處；關(guān)元穴位于臍下約25 mm處。艾灸前將穴區(qū)直徑約1.0 cm的毛剃干凈，用大鼠固定器將大鼠固定，暴露穴區(qū)局部皮膚，對足三里穴和關(guān)元穴實施溫和灸，每穴灸5 min，灸后局部皮膚潮紅，無發(fā)泡。除艾灸組外，其余各組每天相同時間做相同固定5 min，但不灸，亦不讓其聞到艾煙的味道。陽性對照組頸背部涂抹維生素E軟膠囊。每天1次，連續(xù)21 d。

2.3 取材及指標(biāo)測定 取材前一天用剃毛器脫去大鼠背部皮膚的毛，約3 cm×3 cm。取材當(dāng)天大鼠處死后，取脫毛后背部皮膚組織約0.5 g，用預(yù)冷（4 ℃）生理鹽水漂洗，除去多余雜質(zhì)，濾紙拭干，稱重（取0.5 g），放入該組織塊9倍重量的預(yù)冷生理鹽水中，眼科小剪剪碎組織塊，制成10％組織勻漿，漿液以3500 r/min的速度離心20 min，取適量上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測皮膚組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量、雌二醇水平。實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以表示，各組單因素之間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

如表1所示，與正常組比較，模型組大鼠皮膚中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和雌二醇含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，艾灸組皮膚中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白和雌二醇含量顯著升高（P＜0.01）。

4 討論

實驗采用D-半乳糖致亞急性衰老模型，該模型是在一定時間內(nèi)連續(xù)皮下注射D-半乳糖，通過增加體內(nèi)半乳糖濃度從而使細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，自由基過量堆積而使機(jī)體呈現(xiàn)衰老狀態(tài)，該模型被認(rèn)為是當(dāng)前抗衰老研究的較好模型，被廣泛應(yīng)用［11-12］。實驗中模型大鼠出現(xiàn)衰老征象，皮膚膠原蛋白含量及雌二醇水平降低證明了此造模方法的可行性。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究［13］證實，皮膚衰老過程中其中一個重要變化是細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解。膠原纖維約占真皮纖維的90%，是真皮的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)，它們聚集成粗大的膠原束，相互交聯(lián)，縱橫交錯，從而形成皮膚固有的韌性。但隨著年齡的增長，皮膚膠原纖維逐漸變細(xì)，合成減少，真皮層變薄，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚韌性下降。膠原蛋白是膠原纖維的主要成分，存在于所有哺乳動物體內(nèi)，是一類纖維狀、大分子蛋白質(zhì)，由結(jié)締組織細(xì)胞與其他類型的細(xì)胞（如肝、脾、肺臟及腦組織細(xì)胞）分泌，普遍分布于細(xì)胞外基質(zhì)中。膠原蛋白是真皮中含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，約占總蛋白的1/3，使皮膚保持一定的強(qiáng)度和彈性［14-15］。人體皮膚真皮中的膠原主要由Ⅰ型膠原（80%～90%）和Ⅲ型膠原（8%～12%）構(gòu)成［16］。皮膚的張力和承受耐力主要由Ⅰ型膠原維持，皮膚彈性主要與Ⅲ型膠原有關(guān)，而皮膚質(zhì)地主要由Ⅰ型與Ⅲ型膠原的比例所決定［2］。當(dāng)皮膚衰老時，兩者比例逐漸倒置，皮膚中含有的膠原纖維會逐漸降解，交聯(lián)異常，膠原應(yīng)力傳導(dǎo)下降，抗剪切力減弱，從而損害了真皮結(jié)構(gòu)的完整性，致使皮膚松弛，彈性降低、松弛起皺［17］。因此，皮膚中膠原蛋白含量的測定也是反映皮膚衰老的一個重要指標(biāo)［18］。

雌激素參與皮膚許多生理、病理過程，人類皮膚老化與機(jī)體內(nèi)雌激素水平下降有關(guān)［19］。研究［20］表明，雌激素能促進(jìn)表皮細(xì)胞增生，從而增加表皮厚度，改善皮膚循環(huán)分布，影響皮脂腺分泌，可通過作用于成纖維細(xì)胞受體而直接調(diào)控該細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其活性，增加膠原蛋白含量。女性服用雌二醇（2 mg/d）7個月后，用高頻超聲波檢測出皮膚厚度、彈性及保濕性均有顯著改善；雌激素局部治療對絕經(jīng)后婦女面部皮膚的影響，通過比較治療16周前后皮膚樣本，發(fā)現(xiàn)無論是表皮還是真皮厚度都有所增加，同時膠原含量平均增加28%。雌二醇是機(jī)體內(nèi)含量最多，也是活性最強(qiáng)的一種雌激素，其含量的高低也可以間接反映皮膚衰老程度。

“關(guān)元”穴位于任脈，是任脈與足三陰經(jīng)的交會穴，是三焦元?dú)馑l(fā)處，聯(lián)系命門真陽，為陰中之陽穴，具有培本固腎、調(diào)理沖任、補(bǔ)益精血之功，艾灸關(guān)元穴可補(bǔ)攝下焦元?dú)猓鲋鷻C(jī)體元陰元陽，屬先天之本，是古今強(qiáng)壯保健的要穴，當(dāng)代學(xué)者亦從實驗研究［21］中證實了艾灸關(guān)元的抗衰老作用?！白闳铩睘樽汴柮魑附?jīng)的合穴，胃之下合穴，土經(jīng)中的土穴，為回陽九針穴之一，具有健運(yùn)脾胃、益氣養(yǎng)血、培土化元之功，屬后天之本，為健脾補(bǔ)虛培元之要穴。已有實驗研究［22-24］證實，艾灸足三里可增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）等酶類抗氧化劑的活性，降低丙二醛（MDA）等代謝產(chǎn)物的含量，具有良好的抗衰老作用。故本實驗選用艾灸關(guān)元和雙側(cè)足三里穴，既能充養(yǎng)先天，又能培補(bǔ)后天，共奏補(bǔ)腎健脾、益氣活血、培元固本、延年益壽之功，從而達(dá)到固護(hù)正氣、防病抗衰的目的。

研究結(jié)果顯示，模型組皮膚組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量及雌二醇水平低于正常組（P<0.01），提示D-半乳糖造模成功。而艾灸“足三里”及“關(guān)元”穴能夠提高皮膚組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量及雌二醇水平（P<0.01），且改善效果優(yōu)于維生素E對照組，表明艾灸可能通過抑制膠原蛋白降解，升高雌激素水平，增加膠原蛋白含量，從而減緩皮膚衰老。這與艾灸溫通經(jīng)絡(luò)，補(bǔ)益氣血，充養(yǎng)先天，培補(bǔ)后天，以延緩衰老的機(jī)理也是不謀而合的。本研究提示艾灸對皮膚衰老大鼠具有一定的干預(yù)作用，但是尚存不足之處： 本實驗只是做了大鼠皮膚組織的檢測，卻沒有做病理觀察，也沒有對基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測，因此對艾灸的抗衰老作用機(jī)制尚未完全明了。后期需進(jìn)一步深入研究相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而明確艾灸延緩皮膚衰老的具體作用機(jī)制，本實驗為臨床抗衰老提供了新的思路與方法。

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（收稿日期：2023-08-01 編輯：劉 斌）