基金項目：國家自然科學(xué)基金（31672264）；天津市淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目（ITTFRSA2021000）。

作者簡介：藍(lán)一（1999-），男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)增養(yǎng)殖、水產(chǎn)遺傳與育種。E-mail：layi3018@163.com。

通訊作者：王茜（1971-），女，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)增養(yǎng)殖、水產(chǎn)遺傳與育種。E-mail：wqgt1999@163.com。

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2024.05.002

摘" 要：以革胡子鲇（Clarias gariepinus）為試驗對象，對其生長激素（GH）基因進(jìn)行熒光定量PCR（qPCR）的引物設(shè)計與評估。將合成的5對引物通過常規(guī)PCR電泳結(jié)果選擇出符合條件的GHF-GHR引物，并進(jìn)行qPCR引物的評估。結(jié)果顯示：擴(kuò)增GH基因片段的引物GHF-GHR擴(kuò)增時熔解曲線為單一峰，說明引物具有良好的特異性；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出GHF-GHR引物的擴(kuò)增效率為93.3%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為0.982，說明引物的擴(kuò)增效率良好。上述結(jié)果說明GHF-GHR引物能用于待檢樣本的GH基因表達(dá)的qPCR分析。

關(guān)鍵詞：革胡子鲇（Clarias gariepinus）；生長激素基因；引物設(shè)計；熒光定量PCR；評估

革胡子鲇（Clarias gariepinus）隸屬于鲇形目（Siluriforms），胡子鲇科（Clariidae），胡子鲇屬（Clarias），原產(chǎn)于非洲尼羅河流域，1981年作為水產(chǎn)養(yǎng)殖品種引入中國，其屬于底層魚類，具有營養(yǎng)豐富、易繁殖、抗病力強(qiáng)、耐低氧、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。為了進(jìn)一步提高其生產(chǎn)效率，深入了解影響其生長的遺傳因素具有重要的意義。生長激素（grown hormone，GH）是由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種單一肽鏈的蛋白激素，是一種具有廣泛生理功能的生長調(diào)節(jié)素，魚類生長激素（fish grown hormone，fGH）是魚類腦垂體合成和分泌的一種分子量在22 KD左右的蛋白多肽，具有廣泛的生理作用。Duan等通過測量和觀察14 對大小匹配的GH 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因鯉（Cyprinus carpio）的血清 GH 水平和行為影響，發(fā)現(xiàn)GH轉(zhuǎn)基因促進(jìn)了GH的表達(dá)，從而提高了鯉競爭和獲取食物資源的能力；Deng等為探究金鼓魚（Scatophagus argus）具有典型的雌雄生長二態(tài)性的原因，使用qRT-PCR分析顯示，雌性在6、18、30個月時的腦垂體GH水平比雄性更高，表明雌雄生長二態(tài)性可能歸因于金鼓魚中腦垂體的GH水平。

實時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR）是在PCR反應(yīng)過程中對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實時分析和檢測，是一種準(zhǔn)確檢測基因表達(dá)水平的強(qiáng)大工具，可以揭示與生長和發(fā)育相關(guān)的調(diào)控途徑。 qPCR目前已成為檢測不同樣品間基因表達(dá)水平差異比較權(quán)威性的方法，在水產(chǎn)動物中該方法也已被廣泛應(yīng)用，馬細(xì)蘭等應(yīng)用qPCR法檢測30、60、80、110、140日齡雄尼羅羅非魚（Oreochromis nilotica）肝臟GHR1和GHR2基因的表達(dá)；徐麗華等分別以23 ℃常溫對照組和6 ℃低溫待測組的鯉（Cyprinus carpio）腦組織cDNA為模板，以18S rRNA為內(nèi)參基因，檢測26個候選基因的相對表達(dá)量；Jean-René等采用實時定量RT-qPCR與細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合的方法，對傳染性鮭魚貧血癥（ISAV）進(jìn)行診斷分析；Guo等應(yīng)用qPCR和重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（real-time RAA）分別檢測大口黑鱸病毒（LMBV）的敏感性和特異性，結(jié)果表明qPCR更適合在實驗室中對LMBV進(jìn)行定量分析和準(zhǔn)確檢測。

開發(fā)和評估革胡子鲇GH基因的qPCR引物是闡明該物種生長調(diào)控分子機(jī)制的關(guān)鍵一步，通過準(zhǔn)確量化GH基因表達(dá)水平，我們可以確定與生長性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，促進(jìn)選擇性育種項目，提高生長性能和抗病能力，然而目前革胡子鲇GH基因的qPCR引物鮮有研究。本研究采用生物信息學(xué)的方法，應(yīng)用適宜的分子生物學(xué)軟件和技術(shù)，擬獲得革胡子鲇GH基因qPCR的相關(guān)引物，旨在為今后革胡子鲇GH基因表達(dá)分析以及進(jìn)一步探討高密度養(yǎng)殖條件下革胡子鲇快速生長的機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的發(fā)展提供引物資料。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

本試驗用魚革胡子鲇取自天津市德仁農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，養(yǎng)殖密度約65 kg/m3，平均體質(zhì)量（66.43±17.28） g，平均體長（18.54±1.92）cm。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 引物設(shè)計" 本試驗中待檢目標(biāo)基因為GH。GH基因擴(kuò)增引物根據(jù)本實驗室克隆的革胡子鯰GH全長cDNA（GenBank檢索號：FJ823972）應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計。滿足qPCR擴(kuò)增基本要求的引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.2" RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄" 應(yīng)用Trizol試劑提取革胡子鲇腦垂體的總RNA，選擇完整性較好的RNA在核酸蛋白測定儀檢測RNA的純度和濃度，以確定反轉(zhuǎn)錄所需RNA的量，應(yīng)用cDNA第一條鏈合成試劑盒，分別用Oligo dT引物和random引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄過程。

1.2.3" 引物的常規(guī)PCR分析" 應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計并選擇出5對擴(kuò)增GH基因片段的引物，用常規(guī)PCR進(jìn)行檢測，每對引物分別用上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA（稀釋10倍）為模板進(jìn)行常規(guī)PCR分析。

1.2.4" 引物的qPCR評估" 根據(jù)常規(guī)PCR的電泳檢測結(jié)果，并結(jié)合引物序列的Tm值，從中選擇出適宜的引物，對其進(jìn)行qPCR評估。根據(jù)常規(guī)PCR檢測選擇退火溫度，設(shè)定58、60、62 ℃三個溫度梯度進(jìn)行qPCR檢驗，反應(yīng)結(jié)束后觀察熔解曲線分析引物的特異性以及依據(jù)Ct值選擇最終制定標(biāo)準(zhǔn)曲線的引物。（分別將cDNA稀釋10倍、50倍、100倍進(jìn)行熔解曲線和Ct值的分析，最終選擇適合制定標(biāo)準(zhǔn)曲線的cDNA的初始濃度，采用10倍稀釋法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線）

2" 結(jié)果與分析

2.1" 總RNA分離結(jié)果及引物常規(guī)PCR分析

8個個體的腦垂體的總RNA電泳結(jié)果見圖1，腦垂體總RNA的OD260/OD280值在1.80～2.00范圍內(nèi)，可以進(jìn)行后續(xù)試驗。常規(guī)PCR法擴(kuò)增GH目標(biāo)基因結(jié)果見圖2，電泳檢測結(jié)果顯示所有引物的擴(kuò)增產(chǎn)物均呈現(xiàn)單一的帶紋。

M為DNA Marker2000，1-8號分別為垂體1-垂體8

M為DNA Marker2000；1和2，3和4，5和6，7和8，9和10分別用引物GHF1-GHR1、GHF2-GHR2、GHF3-GHR3、GHF4-GHR4、GHF-GHR擴(kuò)增GH目標(biāo)基因片段結(jié)果

2.2" Ct值的檢測、cDNA稀釋倍數(shù)選擇以及熔解曲線分析

根據(jù)qPCR要求，引物在擴(kuò)增時的Ct值lt;25時才能對引物進(jìn)行擴(kuò)增效率分析。其中GHF-GHR引物擴(kuò)增的Ct值符合要求，且熔解曲線為單一的峰值，表明引物的特異性強(qiáng)，故對其進(jìn)行后續(xù)qPCR擴(kuò)增效率的分析。以稀釋10倍、50倍、100倍的cDNA為模板，GHF-GHR為引物進(jìn)行擴(kuò)增得到的Ct值分別為14.98、17.52、19.39，故選擇稀釋10倍的cDNA為模板進(jìn)行后續(xù)操作。

2.3" 退火溫度的優(yōu)化

根據(jù)常規(guī)PCR檢測，選取58、60、62 ℃三個溫度梯度進(jìn)行退火溫度的分析，由表2可知，三個溫度梯度下的GHF-GHR的Ct值差異。并且GHF-GHR引物在58、60、62 ℃三個溫度梯度下的熔解曲線均為單一峰，說明引物的特異性良好。根據(jù)擴(kuò)增得到的Ct值綜合考慮最終選擇62 ℃為退火溫度進(jìn)行后續(xù)GH目標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。圖3為GHF-GHR引物擴(kuò)增的GH基因在58、60、62 ℃三個退火溫度下的熔解曲線圖。

曲線上有◆者、有X者和無標(biāo)注者分別為GHF-GHF引物在58、60、62 ℃三個退火溫度下擴(kuò)增GH基因得到的熔解曲線圖3" GHF-GHF引物在58、60、62 ℃三個退火溫度下擴(kuò)增GH基因得到的熔解曲線

2.4" 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)以上試驗結(jié)果選取GHF-GHR為特異性擴(kuò)增目標(biāo)基因的引物，以稀釋10倍的cDNA為初始濃度，采用10倍稀釋法，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時的擴(kuò)增模板。從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4可以得知GH目標(biāo)基因擴(kuò)增效率為93.3%，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.982。圖5為GH目標(biāo)基因的擴(kuò)增曲線。

A1-C1、A2-C2、A3-C3、A4-C4、A5-C5為分別在cDNA稀釋10-105濃度下的重復(fù)組圖4" GH目標(biāo)基因構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線

曲線上無標(biāo)注者、有▲者、有X者、有◆者和■者分別為以稀釋10倍、102倍、103倍、104倍、105倍的cDNA為模板擴(kuò)增得到的擴(kuò)增曲線圖5" GH目標(biāo)基因擴(kuò)增曲線

3" 結(jié)論與討論

3.1" RNA檢測及引物的特異性

在運(yùn)用實時熒光定量PCR方法檢測特異基因表達(dá)量的差異時，總RNA的質(zhì)量是關(guān)鍵。RNA降解或污染，都會導(dǎo)致試驗結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，檢查每個RNA樣品的完整性和純度十分重要，通過瓊脂糖電泳分析時，電泳圖上有明顯的兩條帶（28 s帶和18 s帶），并且28 s/18 s rRNA的帶亮度比在1和2之間，表明其具有良好的完整性，而OD260/OD280在1.8～2.0之間表示RNA樣本純度高，不含蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。本試驗提取的革胡子鲇腦垂體的總RNA符合以上要求，可以進(jìn)行后續(xù)qPCR分析。

qPCR引物的設(shè)計應(yīng)符合以下原則：保證擴(kuò)增子的長度在75～200 bp，片段越短擴(kuò)增效率越高；但如果片段小于75 bp，擴(kuò)增子很難與可能存在的引物二聚體區(qū)分，同時要求引物的GC值為50%～60%、Tm值在50～65 ℃之間，避免產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)，還要確保正向和反向引物3’沒有互補(bǔ)配對，以避免引物二聚體形成。熔解曲線是用于評估PCR產(chǎn)物的特異性的一種常用手段，通過觀察熔解曲線，可以確定PCR產(chǎn)物是否單一，或者是否存在非特異性擴(kuò)增或引物二聚體等問題。特異性的PCR產(chǎn)物會在特定溫度范圍內(nèi)形成單一的熔解峰。Kokkattunivarthil等為了探究快速診斷南美白對蝦（Litopenarus vannamei）是否感染對蝦傳染性肌肉壞死?。↖nfectious myonecrosis）的解決方法，根據(jù)IMNV基因組序列設(shè)計了兩組特異性引物，結(jié)果顯示測定的靈敏度為10個病毒拷貝，并觀察熔融曲線顯示單個特定峰以確定該引物的特異性。本試驗采用標(biāo)準(zhǔn)的引物設(shè)計原則，并借助生物信息學(xué)工具對革胡子鲇生長激素基因序列進(jìn)行分析，以確保引物的特異性。在引物設(shè)計中，我們注重引物的長度、GC含量和互補(bǔ)性，以確保PCR反應(yīng)的效率和特異性，優(yōu)化了退火溫度和cDNA濃度，通過PCR實驗對引物的效能進(jìn)行了評估。結(jié)果表明，設(shè)計的引物在PCR反應(yīng)中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，能夠可靠地擴(kuò)增革胡子鲇生長激素基因。革胡子鲇作為一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類，其生長激素基因的表達(dá)調(diào)控對其生長發(fā)育具有重要影響。因此，設(shè)計并評估了針對革胡子鲇生長激素基因的引物，對于深入了解其生長調(diào)控機(jī)制、改良養(yǎng)殖技術(shù)具有重要意義，為后續(xù)革胡子鲇生長激素基因的研究提供可靠的基礎(chǔ)。

3.2" 引物退火溫度的評估分析

引物的退火溫度對于擴(kuò)增特異性目標(biāo)序列至關(guān)重要：過低的退火溫度可能導(dǎo)致引物與非特異性目標(biāo)序列結(jié)合，從而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，影響PCR的特異性；反之，過高的退火溫度可能導(dǎo)致引物與模板結(jié)合的效率降低，PCR反應(yīng)的效率下降。引物的GC含量和長度是影響其退火溫度的重要因素：GC含量高的引物在較低的退火溫度下也能形成穩(wěn)定的引物模板復(fù)合物，因此其退火溫度一般較高；相反GC含量低的引物則需要較低的退火溫度才能形成穩(wěn)定的復(fù)合物。劉陽等為了探索巢式PCR非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生原因及消除方法，分別使用不同退火溫度組合與不同引物濃度組合進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)降低引物濃度或提高退火溫度均可一定程度地消除巢式PCR的非特異性擴(kuò)增；Su等探究一種羅非魚（Oreochromis spp）感染無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）的檢測方法，為保證其實驗的特異性和敏感度，對設(shè)計的三對特異性引物的退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，最終通過Ct值選定三組引物的退火溫度分別為55.8、56.7、60.4 ℃；Hickey等為了快速檢測海水中存在的鰻弧菌（Vibrio anguillarum），開發(fā)一種非探針、多重實時熒光定量PCR檢測方法，通過梯度反應(yīng)優(yōu)化退火溫度，溫度范圍為60～70 ℃，選定最佳退火溫度為65 ℃，并對PCR的退火和延伸時間進(jìn)行優(yōu)化，以5 s為間隔，篩選反應(yīng)時間為20～50 s，從而確定擴(kuò)增的最佳時間條件，縮短了反應(yīng)時間。在本試驗中選取與常規(guī)PCR退火溫度相近的三個溫度進(jìn)行qPCR退火溫度的優(yōu)化，確定了最適合的退火溫度（62 ℃），以保證引物的特異性和PCR反應(yīng)的效率。引物的退火溫度評估分析是PCR實驗中一個至關(guān)重要的步驟，通過合理選擇退火溫度，可以保證PCR反應(yīng)的特異性和效率，為后續(xù)研究提供了可靠的工具。

3.3" 引物擴(kuò)增效率的評估分析

引物擴(kuò)增效率的評估分析在PCR實驗中至關(guān)重要，它直接影響著PCR反應(yīng)的靈敏度和可靠性。擴(kuò)增曲線是評估引物擴(kuò)增效率的一個重要指標(biāo)，通過在不同模板濃度下進(jìn)行PCR反應(yīng)，并記錄PCR產(chǎn)物的累積量，可以繪制出擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增曲線的斜率反映了PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率，斜率越大，擴(kuò)增效率越高。同時，擴(kuò)增曲線的動態(tài)范圍也可以評估PCR反應(yīng)的靈敏度和線性范圍。在評估引物擴(kuò)增效率時，還需要考慮反應(yīng)條件的優(yōu)化：包括反應(yīng)體系的組成、引物的濃度和退火溫度等因素都會影響PCR反應(yīng)的效率，通過系統(tǒng)地優(yōu)化這些反應(yīng)條件，可以最大程度地提高引物的擴(kuò)增效率。蔣路園等對紅豆杉（Taxus wallichiana var. chinensis）TcERF基因qRT-PCR體系進(jìn)行構(gòu)建與優(yōu)化，根據(jù)TcERF基因序列設(shè)計、組合出3對引物，從qRT-PCR反應(yīng)體系、cDNA模板用量和引物用量等方面進(jìn)行優(yōu)化，分別篩選出該基因在5 μL小反應(yīng)體系及10、20 μL常用體系下的最佳組合，結(jié)果表明隨著體系的增加，擴(kuò)增效率也隨之增加。本試驗通過篩選合適的引物片段，優(yōu)化退火溫度，選擇cDNA稀釋倍數(shù)等發(fā)現(xiàn)GHF-GHR引物的擴(kuò)增效率為93.3%（在90%～105%之間），并且標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.982（R2值gt;0.980），證明本研究最終篩選的引物能用于待檢樣本GH基因表達(dá)的qPCR分析。引物擴(kuò)增效率的評估分析是PCR實驗中一個關(guān)鍵的步驟，通過合理選擇評估指標(biāo)和優(yōu)化反應(yīng)條件，可以有效地評估引物的擴(kuò)增效率，為可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖提供資料參考。

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Primer design and evaluation for quantitative PCR analysis of growth hormone geneexpression in Clarias gariepinus

LAN Yi1， HE Jinghui1， WANG Xiaomei1，2， WANG Qian1，2*

（1. College of Aquaculture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China；2. Key Laboratory of Aquatic- Ecology and Aquaculture of Tianjin， Tianjin 300384， China）

Abstract：This experiment focused on the design and evaluation of primers for growth hormone （GH） gene in Clarias gariepinus using fluorescence quantitative PCR （qPCR）. Five pairs of primers were synthesized， and the GHF-GHR primer pair was selected based on the results of conventional PCR electrophoresis. Subsequently， the GHF-GHR primer pair was evaluated for qPCR. The results indicated that the amplification curve of the GH gene fragment with the GHF-GHR primer pair showed a single peak， demonstrating good specificity of the primers. The amplification efficiency of the GHF-GHR primer pair was determined to be 93.3% based on the standard curve， with an R2 value of 0.982， indicating a high amplification efficiency of the primers. These results suggest that the GHF-GHR primer pair is suitable for qPCR analysis of GH gene expression in the test samples.

Key words：Clarias gariepinus; GH gene; primer design; qPCR; evaluate

（收稿日期：2024-04-13）