作者簡(jiǎn)介：吳冰（1986-），女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail：283863746@qq.com。

通訊作者：許建和（1976-），男，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料。E-mail：jianhexu218@163.com。

DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2024.05.004

摘" 要：為研究丁香酚慢性麻醉對(duì)紅鯽（Carassius auratus）血液生理及肝臟中應(yīng)激基因hsp70和hsp90mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響，試驗(yàn)設(shè)置丁香酚處理組和對(duì)照組，用15 mg/L丁香酚處理平均體質(zhì)量（61.9±3.66）g紅鯽12 h。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)12 h麻醉后，試驗(yàn)組紅鯽除游動(dòng)變緩?fù)?，其它行為表現(xiàn)正常，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；麻醉組紅鯽血液中皮質(zhì)醇含量、乳酸脫氫酶活力顯著下降，而血糖和K+、Na+濃度卻顯著上升。基因定量結(jié)果顯示，麻醉組紅鯽肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。綜上所述，15 mg/L丁香酚處理12 h內(nèi)對(duì)紅鯽未造成明顯損傷，可用于其保活運(yùn)輸。

關(guān)鍵詞：紅鯽（Carassius auratus）；丁香酚；血液生理；hsp70; hsp90

漁用麻醉劑因其成本低、使用方便，對(duì)魚(yú)類有著良好的鎮(zhèn)靜作用，可以有效減少魚(yú)類在運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)激反應(yīng)和新陳代謝，保證鮮活水產(chǎn)品的品質(zhì)，從而得到了廣泛應(yīng)用。近年來(lái)在市場(chǎng)上魚(yú)類用的麻醉劑被廣泛應(yīng)用于保持魚(yú)的生命活力，種類繁多，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了30多種不同的魚(yú)類用麻醉劑，其中較為常用的有丁香酚、MS-222、CO2和苯佐卡因等。

丁香酚是丁香油的主要成分，通過(guò)蒸餾丁香樹(shù)的花、莖和葉子提取而成的天然麻醉劑。丁香酚由于其高效、安全、價(jià)格低廉，且不會(huì)誘發(fā)魚(yú)體產(chǎn)生有毒及突變物質(zhì)，而被廣泛應(yīng)用于活魚(yú)運(yùn)輸、產(chǎn)卵和手術(shù)等養(yǎng)殖過(guò)程和科學(xué)試驗(yàn)中。目前國(guó)際上澳大利亞、日本等國(guó)已經(jīng)公開(kāi)批準(zhǔn)了丁香油/酚作為水產(chǎn)麻醉劑合法使用，國(guó)內(nèi)關(guān)于漁用麻醉劑立法還是空白。丁香酚用于魚(yú)類麻醉和活體運(yùn)輸目前已有較多報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)丁香酚可以降低魚(yú)體新陳代謝，減少應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)肝臟健康，提高機(jī)體免疫力。李寧等發(fā)現(xiàn)低劑量丁香酚可顯著降低大口黑鱸運(yùn)輸過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)。Liu等用25～30 mg/L丁香酚對(duì)黃顙魚(yú)進(jìn)行12 h模擬運(yùn)輸后未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。但丁香酚具有揮發(fā)性，在長(zhǎng)距離麻醉運(yùn)輸過(guò)程中其效用可能會(huì)降低。

紅鯽又被稱為金鯽魚(yú)或草金魚(yú)，由鯽（Carassius auratus）選育，屬鯉形目，是我國(guó)重要的觀賞魚(yú)類和魚(yú)類雜交育種親本來(lái)源。紅鯽在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常需要進(jìn)行長(zhǎng)距離活體運(yùn)輸，運(yùn)輸過(guò)程中由于捕撈、運(yùn)輸時(shí)間、運(yùn)輸量等應(yīng)激脅迫，極易造成紅鯽受傷甚至死亡，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。如何采取適當(dāng)措施，降低紅鯽運(yùn)輸應(yīng)激反應(yīng)，改善動(dòng)物福利，提高運(yùn)輸成活率目前已受到越來(lái)越多的關(guān)注。本文研究了丁香酚慢性麻醉對(duì)紅鯽血液中皮質(zhì)醇、葡萄糖（GLU）；乙酰膽堿（AChE）、溶菌酶（LZM）、乳酸脫氫酶（LDH）等酶活力；K+、Na+、Ca+、尿素氮（BUN）等無(wú)機(jī)物含量以及肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響，為丁香酚慢性麻醉用于紅鯽活魚(yú)運(yùn)輸?shù)陌踩蕴峁┰囼?yàn)依據(jù)。

1" 材料及方法

1.1" 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚(yú)購(gòu)自連云港市海州區(qū)金龍魚(yú)水族館，平均體質(zhì)量（61.9±3.66）g。丁香酚購(gòu)于國(guó)藥企業(yè)，含量 ≥98.5％，使用時(shí)先按V（丁香酚）∶V（酒精）=1∶9溶于酒精，靜置10 min后再溶于水。

1.2" 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

試驗(yàn)設(shè)置15 mg/L丁香酚麻醉組，一組加無(wú)水乙醇為對(duì)照組。試驗(yàn)開(kāi)始前停食24 h，挑選30尾健康個(gè)體，分成2組，5尾魚(yú)/組，每組3個(gè)重復(fù)。在塑料養(yǎng)殖箱中先加入30 L曝氣的淡水，用丁香酚母液將水體丁香酚濃度調(diào)成15 mg/L，然后放入試驗(yàn)魚(yú)，水溫在25～28 ℃，溶氧均大于5 mg/L。每隔0、1、2、4、6、8、10、12 h觀察紅鯽在麻醉狀態(tài)下的行為特征。試驗(yàn)開(kāi)始和12 h后時(shí)用肝素鈉（2 800 U/mL）潤(rùn)洗后的2 mL注射器從尾靜脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液，保存于-80 ℃。采血后解剖，取魚(yú)體肝臟，凍存于-80 ℃用于基因定量。

1.3" 血液生化指標(biāo)測(cè)定

血液生化指標(biāo)測(cè)定用南京建成生物工程試劑盒。取-80 ℃保存的血漿，用酶標(biāo)法測(cè)定皮質(zhì)醇濃度，葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖含量，比色法測(cè)定乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、溶菌酶（Lysozyme，LZM）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力，以及K+、Na+、Ca2+離子濃度和尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）濃度。

1.4" hsp70和hsp90mRNA表達(dá)定量

1.4.1" RNA提取及反轉(zhuǎn)錄" 參照動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)（TIANGEN，北京）提取總RNA，用超微量紫外分光光度計(jì)確定RNA濃度及OD值，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)（TIANGEN，北京）測(cè)定反轉(zhuǎn)錄。

1.4.2" 引物設(shè)計(jì)與合成" 紅鯽與鯽具有高同源性，根據(jù)NCBI公布的鯽hsp70（GenBank序列號(hào)為AB092839.2）、hsp90 （GenBank序列號(hào)為KT985291.1）和β-actin mRNA全序列（GenBank序列號(hào)為HQ267516.1），使用Primer 5.0設(shè)計(jì)q-RT-PCR引物：hsp70F，5'-ATGGAGGGAAGCCGAAAG-3'；hsp70R，5'-TGAAATAGGCAGGAACTGTGAT-3'；hsp90F，5'-GGCGTTGTGGACTCTGATGA-3'；hsp90R，5'-GGTGCCAAACTCCTTCCAGA-3'；β-actin F，5'-ATGCGGAAACTGGAAAGG-3'；β-actin R，5'-GAGGGCAGAGTGGTAGACG-3'。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4.3" 熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)差異" 采用SYBR Green（QIAGEN，上海）染料法，參照熒光定量說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)引物的特異性，挑選條帶單一且特異性好的引物進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。以不同濃度下紅鯽肝臟的cDNA為未知樣品模板，以β-actin為內(nèi)參基因，檢測(cè)hsp70和hsp70基因的相對(duì)表達(dá)量。熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBY Green Master （Mix） 10 μL；QN ROX Reference Dye 2 μL；上下游引物各0.6 μL；無(wú)菌水5.8 μL；cDNA模板1 μL，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。反應(yīng)程序：95 ℃、2 min；95 ℃、5 s；60 ℃、10 s，共40個(gè)循環(huán)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.5" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，經(jīng)SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)方差同質(zhì)性檢驗(yàn)后，使用單因方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性比較，顯著性水平為P＜0.05。

2" 結(jié)果

2.1" 丁香酚不同麻醉時(shí)間對(duì)紅鯽行為狀況的影響

丁香酚不同麻醉時(shí)間對(duì)紅鯽行為狀況的影響結(jié)果見(jiàn)表1。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)（0 h）， 對(duì)照組和試驗(yàn)組魚(yú)體運(yùn)動(dòng)活躍，應(yīng)激反應(yīng)劇烈，鰓蓋張合有力；經(jīng)15 mg/L丁香酚麻醉處理1 h后，魚(yú)體呈抖動(dòng)式游動(dòng)，少數(shù)魚(yú)體呈側(cè)翻趨勢(shì)，鰓蓋張合力度正常；2 h后，多數(shù)魚(yú)體有側(cè)翻現(xiàn)象，鰓蓋張合無(wú)力且無(wú)規(guī)律；4 h后，出現(xiàn)群聚現(xiàn)象，多數(shù)魚(yú)體側(cè)翻，存在浮頭現(xiàn)象；麻醉6 h后，多數(shù)魚(yú)體鰓蓋張合無(wú)力但是有規(guī)律，少部分有浮頭現(xiàn)象；8 h后，浮頭現(xiàn)象消失，大多數(shù)魚(yú)體成群在水箱底部，鰓蓋張合無(wú)力但有規(guī)律，無(wú)浮頭、側(cè)翻、游動(dòng)現(xiàn)象，外界環(huán)境變化時(shí)無(wú)較大應(yīng)激反應(yīng)。12 h后對(duì)照組和試驗(yàn)組均未出現(xiàn)魚(yú)體死亡現(xiàn)象。

2.2" 丁香酚慢性麻醉對(duì)紅鯽血液生化指標(biāo)影響

丁香酚麻醉對(duì)紅鯽血液中皮質(zhì)醇、葡萄糖和無(wú)機(jī)物濃度影響見(jiàn)表2。經(jīng)12 h麻醉后，紅鯽血液中皮質(zhì)醇含量顯著降低（P＜0.05）；葡萄糖、K+和Na+的含量顯著高于對(duì)照組（Plt;0.05），Ca2+和尿素氮BUN濃度兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

與對(duì)照組相比，丁香酚處理12 h后的紅鯽血液中乳酸脫氫酶活性顯著下降（P＜0.05）;而乙酰膽堿酯酶活力和溶菌酶活力均沒(méi)有顯著性差異（表3）。

2.3" 丁香酚麻醉對(duì)紅鯽肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對(duì)表達(dá)量影響

紅鯽經(jīng)15 mg/L丁香酚麻醉12 h后，肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加，且均明顯高于對(duì)照組（圖1）。但hsp90相對(duì)表達(dá)量增加更明顯，麻醉組相對(duì)表達(dá)量大約是對(duì)照組的7倍。

組間上標(biāo)字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。圖1" 丁香酚麻醉對(duì)紅鯽肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3" 討論

3.1" 丁香酚慢性麻醉對(duì)紅鯽行為影響

在活魚(yú)運(yùn)輸過(guò)程中，長(zhǎng)時(shí)間路途的劇烈晃動(dòng)會(huì)導(dǎo)致魚(yú)體產(chǎn)生較強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，甚至?xí)霈F(xiàn)死亡的現(xiàn)象。麻醉劑能有效地解決這一問(wèn)題，麻醉劑通過(guò)減緩緊張，可以使魚(yú)體運(yùn)動(dòng)量和生理變化變小，處于一種相對(duì)鎮(zhèn)靜的狀態(tài)，從而降低長(zhǎng)時(shí)間路途晃動(dòng)產(chǎn)生的碰撞損傷。本試驗(yàn)將紅鯽置于15 mg/L的丁香酚時(shí)，魚(yú)體均能達(dá)到相對(duì)鎮(zhèn)靜的狀態(tài)，均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，說(shuō)明丁香酚具有持久性和安全性。

3.2" 丁香酚麻醉對(duì)紅鯽血液生化指標(biāo)影響

當(dāng)魚(yú)類在受到麻醉等脅迫時(shí)，會(huì)刺激其下丘腦-垂體-腎間軸，合成并釋放頭腎細(xì)胞皮質(zhì)醇激素。所以魚(yú)類的應(yīng)激程度可以用血液中皮質(zhì)醇的濃度來(lái)衡量。本試驗(yàn)條件下，運(yùn)輸12 h后的麻醉組中皮質(zhì)醇的濃度顯著低于對(duì)照組，表明在紅鯽運(yùn)輸12 h后，丁香酚可以緩解魚(yú)體的應(yīng)激反應(yīng)，在許氏平鲉和歐洲鱸的報(bào)道中有類似結(jié)果。血液中的葡萄糖受攝食狀態(tài)和環(huán)境條件等因素的干擾，應(yīng)激過(guò)程中血糖增加，通常是由于動(dòng)物遭受的突發(fā)刺激需要更多充足的能量來(lái)應(yīng)對(duì)。在本試驗(yàn)中，12 h后的丁香酚麻醉組中的葡萄糖含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），這是由于麻醉應(yīng)激能夠加快糖原分解的速率和代謝消耗的不平衡。

硬骨魚(yú)類血清中Na+、Ca2+、K+的正常范圍分別是120～200 mmol/L、5 mmol/L以下、15 mmol/L。在本試驗(yàn)中，紅鯽血清中離子水平均處于上述范圍中。在正常范圍內(nèi)離子水平的升高，不但能提高及加快魚(yú)體代謝速率和生長(zhǎng)，而且對(duì)魚(yú)體吸收營(yíng)養(yǎng)具有改良狀態(tài)。紅鯽在模擬運(yùn)輸12 h后，麻醉組血清中K+和Na+濃度顯著上升，而Ca2+濃度無(wú)顯著差異，與MS-222對(duì)羅非魚(yú)的研究結(jié)果相似。麻醉劑的使用會(huì)對(duì)魚(yú)體腎臟功能有影響，通常用血液中尿素氮的含量作為麻醉劑對(duì)腎功能影響的判斷依據(jù)。有研究表明，MS-222可以降低俄羅斯鱘幼魚(yú)中尿素氮的含量，但本試驗(yàn)的麻醉組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，這可能是由于丁香酚濃度太低或者個(gè)體間的差異所導(dǎo)致。

乙酰膽堿是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其活性的降低會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類的呼吸和運(yùn)動(dòng)紊亂。溶菌酶是一種堿性酶，能夠水解細(xì)菌的細(xì)胞壁，并使之溶解，在體內(nèi)起到對(duì)機(jī)體的防御作用，可作為免疫指標(biāo)。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，麻醉組中乙酰膽堿和溶菌酶的活性與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異，表明15 mg/L的丁香酚麻醉紅鯽12 h后不影響其運(yùn)動(dòng)和免疫等功能。王彩霞在加州鱸中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。乳酸脫氫酶是機(jī)體參與能量代謝的一種酶，能夠催化丙酮酸和乳酸的相互轉(zhuǎn)化。有研究表明，魚(yú)在缺氧或者劇烈運(yùn)動(dòng)后，體內(nèi)的乳酸含量會(huì)迅速升高，因此乳酸脫氫酶的活性也升高。但是在本試驗(yàn)中，運(yùn)輸12 h后麻醉組中的乳酸脫氫酶活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），這可能是因?yàn)槎∠惴幽軌蚪档汪~(yú)類應(yīng)激反應(yīng)，使其處于一種鎮(zhèn)靜狀態(tài)，從而導(dǎo)致乳酸脫氫酶的活性降低。

3.3" 丁香酚麻醉對(duì)肝臟中hsp70和hsp90mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

熱休克蛋白（HSPs）是一類重要的非特異性細(xì)胞保護(hù)蛋白，通常在機(jī)體受到應(yīng)激源刺激后產(chǎn)生，它可增加機(jī)體細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、提升機(jī)體免疫水平。有報(bào)道表明血液中皮質(zhì)醇水平下降可誘導(dǎo)莫桑比克羅非魚(yú)（Oreochromis mossambicu）肝臟中熱激蛋白基因上調(diào)表達(dá)。本研究中紅鯽經(jīng)丁香酚麻醉后血液中皮質(zhì)醇水平明顯下降，而肝臟中熱休克蛋白基因表達(dá)量明顯增加，這表明丁香酚麻醉可通過(guò)降低魚(yú)體血液中皮質(zhì)醇含量，來(lái)誘導(dǎo)肝臟增加hsp70和hsp90mRNA表達(dá)量，為魚(yú)體提供保護(hù)作用。相似的結(jié)果在高體鰤和斜帶髭鯛中也有報(bào)道。但本研究中紅鯽經(jīng)丁香酚麻醉后肝臟hsp90相對(duì)表達(dá)量增加較hsp70更顯著，這與Liu等在黃顙魚(yú)中的研究結(jié)果剛好相反，推測(cè)原因可能在紅鯽體內(nèi)hsp90比hsp70更易被誘導(dǎo)表達(dá)，是其應(yīng)對(duì)應(yīng)激脅迫的主要熱休克蛋白。相似結(jié)果在Salmo salar亦有報(bào)道，表明麻醉劑誘導(dǎo)魚(yú)體熱休克蛋白基因家族表達(dá)方式存在種間差異。

4" 結(jié)論

在紅鯽模擬運(yùn)輸過(guò)程中，用15 mg/L的丁香酚進(jìn)行麻醉，可顯著降低魚(yú)體應(yīng)激反應(yīng)，經(jīng)12 h模擬運(yùn)輸后，未發(fā)現(xiàn)對(duì)魚(yú)體行為和血液生理造成不良影響，可用于紅鯽長(zhǎng)時(shí)間活體運(yùn)輸。

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The effects of chronic eugenol anesthesia on the blood physiology and the expression levels of hsp70 and hsp90 mRNA in the liver of red crucian carp

WU Bing， DONG Xiujin， XU Yili， XU Jianhe

（Jiangsu Ocean University， School of Marine Science and Fisheries， Lianyungang 222005， China）

Abstract：To investigate the effects of chronic anesthesia with eugenol on the blood physiology and expression of stress genes hsp70 and hsp90 in the liver of red crucian carp（Carassius auratus）， in experimental group， red crucian carps in an average body weight of （61.9 ± 3.66） g were exposed to 15 mg/L eugenol for 12 h and fish without eugenol treatment was used as control group. The experimental results showed that after 12 h anesthesia， no dead fish were observed and all fish exhibited normal behavior except for slower swimming. Compared with the control group， the blood cortisol content and lactate dehydrogenase activity of the fish subjected to eugenol treatment significantly decreased， while blood glucose content and K+， Na+ concentrations significantly increased. The gene expression quantification results showed that the relative expression levels of hsp70 and hsp90 in the liver of fish in the eugenol treatment group were significantly higher than those in the control group. In summary， 15 mg/L eugenol treatment did not cause significant damage to red crucian carp within 12 h and can be used for its live transportation.

Key words： red crucian carp（Carassius auratus）; eugenol; blood physiology; hsp70; hsp90

（收稿日期：2024-04-07）