俞志軍 張桂娟 陳麗新 楊森林 崔玉祥

摘要 目的： 探討芹菜素通過調(diào)控窖蛋白.1（Caveolin.1）對慢性心力衰竭（CHF）大鼠血管緊張素1.7（Ang1.7）及左室舒張功能的機制研究。 方法： 按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)（Sham）組、CHF組、芹菜素組、Caveolin.1組及聯(lián)合組，每組10只，除Sham組外均建立CHF大鼠模型。建模后24 h，芹菜素組大鼠腹腔注射2 mg/kg的芹菜素，Caveolin.1組腹腔注射1.2 mg/kg的Caveolin.1質(zhì)粒的脂質(zhì)體溶液，聯(lián)合組大鼠腹腔注射2 mg/kg的芹菜素及1.2 mg/kg的Caveolin.1質(zhì)粒的脂質(zhì)體溶液，Sham組及CHF組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。比較各組大鼠心臟收縮及舒張功能指標、血清因子水平；蘇木精.伊紅（HE）染色檢測心肌組織病理形 態(tài)；電鏡觀察心房超微結(jié)構(gòu)；免疫組化檢測心肌組織血管生成情況；蛋白免疫印跡檢測心肌組織Caveolin.1、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF.1）、 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白水平。 結(jié)果： CHF組與Sham組比較， 大鼠左心室射血分數(shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、Ang1.7 及Caveolin.1蛋白、HIF.1蛋白、VEGF蛋白降低，左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）、 血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）、腎素活性（PRA）升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P ＜0.05）； 芹菜素組、Caveolin.1組與CHF組比較，大鼠LVEF、LVFS、Ang1.7、Caveolin.1蛋白、HIF.1蛋白、VEGF蛋白及血管數(shù)目升高，LVESD、LVEDD、LVEDV、LVESV、AngⅡ、ALD、PRA降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P ＜0.05）；芹菜素組與Caveolin.1組各指標比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（ P ＞0.05）；聯(lián)合組與芹菜素組及

Caveolin.1組

各指標比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P ＜0.05）。 結(jié)論： 芹菜素對慢性心力衰竭大鼠心臟舒張及收縮功能具有改善作用，并可通過上調(diào)Ang1.7改善心肌重塑從而保護心臟，其機制可能與激活Caveolin.1表達而增加心肌新生血管相關(guān)。

關(guān)鍵詞 ?慢性心力衰竭；芹菜素；心功能；血管緊張素1.7；窖蛋白.1

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.09.009

Effects of Apigenin Regulating Caveolin.1 on Angiotensin 1.7 and Left Ventricular Diastolic Function in Rats with Chronic Heart Failure

YU Zhijun， ZHANG Guijuan， CHEN Lixin， YANG Senlin， CUI Yuxiang

Tangshan Hongci Hospital， Tangshan 063000， Hebei， China

Corresponding Author ?ZHANG Guijuan， E.mail： tshcyy_yzj@126.com

Abstract Objective： To investigate the effect of apigenin regulating Caveolin.1 on angiotensin 1.7（Ang1.7） and left ventricular diastolic function in rats with chronic heart failure. ?Methods： According to random number table method，the rats were divided into Sham group，chronic heart failure（CHF） group，apigenin group，Caveolin.1 group and combined group with 10 rats in each group.CHF rat models were established except Sham group.24 h after modeling，the apigenin group rats were intraperitoneally injected 2 mg/kg apigenin，Caveolin.1 group was intraperitoneally injected with 1.2 mg/kg liposome solution of Caveolin.1 plasmid，rats in the combined group were intraperitoneally injected with 2 mg/kg apigenin and 1.2 mg/kg liposome solution of Caveolin.1 plasmid，rats in Sham group and CHF group were intraperitoneally injected with equal volume of normal saline.Cardiac systolic and diastolic function indexes and serum factor levels were compared among all groups.Hematoxylin.eosin（HE） staining was used to detect the pathological morphology of myocardium.The ultrastructure of atrium was observed by electron microscope.Myocardial angiogenesis was detected by protein immunohistochemistry.The protein levels of hypoxia.inducing factor 1（HIF.1），Caveolin.1，vascular endothelial growth factor（VEGF） were detected by Western Blot. ?Results： Compared with Sham group，left ventricular ejection fraction（LVEF），left ventricular short axis shortening rate（LVFS），Ang1.7，Caveolin.1，HIF.1，VEGF，and vascular number decreased in CHF group（ P ＜0.05）.Compared with Sham group，left ventricular end.diastolic diameter（LVEDD），left ventricular end.systolic diameter（LVESD），left ventricular end.diastolic volume（LVEDV），left ventricular end.systolic volume（LVESV），angiotensin Ⅱ（AngⅡ），aldosterone（ALD） and renin activity（PRA） increased in CHF group（ P ＜0.05）.Compared with CHF group，LVEF，LVFS，Ang1.7，Caveolin.1，HIF.1，VEGF，and the number of blood vessels in apigenin group and Caveolin.1 group increased，LVESD，LVEDD，LVEDV，LVESV，AngⅡ，ALD and PRA decreased（ P ＜0.05）.There were no significant differences between apigenin group and Caveolin.1 group（ P ＞0.05）.Compared with apigenin group，combined group and Caveolin.1 group，there were statistically significant differences in all indexes（ P ＜0.05）. ?Conclusion： Apigenin can improve cardiac diastolic and systolic functions in rats with chronic heart failure，and can improve myocardial remodeling and protect the heart by upregulating Ang1.7.The mechanism may be related to the activation of Caveolin.1 expression and the increase of myocardial angiogenesis.

Keywords ?chronic heart failure; apigenin; cardiac function; angiotensin 1.7; Caveolin.1

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多種心臟疾病發(fā)展至終末出現(xiàn)的疾病 ?［1］ 。CHF主要為心肌結(jié)構(gòu)及功能的改變，5年死亡率高達30% ?［2］ 。心肌重塑是CHF發(fā)生發(fā)展過程中的主要病機，在此過程中神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)因子血管緊張素（Ang）Ⅱ可參與CHF發(fā)生的全過程。Ang1.7是血管緊張素的成員之一，與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）形成復(fù)合物而抑制心肌重塑，改善心臟功能 ?［3］ 。心臟的最基本作用為泵血，維持機體組織器官血氧供應(yīng)，但CHF發(fā)生時泵血功能大幅度降低，心肌舒張、收縮功能障礙，損傷心肌組織的同時增加心臟失代償狀態(tài)，進一步促進CHF發(fā)生。因此，調(diào)節(jié)心室舒張及收縮功能障礙對于改善疾病具有重要作用。

胞膜窖（caveolae）是心肌細胞膜上存在的一類結(jié)構(gòu)，首個發(fā)現(xiàn)的蛋白為窖蛋白.1（Caveolin.1）。研究表明，Caveolin.1在心臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，當敲除Caveolin.1基因時會增加心肌肥大、心力衰竭及擴張型心肌病等的發(fā)生風險，因此，Caveolin.1可作為緩解上述疾病損傷的干預(yù)靶點之一 ?［4］ 。研究表 明，Caveolin.1缺失小鼠出現(xiàn)擴張型心肌病，Caveolin.1 表達降低可誘發(fā)心肌梗死，其缺失后信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）上調(diào)可使細胞周期蛋白（cyclin）D1、D3表達上調(diào)而加重心肌損傷 ?［5］ 。芹菜素是黃酮類化合物，在自然界廣泛分布，可發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒及抗氧化應(yīng)激的作用。另有研究表明，芹菜素可以降低心血管疾病的發(fā)生，具有心肌保護作用 ?［6］ 。在缺氧心肌細胞中，采用芹菜素預(yù)處理后可通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)B淋巴細胞瘤.2基因（Bcl.2）及Bcl.2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）而抑制心肌細胞凋亡 ?［7］ 。本研究探討芹菜素調(diào)控Caveolin.1對CHF大鼠Ang1.7及左室舒張功能的機制研究，為CHF疾病的用藥選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague.Dawley成年雄性大鼠55只購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心，合格證號：SCXK（京）2021.0009， 體質(zhì)量240～260 g，鼠齡4～5周。每籠5只，溫度23 ℃ 左右，濕度50%左右，黑夜白晝交替循環(huán)，自由飲水，標準顆粒飼料進食飼養(yǎng)。實驗前，所有大鼠適應(yīng)環(huán)境1周，嚴格按照動物使用指南進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

芹菜素［阿拉丁試劑（上海）有限公司］；pCDNA3.1（＋）Caveolin.1（南華大學(xué)藥物藥理研究所贈）；Caveolin.1抗體、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體及缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF.1）抗體（美國Abcam公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白試劑盒（天津金克隆生物技術(shù)有限公司）；甘油醛.3.磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（圣克魯斯生物有限公司）；蘇木精.伊紅（HE）試劑盒（湖北康迪斯化工有限公司）；低溫高速離心機（河北慧采科技有限公司）；S80彩色多普勒超聲診斷儀（大為醫(yī)療有限公司）；顯微鏡（蘇州景通儀器公司）；自動生化分析儀（Au5400，Beckman Coulter Inc.，Massachusetts，CA，USA）；普通顯微鏡（Olympus，Japan）；蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）；D700 LAB彩超診斷儀（飛依諾科技）。

1.3 CHF動物模型的建立

參考文獻［8］建立心力衰竭動物模型，建模前對所有大鼠均采用S80彩色多普勒超聲診 斷儀進行心臟檢查，確保心功能正常。采用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 麻醉大鼠后，連接小動物呼吸機，在第3肋和第4肋間分離皮膚后剪開心包，采用6.0絲線結(jié)扎左側(cè)心耳及動脈圓錐正下方2 mm處，后縫合皮膚，待大鼠自主呼吸后撤掉呼吸機，連續(xù)3 d注射40×10 4 U的青霉素。選取10只大鼠作為假手術(shù)（Sham）組，Sham組大鼠僅切口穿線不結(jié)扎。4周后，當大鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動量下降、皮毛粗糙及飲食飲水減少，進行心臟超聲檢查，以左心室射血分數(shù)（LVEF）＜60%為建模成功，最終因感染導(dǎo)致死亡5只，共有40只大鼠建模成功。

1.4 分組及干預(yù)方法

將造模成功的40只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為CHF組、芹菜素組、Caveolin.1組及聯(lián)合組，每組10只。建模成功后，芹菜素組大鼠腹腔注射2 mg/kg的芹菜素 ?［9］ ，Caveolin.1組參考文獻［10］腹腔 注射1.2 mg/kg的Caveolin.1質(zhì)粒的脂質(zhì)體溶液［將pCDNA3.1 （＋）Caveolin.1與lipofectamine ?TM 2000稀釋，按1∶3靜置4 min，混合，靜置20 min］；聯(lián)合組大鼠腹腔注射2 mg/kg的芹菜素及1.2 mg/kg的Caveolin.1質(zhì)粒的脂質(zhì)體溶液；Sham組及CHF組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

1.5 心臟收縮及舒張功能指標

干預(yù)24 h后，采用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉，采用D700 LAB彩超診斷儀心動圖檢查，頻率為9 MHz，深度為4 cm，記錄大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）、LVEF、左心室短軸縮短率（LVFS）。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清因子水平

干預(yù)24 h后，各組隨機處死5只大鼠，采集主動脈血5 mL，采用高速冷凍離心機對外周血按照3 000 r/min離心10 min，保留血清，ELISA試劑盒檢測腎素活性（PRA）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）以及醛固酮（ALD）、Ang1.7水平，嚴格按照試劑盒操作進行，然后通過標準曲線計算含量。

1.7 HE染色檢測心肌組織病理形態(tài)

干預(yù)24 h后，取各組剩余的5只大鼠，麻醉處死，分離心臟切片后液氮保存。心肌組織放入10%的多聚甲醛固定，切片4 μm，放入37 ℃復(fù)溫15 min，二苯甲脫蠟后按照100%、95%、85%、75%乙醇進行逐層脫水，蘇木精染色10 min，1%鹽酸處理，伊紅復(fù)染， 100%、95%、85%、75%乙醇脫水，封片后觀察組織 形態(tài)。

1.8 電鏡觀察心房超微結(jié)構(gòu)

左心房組織采用3%的戊二醛固定后，采用醋酸 雙氧鈾.檸檬酸鉛進行組織染色，采用日本電子 JEM.1200EX透射電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)，電壓為70 kV，倍數(shù)為1 000～20 000。

1.9 免疫組化檢測心肌組織血管生成情況

取各組大鼠心肌組織，用二甲苯進行兩次脫蠟，每次20 min，再用乙醇進行梯度浸泡水化，沖凈并擦干后用過氧化氫溫室孵育10 min，強磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，用檸檬酸鹽緩沖液進行微波熱修復(fù)，按說明書用封閉液稀釋一抗（1∶200），加入稀釋的CD ?31 一抗，4 ℃冰箱過夜后洗膜；加入稀釋的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗（1∶200），37 ℃水浴30 min；洗膜后，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進行顯色，PBS洗滌3次后用蘇木素復(fù)染后中性樹膠封片，用DAB處理樣 本，在400倍視野下觀察計算隨機5個視野中血管 數(shù)目。

1.10 蛋白免疫印跡檢測心肌組織Caveolin.1、HIF.1、VEGF蛋白水平

心肌組織采用PBS沖洗后切碎，加入1 mL細胞裂解液，10 000×g，4 ℃離心5 min，取上清液，加入樣孔中，采用BCA法檢測總蛋白濃度，每孔上樣蛋白量 20 μg，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS.PAGE） 凝膠電泳。轉(zhuǎn)印緩沖液配制好后放入4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷，然后全部轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜 （PVDF）上，加入脫脂奶粉，全程封閉1 h。加入一抗Caveolin.1 （1∶100）、VEGF（1∶200）及HIF.1（1∶500），TBS.吐溫20（TTBS）漂洗3次，每次10 min；4 ℃過夜，加入羊抗兔 IgG二抗（1∶2 500），電化學(xué)發(fā)光法（ECL） 系統(tǒng)JY.Clear分析蛋白相對表達量。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（ x ?± s ）表示，組間兩兩比較采用LSD. t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心臟收縮、舒張功能比較

與Sham組比較，CHF組大鼠LVEF、LVFS降低，LVESD、LVEDD、LVEDV及LVESV升高（ P ＜0.05）；與CHF組比較，芹菜素組及Caveolin.1組大鼠LVEF、LVFS升高，LVESD、LVEDD、LVEDV及LVESV降低（ P ＜0.05）；芹菜素組與Caveolin.1組上述指標比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P ＞0.05）；與芹菜素組及Caveolin.1組比較，聯(lián)合組大鼠LVEF、LVFS升高，LVESD、LVEDD、LVEDV及LVESV降低（ P ＜0.05）。詳見表1。

2.2 各組大鼠血清AngⅡ、ALD、PRA、Ang1.7水平比較

與Sham組比較，CHF組大鼠Ang1.7降低，ALD、AngⅡ、PRA升高（ P ＜0.05）；與CHF組比較，芹菜素組及Caveolin.1組大鼠Ang1.7升高，AngⅡ、ALD、PRA降低（ P ＜0.05）；芹菜素組與Caveolin.1組上述指標比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P ＞0.05）；與芹菜素組及 Caveolin.1組比較，聯(lián)合組大鼠Ang1.7升高，AngⅡ、 ALD、PRA降低（ P ＜0.05）。詳見表2。

2.3 HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)

Sham組大鼠心肌細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)完整，未見壞死。CHF組心肌細胞排列紊亂且形態(tài)大小各異，心肌纖維化加重且炎癥反應(yīng)劇烈。芹菜素組及Caveolin.1組大鼠心肌紊亂情況較CHF組顯著改善，炎癥反應(yīng)緩解，聯(lián)合組改善程度優(yōu)于芹菜素組及Caveolin.1組。詳見圖1。

2.4 電鏡觀察心房超微結(jié)構(gòu)

Sham組大鼠心肌組織線粒體肌原纖維束間分布均勻且結(jié)構(gòu)完好，CHF組大鼠心肌組織線粒體肌原纖維束間形態(tài)改變呈現(xiàn)不規(guī)則及變大趨勢，芹菜素組及Caveolin.1組線粒體肌原纖維束間呈現(xiàn)輕度腫脹且單細胞膜完整性較好，聯(lián)合組肌原纖維束間呈現(xiàn)板層狀，腫脹顯著改善。詳見圖2。

2.5 免疫組化檢測心肌組織血管生成

CHF組與Sham組血管生成數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ t ＝0.075， P ＝0.941）；與CHF組比較，芹菜素組及Caveolin.1組大鼠心肌組織血管生成數(shù)目增多（ P ＜0.05）；芹菜素組與Caveolin.1組血管生成數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P ＞0.05）；與芹菜素組及Caveolin.1組比較，聯(lián)合組大鼠心肌組織血管生成數(shù)目增多（ P ＜0.05）。詳見圖3、圖4。

2.6 ?蛋白免疫印跡法檢測心肌組織Caveolin.1、HIF.1、 VEGF水平

與Sham組比較，CHF組大鼠Caveolin.1、HIF.1、VEGF降低（ P ＜0.05）；與CHF組比較，芹菜素組及 Caveolin.1組大鼠Caveolin.1、HIF.1、VEGF升高 （ P ＜0.05）；芹菜素組與Caveolin.1組上述指標比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（ P ＞0.05）；與芹菜素組比較，聯(lián)合組大鼠Caveolin.1、HIF.1、VEGF升高（ P ＜0.05）。詳見表3、圖5。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，CHF大鼠LVEF、LVFS降低，LVESD、LVEDD、LVEDV及LVESV升高，芹菜素治療后可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)狀，認為芹菜素可以改善CHF大鼠心功能。心力衰竭時，左房壓力增高、二尖瓣相對關(guān)閉不全，加重心肌損傷及心臟射血功能減弱，導(dǎo)致心功能減退 ?［11］ 。芹菜素屬于一種天然的無毒副作用的黃酮類化合物，藥理活性豐富，在保護心腦血管的同時還具有抗腫瘤作用 ?［12］ 。研究顯示，CHF發(fā)生發(fā)展時氧化應(yīng)激程度增加，促使心肌細胞電生理、收縮、舒張功能障礙，影響心臟功能 ?［13］ 。

在心肌缺血再灌注模型大鼠中已經(jīng)證實芹菜素具有心臟保護作用，同時芹菜素也具有較強的抗氧化作用，認為其可以通過抑制脂質(zhì)過氧化損傷心肌細胞，改善心臟功能 ?［14］ 。本研究結(jié)果證實，CHF組大鼠Ang1.7降低，AngⅡ、ALD、PRA升高，芹菜素治療后Ang1.7升高，AngⅡ、ALD、PRA降低，說明芹菜素可以增加心肌組織Ang1.7而減少心肌重塑。心力衰竭發(fā)生過程中Toll樣受體（TLR）4與髓樣分化因子（MyD）88結(jié)合后使得核因子（NF）.κB活化，炎性細胞因子得以釋放，心室重塑加重。芹菜素可減輕阿霉素導(dǎo)致的心肌損傷，其機制與抑制TLR4表達相關(guān)。另有研究表明，芹菜素能增加心肌組織抗氧化能力并可降低血脂水平，還可以抑制Ang.Ⅱ水平而發(fā)揮抗心肌纖維化的作用 ?［15］ 。本研究結(jié)果顯示，CHF組大鼠血管新生數(shù)目減少，芹菜素干預(yù)后血管新生數(shù)目升高，說明芹菜素可以加快心肌組織血管新生，其機制可能與激活Caveolin.1、HIF.1、VEGF蛋白相關(guān)。

Caveolin.1在細胞膜上獨立的區(qū)域，參與多種生理過程，在心血管系統(tǒng)中含量豐富。Caveolin.1表達缺陷的動物模型中，心血管系統(tǒng)顯現(xiàn)出明顯的異常，如動脈粥樣硬化、心肌肥厚、平滑肌細胞增殖等，證明Caveolin.1具有重要的生理功能。Caveolin.1可參與細胞信號傳導(dǎo)及血管生成，VEGF是血管生成的強力促進劑，可存在內(nèi)皮細胞的Caveolin中，但是當敲除Caveolin.1基因，血管功能降低，VEGF作用減弱，說明Caveolin.1是血管生成的關(guān)鍵 ?［16］ 。Caveolin.1可促血管生成并加快缺氧組織細胞功能的恢復(fù)，在心肌纖維化大鼠中其表達降低，Caveolin.1過表達后可促血管生成而抑制大鼠心肌纖維化 ?［17］ 。本研究結(jié)果表明，CHF組大鼠Caveolin.1、HIF.1、VEGF蛋白降低，芹菜素干預(yù)后表達升高，證實芹菜素可以加快血管新生，改善心肌組織缺血損傷，進而緩解病情。

綜上所述，芹菜素對慢性心力衰竭大鼠心臟舒張及收縮功能具有改善作用，并可通過上調(diào)Ang1.7而改善心肌重塑，保護心臟，研究機制可能與激活Caveolin.1表達而增加心肌血管新生相關(guān)。

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（收稿日期：2022.11.07）

（本文編輯 鄒麗）