魏澤坤 楊雨潔 劉雙 王燕 董紅敬 劉春梅

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20230082

收稿日期：2023-05-12

基金項目：濟南市新高校二十條（202228020）

作者簡介：魏澤坤（1999—），女，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合周圍血管病學。E-mail：weizekun333@163.com

*通信作者，劉春梅（1971—），女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合周圍血管病學。E-mail：lcmsyw@163.com

摘要：基于GEO（gene expression omnibus）數(shù)據(jù)庫結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接，從分子水平逆向挖掘具有抗肝癌活性的中藥。通過GEO、GeneCards、OMIM和TTD等疾病靶點數(shù)據(jù)庫獲取肝癌的重要靶點。利用STRING平臺獲取核心靶點，結(jié)合TCMIP（integrative pharmacology-based research platform of traditonal Chinese medicine）和TCMID（traditional Chinese medicine integraive database）數(shù)據(jù)庫篩選核心成分，采用TCMSP（traditonal Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform）數(shù)據(jù)庫篩選核心中藥，通過分子對接和細胞實驗驗證篩選結(jié)果。從疾病靶點數(shù)據(jù)庫得到398個肝癌的重要靶點，進一步篩選出8個核心靶點、11個核心成分和1味核心中藥葛根；分子對接結(jié)果表明葛根的3個核心成分（槲皮素、黃岑素、豆甾醇）可以與部分核心靶點（CDK1、CDC20）自發(fā)地結(jié)合；細胞實驗結(jié)果表明葛根提取物可以有效抑制肝癌細胞HepG2的增殖。該結(jié)果可以為葛根的研究與開發(fā)提供參考，為葛根抗肝癌活性成分的挖掘提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：葛根；抗肝癌活性成分；網(wǎng)絡(luò)藥理學；分子對接；GEO數(shù)據(jù)庫

中圖分類號：R285??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：1002-4026（2024）03-0039-09

開放科學（資源服務(wù)）標志碼（OSID）：

Reverse mining of Chinese medicine for intervention of liver cancer

based on GEO database combined with network pharmacology

and molecular docking technology

WEI Zekun1，2， YANG Yujie1，2， LIU Shuang3， WANG Yan3， DONG Hongjing3， LIU Chunmei1，2*

（1. School of Traditional Chinese Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China;

2. Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China; 3. Shandong Analysis

and Test Center， Qilu University of Technology （Shandong Academy of Science）， Jinan 250014， China）

Abstract∶Based on the gene expression omnibus（GEO） database， combined with network pharmacology and molecular docking technology， we aimed to conduct reverse network pharmacology research from a molecular level to identify Chinese medicine with anti-hepatocellular carcinoma （HCC） activity. Relevant targets of HCC were acquired from databases including GEO， GeneCards， Online Mendelian Inheritance in Man， and Therapeutic Target Database. The core targets were identified using the String platform， and the core constituents were screened from the TCMIP（integrative pharmacology-based research platform of traditonal

Chinese medicine） and TCMID（traditional Chinese medicine

integraive database） databases. The core traditional Chinese medicine （TCM） was ultimately selected through the traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform（TCMSP）.? Molecular docking technology and cellular experiments were employed to identify relevant screening results. A total of 398 important targets for HCC were found from the disease target databases， from which 8 core targets， 11 core constituents， and 1 core TCM （Puerariae Lobatae Radix） were further screened. Molecular docking results showed that three core constituents （quercetin， genistein， and coumestrol） from kudzu root could spontaneously bind with some core targets （CDK1 and CDC20）， and cell experiments demonstrated that the extract from Puerariae Lobatae Radix could effectively inhibit the proliferation of HepG2 liver cancer cells. This study may provide a reference for the research and development of Puerariae Lobatae Radix and offer a theoretical basis for the discovery of its anti-HCC active ingredients.

Key words∶Puerariae Lobatae Radix; antiliver cancer activity; network pharmacology; molecular docking; gene expression omnibus

肝癌是最常見的腫瘤之一，常常伴隨著不良預后和高死亡率，嚴重威脅患者的生命健康［1］?，F(xiàn)有的治療方法包括手術(shù)、化療和放療等，已取得了一定的進展，但治療效果仍然不盡人意［2］。中藥作為一種重要的中醫(yī)藥治療手段，近年來受到越來越多的關(guān)注，大多數(shù)中藥的副作用低、效果好，具有增強免疫力、改善患者生活質(zhì)量和延長患者生存期的優(yōu)勢，已成為我國綜合治療肝癌方案的組成部分之一［3］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是一種以生物學理論知識為背景，結(jié)合多種計算機輔助分析技術(shù)，進而構(gòu)建成分-靶點以及靶點-靶點的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，實現(xiàn)成分直接或間接作用于靶點的可視化技術(shù)。分子對接是一種廣泛用于研究配體和受體分子間相互作用的分子模擬方法［4］。網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合分子對接技術(shù)，為中藥的潛在作用機制以及核心成分的挖掘研究提供了新工具［5-6］。GEO（gene expression omnibus）數(shù)據(jù)庫是目前全球最大的基因芯片數(shù)據(jù)公共數(shù)據(jù)庫之一，收集了來自全球的數(shù)十萬份基因芯片數(shù)據(jù)，其中包含大量的肝癌相關(guān)數(shù)據(jù)［7］。

本研究旨在利用GEO數(shù)據(jù)庫的肝癌數(shù)據(jù)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)，逆向挖掘?qū)Ω伟┚哂懈深A作用的中藥（研究思路見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1），以期為抗肝癌活性新藥的發(fā)現(xiàn)與研究提供參考，為中藥新用途的研究與開發(fā)提供思路。

1? 材料與方法

1.1? 實驗試劑與儀器

精密稱取20 g葛根飲片于250 mL圓底燒瓶中，分別加入100 mL純水和100 mL乙醇溶液（75%），加熱回流提取2 h后，將提取液離心、濃縮、凍干，分別得到葛根水提取物和葛根醇提取物。DMEM 培養(yǎng)基（Gibco公司，批號8122638），PBS緩沖液（Solarbio公司，批號GP21100051207），胰蛋白酶（Solarbio公司，批號20220917），胎牛血清（奧普賽生物科技有限公司，批號20230208）。

HF90氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力康公司），Spark多功能微孔板檢測儀（瑞士TECAN公司）。

1.2? 肝癌疾病靶點庫的建立

通過3個疾病靶點數(shù)據(jù)庫，包括GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）及TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/），根據(jù)檢索詞“l(fā)iver cancer”，檢索肝癌的疾病靶點，檢索結(jié)果整合于Excel表中，建立肝癌相關(guān)的潛在疾病靶點數(shù)據(jù)集。基于關(guān)鍵詞“l(fā)iver cancer”檢索GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取正常組和肝癌組之間的表達矩陣（GSE36376、GSE60502、GSE84005、GSE121248），通過Excel軟件進行分析篩選，以對數(shù)倍數(shù)差異（logarithm of fold change， |log FC|）＞2且Padj＜0.05為條件篩選肝癌的差異表達基因?；赩enny工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index2.0.2.html），計算肝癌的潛在靶點數(shù)據(jù)集及肝癌的差異表達基因的重復靶點，建立肝癌的重要靶點集。

1.3? 建立并分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的可視化拓撲網(wǎng)絡(luò)

基于STRING在線分析數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），以肝癌的重要靶點為分析數(shù)據(jù)集，并選擇Homo sapiens（人）為分析物種，最小互作分數(shù)為highest confidence（0.900）為分析條件進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，隱藏孤立的蛋白名稱，下載PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)并保存為TSV格式文件，隨后導入Cytoscape 3.7.2軟件，分析該PPI拓撲網(wǎng)絡(luò)并計算網(wǎng)絡(luò)指標，包括degree、betweenness centrality（BC）和closeness centrality（CC）。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)指標，進一步篩選肝癌的核心靶點。

1.4? 核心靶點的富集分析及核心靶點-器官組織拓撲網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以核心靶點為分析數(shù)據(jù)集，采用DAVID在線分析平臺（https：//david.ncifcrf.gov），以標識符為“OFFICIAL GENE SYMBOL”、物種為“Homo sapiens”為分析條件，進行基因本體（gene ontology，GO）功能（生物過程、細胞成分、分子功能）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。設(shè)定P<0.05，篩選出排名前10位的生物學過程和信號通路。

將核心靶點導入BioGPS數(shù)據(jù)庫（http：//biogps.org/），分析核心靶點在臟器組織中的表達，將結(jié)果導出至Excel中，篩選高于平均表達的器官組織，利用建立的靶點和器官組織之間的互作關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導入Cytoscape 3.7.2軟件中，實現(xiàn)核心靶點-器官組織拓撲網(wǎng)絡(luò)的可視化展示。

1.5? 核心成分的篩選

基于中醫(yī)藥整合數(shù)據(jù)庫（traditional Chinese medicine integrative database，TCMID）（http：//47.100.169.139/tcmid/）和中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺（integrative pharmacology-based research platform of traditional Chinese medicine， TCMIP）（http：//www.tcmip.cn/TCMIP），以核心靶點名稱為關(guān)鍵詞，獲取與核心靶點發(fā)生相互作用的化學成分，采用Excel記錄并規(guī)范檢索結(jié)果。利用建立的核心靶點與化學成分之間的互作關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導入Cytoscape 3.7.2軟件中，實現(xiàn)核心靶點-化學成分拓撲網(wǎng)絡(luò)的可視化展示，分析拓撲網(wǎng)絡(luò)并根據(jù)degree值篩選核心成分。

1.6? 核心中藥的篩選

基于中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php），以核心成分名稱為關(guān)鍵詞，獲取含有核心成分的中藥，采用Excel記錄并規(guī)范檢索結(jié)果。利用建立的核心成分與中藥之間的互作關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導入Cytoscape 3.7.2軟件中，實現(xiàn)核心成分-中藥拓撲網(wǎng)絡(luò)的可視化展示，分析拓撲網(wǎng)絡(luò)并根據(jù)degree值篩選核心中藥。

1.7? 分子對接

通過分子對接技術(shù)，計算核心中藥的成分與肝癌的核心靶點的自主結(jié)合能力，進一步驗證篩選結(jié)果的可信性。下載RSCB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）中核心靶點CDK1（PDB編號：6GU3）和CDC20（PDB編號：4GGA）的結(jié)構(gòu)，以PDB格式文件保存，借助Pymol軟件對核心靶點進行預處理，主要包括去水和配體。下載PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中核心成分的結(jié)構(gòu)，以SDF格式文件保存，進而采用OpenBable 軟件對其進行處理，以mol2格式文件保存；利用AutoDock Vina軟件進行分子對接，使用Pymol軟件對對接結(jié)果進行可視化處理。

1.8? 肝癌細胞增殖抑制實驗

在-80 ℃的冰箱中取出凍存的HepG2肝癌細胞（購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所），于37 ℃水浴鍋中解凍后轉(zhuǎn)移至離心管，加入DMEM（Dulbuccos modified eagle medium）高糖培養(yǎng)基混勻、離心后，去除上清液。向離心管中加入7 mL含10%FBS（fetal bovine serum）的DMEM高糖培養(yǎng)基，吹打均勻后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取HCT116細胞，加入胰蛋白酶消化后，吹打成單細胞懸液，將細胞濃度調(diào)整為1×105 mL-1，以每孔100 μL接種于96孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別加入基于DMEM高糖培養(yǎng)基配制的葛根水提物組（50、100、200、400、600、800 μg/mL）、葛根醇提物組（50、100、200、400、600、800 μg/mL）和對照組（藥物濃度為0），每組接種3孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后，每孔加入50 μL MTT（噻唑藍）溶液（1.0 mg/mL），4 h后吸出上清液，每孔加入100 μL DMSO（二甲基甲砜）溶液，采用酶標儀測定490 nm波長下的光密度（optical density，OD）值。肝癌細胞增殖抑制率的計算公式如下：

增殖抑制率=1-y藥物組y對照組×100%，（1）

式中，y表示４９０ ｎｍ波長下的光密度值。

1.9? 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗比較兩組數(shù)據(jù)間的顯著性差異，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2? 結(jié)果

2.1? 肝癌疾病靶點庫的建立

基于3個疾病靶點數(shù)據(jù)庫，獲得的肝癌疾病相關(guān)靶點的數(shù)量分別為：GeneCards數(shù)據(jù)庫16 799個、OMIM數(shù)據(jù)庫183個以及TTD數(shù)據(jù)庫63個。整合、去除重復值后，共得到16 886個肝癌的潛在靶點。從4個表達矩陣（GSE36376、GSE60502、GSE84005、GSE121248）中共得到114 920個基因，根據(jù)條件篩選后，從4個基因芯片GSE36376、GSE60502、GSE84005、GSE121248的表達矩陣中分別得到73、386、205、176個差異表達基因（DEGs），整合去重后，共得到447個DEGs。將肝癌的潛在靶點與DEGs導入Venny平臺，共得到398個共有靶點，認為是治療肝癌的重要靶點（OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2）。

2.2? 建立和分析PPI的可視化拓撲網(wǎng)絡(luò)

基于STRING數(shù)據(jù)庫，以398個肝癌的重要靶點為分析基因集，獲得PPI數(shù)據(jù)，采用Cytoscape 3.7.2軟件實現(xiàn)PPI拓撲網(wǎng)絡(luò)的可視化展示。拓撲網(wǎng)絡(luò)包含217個節(jié)點和1 242條邊（OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖3）。以degree值≥44，BC值≥0.025，CC值≥0.60為條件篩選出8個核心靶點，包括CDK1（細胞周期蛋白依賴性激酶1），CCNB2（細胞周期蛋白B2），CDC20（細胞分裂周期20），CCNA2（細胞周期蛋白A2），BUB1 （有絲分裂絲氨酸/蘇氨酸檢查點激酶），CCNB1（細胞周期蛋白B1），PLK1 （Polo樣激酶1），ASPM（異常紡錘樣小頭相關(guān)蛋白）。其中，CDK1的degree值（degree值>63）最高，表明CDK1處于PPI網(wǎng)絡(luò)的核心，可以通過相互作用以調(diào)節(jié)其他靶點，實現(xiàn)治療作用。

2.3? 核心靶點的功能富集分析及核心靶點-器官組織網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

GO功能富集分析結(jié)果顯示，8個核心靶點顯著富集于25個生物過程條目、12個細胞成分條目和7個分子功能條目，選取排名前10位的條目進行展示（OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4）。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，8個核心靶點顯著富集于6條信號通路，主要包括p53信號通路、FoxO信號通路等（OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖5）。

將核心靶點導入BioGPS數(shù)據(jù)庫，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建核心靶點-器官組織網(wǎng)絡(luò)（圖1），網(wǎng)絡(luò)共有28個節(jié)點和103條邊，紫色節(jié)點代表器官組織，粉色節(jié)點代表核心靶點。結(jié)果表明，核心靶點在多個器官組織中表達。核心靶點CDK1和CCNB2主要于內(nèi)皮細胞中表達，核心靶點CCNA2主要于早期紅細胞中表達，核心靶點CDC20、BUB1、CCNB1、PLK1和ASPM主要于B淋巴細胞中表達。BioGPS核心靶點信息定位雖未涉及肝臟，但卻在內(nèi)皮細胞、早期紅細胞、B淋巴細胞等免疫細胞中表達。此外，核心靶點CDC20涉及的器官組織最多（degree值>20），表明該靶點的分布和影響范圍廣。

2.4? 核心成分的篩選

將核心靶點分別導入TCMIP平臺和TCMID平臺，檢索與核心靶點相關(guān)的化學成分，共得到562個化學成分，其中，11個化學成分與ASPM相關(guān)，385個化學成分與CCNA2相關(guān)，1個化學成分與BUB1相關(guān)，72個化學成分與CCNB1相關(guān)，14個化學成分與CCNB2相關(guān)，10個化學成分與CDC20相關(guān)，42個化學成分與CDK1相關(guān)，27個化學成分與PLK1相關(guān)，根據(jù)建立的化學成分與核心靶點的互作關(guān)系數(shù)據(jù)，導入Cytoscape 3.7.2軟件，實現(xiàn)核心靶點-化學成分拓撲網(wǎng)絡(luò)的可視化，分析拓撲網(wǎng)絡(luò)的degree值，degree值越高表示化學成分可以作用的核心靶點越多。11個化學成分（degree值≥3）被認為是核心成分，包括黃岑素、丁酸、甘波辛、異黃烷酚、二硫代葡萄糖醇、黃烷霉素、白藜蘆醇、豆甾醇、苯并芘、β-雌二醇、槲皮素。核心成分的篩選過程如圖2所示。

2.5? 核心中藥的篩選

將11個核心成分分別導入TCMSP平臺，檢索含有核心成分的中藥，共得到262味中藥。根據(jù)核心成分與中藥的互作關(guān)系數(shù)據(jù)，導入Cytoscape 3.7.2軟件，實現(xiàn)核心成分-中藥拓撲網(wǎng)絡(luò)的可視化。分析拓撲網(wǎng)絡(luò)得到的degree值，degree值表示中藥中所含核心成分的數(shù)量。葛根（degree值≥3）被篩選作為核心中藥。核心中藥的篩選過程見OSID科學數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖6。

2.6? 分子對接

因為CDK1處于PPI網(wǎng)絡(luò)的核心，可以通過PPI網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)其他靶點，而CDC20在器官組織中分布最廣泛，因此選取葛根中含有的3個核心成分（槲皮素、黃岑素、豆甾醇）與兩個核心靶點（CDK1、CDC20）進行分子對接。3個核心成分與2個核心靶點分子對接的結(jié)合能均為負數(shù)，表明對接后會放出能量，對接過程可以自發(fā)進行（表1）。核心成分可以通過氫鍵與核心靶點的多個殘基相互作用（圖3）。

2.7? 肝癌細胞增殖抑制實驗

如圖4所示，葛根水提取物和葛根醇提取物均能對HepG2肝癌細胞增殖產(chǎn)生抑制作用，且抑制作用均隨質(zhì)量濃度升高而增強，呈劑量依賴性；當質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，葛根水提取物和葛根醇提取物的抑制活性無顯著性差異（P>0.05）；當質(zhì)量濃度逐漸升高時，相同濃度下的葛根醇提取物較葛根水提取物的抑制作用更強，表現(xiàn)出顯著差異性，這可能是由于葛根中槲皮素和黃岑素等2個核心成分在乙醇中的溶解度較高。

注：#表示P>0.05，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3? 討論

GEO數(shù)據(jù)庫是一個儲存芯片、二代測序以及其他高通量測序數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，通過GEO數(shù)據(jù)庫可以得到基因表達譜分析，進而篩選出與肝癌有關(guān)的差異基因［7］。GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫是常用的疾病靶點數(shù)據(jù)庫，通過以上疾病數(shù)據(jù)庫，可以得到已知的與肝癌發(fā)生、發(fā)展、治療或預后等方面相關(guān)的所有靶點。將差異基因與靶點數(shù)據(jù)取交集，將有助于去除肝癌疾病靶點的冗余信息，進一步篩選與肝癌相關(guān)性更高的靶點。

基于PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出8個核心靶點，包括CDK1、CCNB2、CCNA2、CDC20、BUB1、CCNB1、PLK1、ASPM。研究表明，CDK1在肝癌S期會過度表達［8］；CCNB1和CCNB2是細胞周期蛋白家族的主要組成部分，具有調(diào)節(jié)與G2/M檢測位點相關(guān)的重要細胞周期的功能［9］；CCNA2在S期到有絲分裂早期高度表達［10］；CDC20是控制染色體分離和有絲分裂結(jié)束的重要成分［11］；BUB1可激活SMAD2磷酸化，促進肝癌細胞增殖［12］；PLK1是肝癌中的一種癌基因，對調(diào)節(jié)M期有絲分裂紡錘體形成檢查點具有重要作用，被認為是肝癌研究的靶點［13-14］；ASPM對胚胎成神經(jīng)細胞正常的有絲分裂紡錘體功能至關(guān)重要［15］。綜上所述，8個核心靶點均與肝癌密切相關(guān)，可作為肝癌的治療靶點。其中，CDK1的degree值最高，處于PPI網(wǎng)絡(luò)的核心，表明可以通過CDK1間接地調(diào)節(jié)其他靶點。

GO富集分析結(jié)果顯示，首先，核心靶點主要參與有絲分裂核分裂、細胞分裂和有絲分裂細胞周期的泛素蛋白連接酶活性調(diào)控等生物過程，其中，有絲分裂核分裂和細胞分裂是肝癌細胞增殖的基礎(chǔ)，而泛素蛋白連接酶活性的調(diào)控是肝癌細胞有絲分裂期和后期的調(diào)控關(guān)鍵，其異?？赡芤l(fā)肝癌細胞的不正常增殖；其次，核心靶點涉及濃縮核染色體外著絲點、中心體和核漿等細胞組分，其中，濃縮核染色體外著絲點異?？赡軐е掳┘毎薪z分裂異常，中心體異常擴散可能與肝癌細胞的快速增殖有關(guān)，核漿中突變基因和蛋白質(zhì)可改變代謝通路影響癌細胞增殖和轉(zhuǎn)化；最后，核心靶點參與周期蛋白依賴蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、組蛋白激酶活性和后期促進復合體結(jié)合，這三種生物功能都參與了肝癌細胞的分裂和增殖，如周期蛋白依賴蛋白激酶促進細胞周期，組蛋白激酶調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)，后期促進復合體則參與有絲分裂。這些過程的異常調(diào)控可能導致肝癌細胞的不正常生長。

基于核心成分-器官組織網(wǎng)絡(luò)，核心靶點在內(nèi)皮細胞、早期紅細胞、B淋巴細胞等免疫細胞中表達，雖未直接涉及肝癌，但推測肝癌可能通過影響免疫細胞的功能逃避免疫監(jiān)視，并促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。其中，核心靶點CDC20涉及的器官組織最多，表明CDC20在該網(wǎng)絡(luò)中具有重要的調(diào)控作用。

通過核心靶點-成分拓撲網(wǎng)絡(luò)和核心成分-中藥拓撲網(wǎng)絡(luò)，篩選出3個核心成分（槲皮素、黃岑素、豆甾醇）和1個核心中藥葛根。其中，黃岑素能促進大量ROS的產(chǎn)生并引發(fā)細胞死亡，提高人肝癌細胞株HepG2的胞質(zhì)細胞色素c、裂解半胱氨酸蛋白酶-3和裂解半胱氨酸蛋白酶-9的表達并降低Bcl-2（B淋巴細胞瘤-2）的表達［16］。研究表明，豆甾醇可以與MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶-2）和MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）結(jié)合，抑制其表達，進而對癌細胞的遷移和侵襲產(chǎn)生抑制作用［17］。槲皮素可以通過增加E-cadherin（鈣黏蛋白E）的表達，降低N-cadherin（鈣黏蛋白N）和Vimentin（波形蛋白）的表達來抑制TCF-β1（轉(zhuǎn)化生長因子-β1）誘導的肝細胞EMT的增殖，同時，槲皮素可以誘導人肝癌細胞株Hep3B和Huh7的凋亡［18-19］。此外，研究表明，核心中藥葛根可以抑制人肝癌細胞HepG2的增殖［20］。

分子對接結(jié)果顯示，槲皮素可以通過氫鍵與CDK1的多個殘基結(jié)合，包括ARG-216、MET-260和TYR-261；豆甾醇可以通過氫鍵與CDK1的多個殘基結(jié)合，包括VAL-227、LEU-220和ALA-219；黃岑素可以通過氫鍵與CDC20的多個殘基結(jié)合，包括GLN-401、SER-400和PHE-420。然而，槲皮素和豆甾醇中文與CDC20不能進行對接，黃岑素與CDK1不能進行對接，體現(xiàn)了中藥多成分調(diào)節(jié)多靶點的作用特點。

肝癌細胞增殖抑制實驗結(jié)果顯示，葛根水提取物和葛根醇提取物均能抑制HepG2肝癌細胞增殖，且呈劑量依賴性；葛根醇提取物的抑制活性較葛根水提取物的抑制活性強，這可能是因為葛根中的2個核心成分（槲皮素和黃岑素）在醇中的溶解度高［21-22］；肝癌細胞增殖抑制活性進一步驗證了核心中藥挖掘結(jié)果的可靠性。

本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，根據(jù)“搜集靶點、找尋成分、挖掘中藥”的研究思路，逆向挖掘出具有抗肝癌活性的中藥葛根，采用分子對接技術(shù)將葛根的核心成分與肝癌的核心靶點進行對接，結(jié)果顯示3個核心成分可以自發(fā)地與其特有的核心靶點結(jié)合并釋放出能量，這充分展示了中藥具有多成分調(diào)節(jié)多靶點的作用特征。同時，采用體外HepG2肝癌細胞增殖的抑制試驗，進一步驗證了核心中藥葛根的水提取物和醇提取物的抗肝癌增殖活性。本研究為葛根的抗肝癌活性研究提供了理論基礎(chǔ)，為葛根中抗肝癌活性成分的挖掘與研究提供了參考。同時，在大量數(shù)據(jù)中篩選得到抗肝癌活性的中藥并得到驗證，可以節(jié)省研究的經(jīng)濟和時間成本。本研究仍存在不足之處，采用葛根粗提物進行細胞實驗驗證，但葛根中的核心成分對核心靶點的調(diào)控未進行研究，我們將在后續(xù)的研究中進一步驗證。

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