張冬杰 馬守正 汪亮 李忠秋 劉娣

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.001

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.001

收稿日期：2022-11-08? 修回日期：2023-02-08

基金項目：國家自然科學(xué)基金（32172696）；黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務(wù)費(fèi)項目（CZKYF2021-2-C025）；國創(chuàng)中心先導(dǎo)科技項目（NCTIP-XD/C16）。

第一作者：張冬杰，女，研究員，研究方向為民豬資源保護(hù)研究與利用。E-mail：djzhang8109@163.com

通信作者：劉? 娣，女，博士，教授，研究方向為地方豬資源保護(hù)研究與利用。E-mail：liudi1963@163.com

摘? 要? 為了探究低溫環(huán)境下民豬肌肉組織內(nèi)與線粒體能量代謝相關(guān)基因的變化情況，以解析民豬抗寒特性的遺傳機(jī)制。將9頭體質(zhì)量相近的母豬隨機(jī)分成3組，每組3頭，在冬季將其中2組置于室外半敞篷舍內(nèi)飼養(yǎng)，分別處理3 d（急性低溫處理組）和58 d（慢性低溫處理組），1組置于常規(guī)舍內(nèi)飼養(yǎng)，作為對照組。以背肌為試驗材料，采用PCR array方法，對90個與線粒體能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，與對照組相比，急性低溫處理組基因的表達(dá)水平差異不顯著，但慢性低溫處理顯著改變? ATP5H、? ATP5L、? ATP6V1G3、? COX5A、? COX7A2、? COX7A2L、? NDUFS4、? SDHB、? UQCRQ和? GADD45B基因的表達(dá)水平，尤其是? GADD45B，達(dá)到了極顯著水平（P<0.01），這些基因均為編碼OXPHOS系統(tǒng)亞基基因，推測慢性低溫誘導(dǎo)了背肌ATP的生成。對? GADD45B基因進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該基因在哺乳動物中高度保守，基本符合分子進(jìn)化規(guī)律，表達(dá)具有明顯的組織特異性。急性低溫處理對民豬背肌內(nèi)ATP的生成影響不顯著，但慢性低溫處理誘導(dǎo)ATP的生成，以維持體溫恒定。

關(guān)鍵詞? 民豬；骨骼??；低溫；線粒體；能量代謝

線粒體是細(xì)胞的能量工廠，通過氧化呼吸鏈為生物體提供95%的能量。線粒體氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的能量一部分作為ATP直接被生物體利用以支持某些能量消耗過程，比如肌肉運(yùn)動、胞內(nèi)離子運(yùn)輸?shù)?，剩余部分則主要作為熱能維持體溫。人們發(fā)現(xiàn)不同氣候條件下動物對熱量的需求并不相同，其線粒體受到純凈化選擇壓力也不同［1］。

適應(yīng)性產(chǎn)熱（adaptive thermogenesis）對恒溫動物至關(guān)重要，是維持核心體溫恒定的關(guān)鍵組成部分。當(dāng)機(jī)體遭遇低溫刺激時，除棕色脂肪外，骨骼肌也是重要的產(chǎn)熱組織。它一方面可以通過肌肉的舒張和收縮產(chǎn)生熱量，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度升高時，肌肉會收縮，反之則舒張［2］。Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)主要由肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子ATP酶 （sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase， SERCA） 完成，它在轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+時，會水解一個ATP，釋放熱量，同時將兩個Ca2+從細(xì)胞質(zhì)泵回肌質(zhì)網(wǎng)［3］。另一方面，肌肉線粒體中受調(diào)節(jié)的氧化磷酸化解偶聯(lián)也可發(fā)揮產(chǎn)熱作用［4］。冷馴化可以增加骨骼肌中線粒體的體積，這可能是通過Ca2+刺激線粒體生物發(fā)生產(chǎn)生的［5］。

豬是較為特殊的一種哺乳動物，新生仔豬對溫度的敏感性要大于牛、羊等其他新生家畜。但豬的? UCP1基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了突變，使其無法產(chǎn)生傳統(tǒng)意義上的棕色脂肪［6］。因此，寒冷環(huán)境下，豬是通過何種方式維持體溫恒定一直是未知的。相比之下，同樣發(fā)生? UCP1基因突變而無法產(chǎn)生棕色脂肪的鳥類，其低溫環(huán)境下的能量代謝機(jī)制的研究較為透徹［7］。對于鳥類，已經(jīng)明確骨骼肌是其在低溫環(huán)境下的重要產(chǎn)熱組織［8］，但豬由于相關(guān)研究報道較少，目前還無法確認(rèn)肌肉和脂肪哪個是其重要產(chǎn)熱組織，或者是兩者兼具。但無可爭議的是，長期冷暴露或短期急性冷暴露均會導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)熱能力的增加，這是恒溫動物維持體溫、調(diào)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵［9］。

本研究以一種東北地區(qū)特有的民豬作為研究對象，該地方豬因長期生活在寒冷地區(qū)，具有明顯的抗寒特性［10］。使用PCR array技術(shù)對遭受慢性低溫處理和急性低溫處理的民豬背肌進(jìn)行與線粒體能量代謝相關(guān)基因的篩選與分析，以期解析低溫環(huán)境下民豬骨骼肌線粒體的能量代謝變化情況。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

9頭體質(zhì)量為（60±5） kg的民豬母豬由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所民豬養(yǎng)殖場提供。

1.2? 試驗設(shè)計

2020年11月9日，試驗開始前，9頭個體均在供暖的豬舍內(nèi)飼養(yǎng)，舍內(nèi)溫度控制在（18±2） ℃。將9頭個體隨機(jī)分成3組，每組3頭。試驗開始后，隨機(jī)將一組置于室外半敞篷舍內(nèi)飼養(yǎng)，記為慢性低溫處理組，半敞篷舍內(nèi)溫度與外界環(huán)境溫度基本一致，白天最高溫度為5 ℃，夜晚最低溫度為-5 ℃。試驗進(jìn)行55 d后，將剩余2組的1組置于室外半敞篷舍內(nèi)飼養(yǎng)，記為急性低溫處理組，此時白天最高溫度降為-15 ℃，夜晚最低溫度為-24 ℃。再處理3 d后，試驗結(jié)束。整個試驗期內(nèi)，3組個體均自由采食，保證充足的飲水。試驗結(jié)束后，將9頭個體同時屠宰，采集背肌、背脂、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟等組織，置于液氮中保存，備用。

1.3? 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

使用Trizol分別提取每個個體不同組織的總RNA，微量分光光度計進(jìn)行純度檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的濃度和完整性，質(zhì)量濃度要求不低于100 ng/μL。使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將所提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4? PCR array分析

豬線粒體能量代謝PCR array孔板訂制于上海沃吉基因科技有限公司，每個PCR array為一個96孔板，內(nèi)含90個目的基因和3個內(nèi)參基因以及3個陰性對照。陣列中所含的90個目的基因信息見表1。3個內(nèi)參基因分別為ACTB、GAPDH和? HPRT1。

1.5? 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）

96孔板中含有目的基因的引物，因此只需配置其他qRT-PCR反應(yīng)成分，包括cDNA樣品0.5 μL，WCGENE mRNA qPCR mix （2×）5.3 μL，滅菌水3.2 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；40個循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。檢測結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCt法計算不同低溫處理組目的基因相較于對照組的表達(dá)量變化情況，按照|log2FC|>1且P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因。

1.6? ??GADD45B基因的克隆測序與分子進(jìn)化樹構(gòu)建

使用Primer 5.0軟件，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的? GADD45B基因序列（XM_005654701）設(shè)計引物，用于擴(kuò)增該基因的完整編碼區(qū)，引物序列為GS：5′-ATGACACTGGAAGAGCTCGTGG-3′，GA：5′-CAGCGTTCCTGGAGGGAGAT-3′。獲得民豬? GADD45B基因的完整編碼區(qū)序列后，使用DNAMAN軟件與已知序列進(jìn)行比對，確定所擴(kuò)增序列的準(zhǔn)確性。使用NCBI數(shù)據(jù)庫的在線軟件BLAST，下載人、鼠、恒河猴、牛、羊、雞、家燕、鱷魚、青蛙和斑馬魚的GADD45B氨基酸序列。使用MEGA 11.0軟件對這些氨基酸序列進(jìn)行整理和比對，并構(gòu)建基于GADD45B氨基酸序列的分子進(jìn)化樹。

1.7? ?GADD45B基因的組織表達(dá)譜

采用qRT-PCR的方法，檢測? GADD45B基因在民豬的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、背肌和背脂中的表達(dá)水平。所用引物序列為AS：5′- GCTGATGAATGTGGACCCT -3′，AA：5′- AAACGACTGGATGAG GGTG -3′。選擇β-actin基因作為內(nèi)參基因，引物序列為F：5′-CGGGACCTGACCGACTACCT-3′，S：5′- GGGCCGTGATC TCCTTCTG -3′。qRT-PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)程序同“1.5”。將該基因在腎臟的表達(dá)水平設(shè)為對照，其他組織與其相比較，判定表達(dá)水平高低，相對表達(dá)量的計算公式為2-△△Ct，其中△△Ct=（△Ct目的基因-△Ct內(nèi)參基因）其他組織-（△Ct目的基因-△Ct內(nèi)參基因）心臟。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 慢性低溫處理后肌肉組織線粒體能量代謝相關(guān)基因的變化

線粒體能量代謝陣列共包含90個目的基因，以ATP酶H+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)、ATP合成、細(xì)胞色素C氧化酶、 泛醌氧化還原酶（NADH）、琥珀酸脫氫酶復(fù)合體、泛醌細(xì)胞色素c還原酶等家族基因為主。民豬在遭受慢性低溫處理后，背肌內(nèi)與線粒體能量代謝相關(guān)的90個基因，按照|log2FC|>1且P<0.05標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，共10個基因發(fā)生顯著上調(diào)，其中? ATP5H、? ATP5L、? ATP6V1G3、? COX5A、? COX7A2、? COX7A2L、? NDUFS4、? SDHB和? UQCRQ顯著上調(diào)（P

2.2? 急性低溫處理后肌肉組織線粒體能量代謝相關(guān)基因的變化

民豬在遭受急性低溫處理后，背肌內(nèi)與線粒體能量代謝相關(guān)的90個基因，按照|log2FC|>1且P<0.05標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，未發(fā)現(xiàn)發(fā)生顯著變化的基因（圖2）。說明急性低溫處理沒有顯著改變背肌內(nèi)線粒體能量代謝。

2.3? ??GADD45B基因的克隆測序

使用引物對GS和GA，獲得民豬? GADD45B基因完整編碼區(qū)序列，共計483 bp，編碼160個氨

基酸。通過BLAST比對，下載NCBI數(shù)據(jù)庫中人（NP_056490.2）、鼠（NP_032681.1）、恒河猴（NP_001247803.1）、牛（NP_001035694.1）、羊（XP_004008677.1）、雞（XP_040548737.1）、家燕（XP_039942460.1）、鱷魚（XP_019393972.1）、青蛙（XP_040178585）和斑馬魚（NP_001012386）的GADD45B氨基酸序列。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，該基因在哺乳動物中高度保守，序列一致性達(dá)97.81%，在不同物種間屬于中度保守，序列一致性為? 81.99%（圖3）。

2.4? 基于GADD45B氨基酸序列構(gòu)建分子進(jìn)化樹

利用MEGA11.0軟件構(gòu)建基于不同物種GADD45B氨基酸序列的分子進(jìn)化樹（圖4）。哺乳動物中，豬與牛、羊的親緣關(guān)系最近，人和恒河

猴的親緣關(guān)系最近，哺乳動物聚在一個大的分支上。家燕和雞同為鳥類，它們的親緣關(guān)系最近，但斑馬魚、鱷魚和青蛙在進(jìn)化樹上的位置與它們的進(jìn)化地位并不相符。斑馬魚作為魚類，應(yīng)處于該進(jìn)化樹的最低端，其次是兩棲類的青蛙，然后是爬行類的鱷魚和鳥類。

2.5? ?GADD45B基因在不同組織的表達(dá)

以民豬的腎臟組織為參照，利用相對定量的計算方法，比較? GADD45B基因在民豬不同組織的表達(dá)情況（圖5）。發(fā)現(xiàn)該基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，在背肌和心臟中表達(dá)量非常低，其次是背脂，但在脾臟中表達(dá)量非常高，肺臟和肝臟次之。

3? 討? 論

骨骼肌具有很強(qiáng)的代謝靈活性和適應(yīng)能力，能夠?qū)Σ煌芰啃枨蟮沫h(huán)境信號作出反應(yīng)［10］。骨骼肌細(xì)胞中的線粒體通過氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）產(chǎn)生細(xì)胞行使功能所需的大部分能量，并參與許多關(guān)鍵的細(xì)胞過程，如凋亡、鈣穩(wěn)態(tài)和產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。熱應(yīng)激會改變骨骼肌細(xì)胞的糖酵解，在ATP需求突然增加后，補(bǔ)償性糖酵解機(jī)制被激活。熱應(yīng)激誘導(dǎo)的熱休克蛋白70 （HSP70）抑制OXPHOS，同時促進(jìn)糖酵解以補(bǔ)償ATP失衡［11］。目前關(guān)于細(xì)胞和分子對冷脅迫適應(yīng)的復(fù)雜機(jī)制研究較少。此前發(fā)現(xiàn)，將小鼠的C2C12成肌細(xì)胞暴露在低溫下會增加代謝通量，分化肌管通過增加代謝率、ATP產(chǎn)生和糖酵解通量［12］來應(yīng)對低溫。

本研究發(fā)現(xiàn)，短期的急性低溫處理（3 d）并未顯著改變這些基因的表達(dá)水平，而長期的慢性低溫處理（58 d）顯著誘導(dǎo)了與ATP合成相關(guān)基因的表達(dá)。線粒體ATP的產(chǎn)生是由OXPHOS系統(tǒng)介導(dǎo)的，該系統(tǒng)由4個線粒體多亞基復(fù)合體（CⅠ、CⅡ、CⅢ和CⅣ）和F0F1-ATP合成酶（CⅤ）組成。民豬在遭受長期低溫處理后，多個參與編碼該系統(tǒng)亞基的基因發(fā)生了顯著上調(diào)，其中? NDUFS4是編碼CⅠ亞基的基因，CⅠ是4個復(fù)合體中最大最復(fù)雜的一個蛋白，線粒體內(nèi)大多數(shù)ATP是經(jīng)過CⅠ的電子傳遞產(chǎn)生的［13］。在乳鼠的心肌細(xì)胞中敲減? NDUFS4，會造成ROS水平上升，線粒體膜電位、鈣離子攝取能力、細(xì)胞最大呼吸速率均出現(xiàn)下降，說明該基因在維持線粒體正常功能方面具有重要作用［14］。上調(diào)表達(dá)的? SDHB是編碼CⅡ亞基的基因，它既可參與ATP的生成，也可影響細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量［15］。編碼CⅢ亞基的? UQCRQ基因，編碼CⅣ亞基的? COX5A、? COX7A2和? COX7A2L基因，也發(fā)生了顯著上調(diào)。CⅣ負(fù)責(zé)將電子從細(xì)胞色素C傳遞到分子氧。電子傳遞與ATP合成是偶聯(lián)在一起的，即氧化磷酸化過程。此外，編碼F0F1-ATP合成酶亞基的3個基因，即? ATP5H、? ATP5L和? ATP6V1G3也發(fā)生了顯著上調(diào)，ATP合成酶在呼吸過程中通過電子傳遞鏈（electron transport chain，ETC）釋放的能量先轉(zhuǎn)換為跨膜質(zhì)子（H+）梯差，之后質(zhì)子流順質(zhì)子梯差通過ATP合成酶使ADP+Pi合成ATP［16］。這些基因的顯著上調(diào)，說明低溫處理下，民豬骨骼肌線粒體內(nèi)的ATP合成增加了。

對發(fā)生極顯著上調(diào)表達(dá)的? GADD45B基因進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該基因在正常情況下的脾臟中高表達(dá)，這與其參與TH1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答相關(guān)，該基因的缺失，會導(dǎo)致小鼠脾臟顯著增大［17］。本研究中，民豬在遭受慢性低溫處理后，骨骼肌中的? GADD45B基因發(fā)生了極顯著的上調(diào)，具體作用機(jī)理未知。目前已知? GADD45B是肌肉發(fā)生的重要調(diào)控因子，它的缺失可降低p38 MAPK的磷酸化水平，從而下調(diào)肌肉調(diào)節(jié)因子（muscle regulatory factors，MRFs）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1?。≒PARGC1A）的表達(dá)，導(dǎo)致肌源性分化和線粒體生物發(fā)生的抑制［18］。此外，該基因還參與細(xì)胞的DNA修復(fù)和抗凋亡。

4? 結(jié)? 論

民豬是一個具有明顯抗寒特性的地方豬種，通過PCR array技術(shù)高通量篩選了不同程度的低溫處理下民豬骨骼肌線粒體能量代謝相關(guān)基因的變化情況。發(fā)現(xiàn)急性低溫處理并未改變民豬骨骼肌內(nèi)線粒體能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)，但慢性低溫處理誘導(dǎo)了多個編碼OXPHOS系統(tǒng)的亞基基因，包括? ATP5H、? ATP5L、? ATP6V1G3、? COX5A、? COX7A2、? COX7A2L、? NDUFS4、? SDHB和? UQCRQ基因（P<0.05），以及發(fā)生極顯著變化的? GADD45B基因（P<0.01），推測這些基因的上調(diào)表達(dá)將最終實(shí)現(xiàn)ATP合成的增加。發(fā)生極顯著變化的? GADD45B基因，氨基酸序列在哺乳動物中高度保守，基本符合分子進(jìn)化規(guī)律，表達(dá)具有明顯的組織特異性。

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Effect of Low Temperature on Mitochondrial Energy Metabolism Genes in Skeletal Muscle of Min Pig

ZHANG Dongjie， MA Shouzheng， WANG Liang， LI Zhongqiu and LIU Di

（Institute of Animal Husbandry， Heilongjiang Academy of Agricultural Science，Harbin? 150086，China）

Abstract? In order to explore the changes of genes related to mitochondrial energy metabolism in muscle tissue of Min pigs under low temperature environment， and to analyze the genetic mechanism of cold resistance of Min pigs.Nine female Min pigs with similar mass? were randomly divided into three groups， with three individuals in each group.In winter， two groups of individuals were raised in outdoor semi-open houses for 3 days （acute low temperature treatment group） and 58 days （chronic low temperature treatment group）， respectively， and one group was raised in normal houses as the control group.The expression level of 90 genes related to mitochondrial energy metabolism in the skeletal muscle of Min pig was detected by PCR array method.The acute low temperature treatment did not significantly change the expression levels of these genes， but chronic low temperature treatment significantly changed the expression levels of?? ATP5H，?? ATP5L，?? ATP6V1G3，? ?COX5A，?? COX7A2，?? COX7A2L，?? NDUFS4，?? SDHB，?? UQCRQ and?? GADD45B genes at a very significant level （P<0.01）， especially?? GADD45B.These genes were all genes encoding OXPHOS system subunits，? suggesting that chronic low temperature treatment induced ATP production.Further analysis of?? GADD45B gene showed that the gene was highly conservative in mammals， basically in line with the molecular evolutionary law， and its expression had obvious tissue specificity.Acute low temperature treatment did not change the ATP production in skeletal muscle of Min pig， but the chronic low temperature treatment induced ATP production to maintain body temperature constant.

Key words? Min pig; Skeletal muscle; Low temperature; Mitochondrial; Energy metabolism

Received ??2022-11-08??? Returned? 2023-02-08

Foundation item? The National Natural Science Foundation of China （No.32172696）; Scientific Research Fund for Heilongjiang Provincial Research Institutions （No.CZKYF2021-2-C025）; National Center of Technology Innovation for Pigs （No.NCTIP-XD1C16）.

First author? ZHANG Dongjie， female， research fellow.Research area： research and protection of the Min pig.E-mail： djzhang8109@163.com

Corresponding?? author? LIU Di， female， Ph.D，professor.Research area： research and protection of the indigenous pig breeds.E-mail：liudi1963@163.com

（責(zé)任編輯：顧玉蘭? Responsible editor：GU Yulan）