摘 要 為了明確根際微生物數(shù)量差異在棉花黃萎病發(fā)病中的作用，大田條件下，在兩塊棉田分別選取中棉所49和魯棉研28兩個(gè)品種，結(jié)合葉片癥狀與維管束癥狀對(duì)黃萎病進(jìn)行分級(jí)，以發(fā)病棉花植株和緊鄰的健康植株作為試驗(yàn)材料，各選取30對(duì)，采用水篩法檢測(cè)健株與病株之間病原菌的差異，構(gòu)建土壤根際細(xì)菌與真菌的標(biāo)準(zhǔn)樣品，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法定量健株與病株根際總細(xì)菌和總真菌。結(jié)果表明：棉花根際更高的細(xì)菌數(shù)量和更低的真菌數(shù)量對(duì)黃萎病的發(fā)生有明顯的抑制作用，根際真菌數(shù)量的大幅增加與黃萎病的發(fā)生密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞 棉花黃萎病；微菌核密度；根際微生物；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S562 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.09.032

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticilliun dahliae Kleb.）引起的一種典型土傳真菌病害，病原菌具有在土壤中存活時(shí)間長(zhǎng)、寄主范圍廣、變異頻繁、侵染過(guò)程復(fù)雜等特性，加之黃萎病抗性種質(zhì)缺乏，增加了病害防治難度[1-2]。根際微生物是指緊密附著在根際土壤中的微生物，主要包括細(xì)菌、真菌等，不僅是土壤的重要組成部分，更參與土壤中幾乎所有已知的生化反應(yīng)過(guò)程，在土壤有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分釋放及植物病害防控等方面起著重要作用[3-4]。如果將植株視為超級(jí)微生物，根際微生物的基因組要比植株大得多，也被稱(chēng)為植物的第二基因組[5]。作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中最具有生命力的組分，根際微生物與植物相互作用密切，是影響植物健康的重要因素。根際能夠通過(guò)富集一些有益菌群并招募有益的功能細(xì)菌來(lái)保護(hù)植物免受某些病原體侵害，其中土壤細(xì)菌種群多樣性和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)土壤抑制真菌作用有重要影響[6]。此外，細(xì)菌與真菌相對(duì)豐度的變化不僅影響生態(tài)系統(tǒng)中土壤有機(jī)質(zhì)的分解速率和養(yǎng)分利用率，而且與植株罹患病害也有一定的關(guān)系[7]。Shi等研究發(fā)現(xiàn)，健康土壤微生物組的特點(diǎn)是具有更高的細(xì)菌多樣性和更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[8]。

長(zhǎng)期以來(lái)，由于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)只能檢測(cè)到微生物種群的小部分，而絕大多數(shù)土壤微生物是不可培養(yǎng)的，結(jié)果很難反映土壤中原始的群落結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成的研究一直受到限制。隨著高通量分子技術(shù)的快速發(fā)展，獲取微生物組成的相對(duì)豐度變得更容易實(shí)現(xiàn)，然而相對(duì)豐度的可靠性不足以反映物種豐度的真實(shí)情況[9]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)作為一種核酸定量的手段，具有線性關(guān)系好、特異性強(qiáng)、敏感性高和污染少等優(yōu)點(diǎn)，在微生物生態(tài)學(xué)中逐漸得到廣泛應(yīng)用，不僅可以對(duì)微生物功能基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量，還可以定量細(xì)菌、真菌等微生物類(lèi)群，解析微生物群落結(jié)構(gòu)組成及數(shù)量變化。本研究選取中棉所49、魯棉研28兩個(gè)品種緊鄰的健株與病株，比較在兩個(gè)品種中健康與發(fā)病植株病原菌微菌核數(shù)量差異，以及根際細(xì)菌與真菌豐度的差異，探究根際微生物數(shù)量與棉花黃萎病發(fā)生的相關(guān)性，為科學(xué)合理利用微生態(tài)調(diào)控手段防治棉花黃萎病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1" 供試材料

1.1.1" 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2021年在江西省經(jīng)濟(jì)作物研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行（江西九江）。分別在兩塊試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)種植中棉所49、魯棉研28號(hào)兩個(gè)品種，小區(qū)面積為6.5 m×15.5 m，田間自然發(fā)病，生產(chǎn)管理措施同常規(guī)棉田。

1.1.2" 棉花黃萎病病情調(diào)查

在棉花黃萎病發(fā)病高峰期，葉片癥狀的調(diào)查參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 2952—2016），結(jié)合對(duì)維管束癥狀剖稈調(diào)查，進(jìn)行棉花黃萎病病害分級(jí)。維管束剖稈調(diào)查參照Vallad等[10]的標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1）。不同病級(jí)棉花黃萎病維管束癥狀如圖1所示。

1.1.3" 樣品采集與處理

在兩塊棉田中選擇緊鄰的棉花黃萎病健株與病株，兩個(gè)品種各選取30對(duì)樣品。去除表層2 cm土壤，使用鐵鍬將棉花植株根部全部挖出，盡量保證根系的完整性，每個(gè)樣品單獨(dú)裝入無(wú)菌袋中，置于便攜式冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。輕輕抖落根系外圍松散土壤，將剪刀在酒精燈火焰附近灼燒滅菌，將植物根部切成約2 cm的小片，在250 mL錐形瓶中加入10 g左右的根際樣品，加入6 mL無(wú)菌1×TE緩沖液，無(wú)菌水補(bǔ)充到200 mL，并在270 rpm下?lián)u1 h（室溫），用紗布過(guò)濾根懸液，在4 ℃下（離心力4 000×g）離心20 min，移去上清液，此步驟重復(fù)3次，將每個(gè)樣品的沉淀重新懸浮在剩余溶液中，轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，在14 000×g下離心20 min，儲(chǔ)存在-80 ℃超低溫冰箱用于后續(xù)DNA的提取和分析。

1.2" 土壤中大麗輪枝菌微菌核密度定量

在棉花植株根圍10 cm處的深耕層，用取土器在植株的四周均勻采取土樣，置于紙袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干3周，然后將土壤樣品磨碎，過(guò)0.425 mm篩，稱(chēng)取10 g土樣置于含有200 mL自來(lái)水的三角瓶中，175 rpm條件下震蕩1 h（室溫），在自來(lái)水下用20 μm和150 μm孔徑的篩子過(guò)篩（上面為150 μm，下面為20 μm）沖洗后，將留在20 μm篩網(wǎng)上的殘留物全部轉(zhuǎn)移到三角瓶中，用蒸餾水定容至10 mL，吸取1 mL均勻涂布于微菌核選擇分離培養(yǎng)基上，每個(gè)土樣涂布10皿，置于超凈工作臺(tái)風(fēng)干后，22 ℃下暗培養(yǎng)28 d，自來(lái)水細(xì)水沖洗的同時(shí)用手指輕輕抹掉培養(yǎng)皿表面的土粒，立體顯微鏡下計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)的棉花黃萎病病原菌菌落數(shù)，結(jié)果表示為CFU·g-1干土。

1.3" 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.3.1" 土壤根際微生物基因組DNA提取

120份土壤樣品均采用Power Soil DNA Isolation Kit試劑盒（MoBio， CA， USA）提取土壤基因組總DNA，提取流程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA完整性，紫外分光光度法測(cè)定DNA濃度和純度，-80 ℃保存、備用。

1.3.2" 土壤DNA樣品目的基因擴(kuò)增

以土壤基因組DNA為模板，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物交由華大基因科技股份有限公司合成，細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增引物為F515和R806；真菌擴(kuò)增采用引物為ITS1f和5.8s。由于真菌和細(xì)菌擴(kuò)增目的片段大小接近，采用相同的PCR反應(yīng)程序，擴(kuò)增所需要的酶采用Go Taq? Colorless Master Mix（Promega Corporation， Madison， Wisconsin， USA），PCR反應(yīng)混合物的體積為25 μL，包括Premix Go Taq? 12.5 μL，DNA模板1 μL，上游引物（10 μM）1 μL，下游引物（10 μM）1 μL，無(wú)菌雙蒸水10.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性45 s，根據(jù)引物的Tm值，細(xì)菌55 ℃退火45 s，真菌52 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min（見(jiàn)表2）。

1.3.3" 重組質(zhì)粒的制備與鑒定

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)San Prep柱式DNA膠回收試劑盒純化后，連接至pEASY-T5 Zero Cloning Kit載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取部分菌液涂板培養(yǎng)過(guò)夜，挑選克隆接種于LB/Amp+的液體培養(yǎng)基中，200 rpm、37 ℃培養(yǎng)6 h左右，采用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，質(zhì)粒送華大基因科技股份有限公司測(cè)序確認(rèn)，結(jié)果在Gen Bank上進(jìn)行Blast同源性比對(duì)分析。采用Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒濃度，利用重組質(zhì)粒的分子質(zhì)量與質(zhì)量濃度，計(jì)算出單位體積質(zhì)粒所含有的拷貝數(shù)濃度：

拷貝數(shù)濃度（copies/μL）=[（6.02×1023）×（質(zhì)粒DNA濃度ng/μL×10-9）]/（660×堿基數(shù)）

1.3.4" 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

將制備好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到一定濃度，然后進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫?個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)模板，作為標(biāo)準(zhǔn)品。細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增反應(yīng)使用Premix Ex TaqTM，真菌ITS區(qū)擴(kuò)增采用TB Green? Premix Ex TaqTM試劑盒，反應(yīng)條件參見(jiàn)表2。將標(biāo)準(zhǔn)樣品和一定質(zhì)量的待測(cè)土壤樣品DNA一起擴(kuò)增，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，陰性模板對(duì)照加無(wú)菌雙蒸水，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的基因拷貝數(shù)，最后以基因copies·ng-1 DNA為單位進(jìn)行分析。

1.4" 數(shù)據(jù)分析

采用Excel、SPSS 17.0、Origin 9.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算、處理和作圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

細(xì)菌重組質(zhì)粒的最初質(zhì)量濃度為39.41 ng·μL-1，計(jì)算得質(zhì)粒拷貝數(shù)為8.19×109 copies·μL-1，稀釋到1.00×108 copies·μL-1后，再進(jìn)行10倍梯度稀釋得到濃度為1.00×104 copies·μL-1～1.00×108 copies·μL-1系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，以檢測(cè)到的各濃度質(zhì)粒的Ct值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)范圍達(dá)到5個(gè)數(shù)量級(jí)，回歸方程為y=-3.51x+42.13，相關(guān)系數(shù)R2=0.99，擴(kuò)增效率E=98%（見(jiàn)圖2A）。真菌重組質(zhì)粒的最初質(zhì)量濃度為46.23 ng·μL-1，計(jì)算得質(zhì)?？截悢?shù)為9.73×109 copies·μL-1，稀釋到1.00×108 copies·μL-1后，再進(jìn)行10倍梯度稀釋得到濃度為1.00×104 copies·μL-1～1.00×108 copies·μL-1系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，以檢測(cè)到的各濃度質(zhì)粒的Ct值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)范圍達(dá)到5個(gè)數(shù)量級(jí)，回歸方程為y=-3.41x+41.32，相關(guān)系數(shù)R2=0.99，擴(kuò)增效率E=100%（見(jiàn)圖2B）。

2.2" 健康與發(fā)病棉花植株土壤中大麗輪枝菌微菌核數(shù)量

對(duì)來(lái)自2塊棉田的120份樣品進(jìn)行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)抗病品種中棉所49黃萎病0～3級(jí)分別有30、6、15、9份樣品；耐病棉花品種魯棉研28黃萎病0～3級(jí)分別有30、9、12、9份。對(duì)土壤樣品中微菌核密度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，微菌核密度范圍為0.0～40.5個(gè)微菌核·g-1土，大約95%的土樣微菌核密度小于20個(gè)微菌核·g-1土（見(jiàn)圖3）。種植魯棉研28的棉田大部分微菌核密度小于每克土8個(gè)微菌核，中棉所49棉田大部分樣品微菌核密度大于2個(gè)微菌核·g-1土，小于8個(gè)微菌核·g-1土。對(duì)棉花黃萎病不同病級(jí)間微菌核數(shù)量差異（見(jiàn)圖4）分析發(fā)現(xiàn)，不同病級(jí)間微菌核數(shù)量差異不顯著，健康與發(fā)病棉花植株土壤微菌核數(shù)量相近，兩個(gè)試驗(yàn)棉田的中棉所49號(hào)和魯棉研28均發(fā)現(xiàn)了一些棉花植株土壤中微菌核數(shù)目較多，但植株仍然保持健康，葉片和維管束都未表現(xiàn)出癥狀。

2.3" 健康與發(fā)病棉株根際土壤中的細(xì)菌和真菌數(shù)量

試驗(yàn)結(jié)果表明，在中棉所49健康植株中根際細(xì)菌拷貝數(shù)的數(shù)值在1.65×107～4.28×107 copies·ng-1DNA之間，發(fā)病植株則在5.50×106～1.32×107 copies·ng-1DNA之間，健康根際細(xì)菌拷貝數(shù)的中位數(shù)達(dá)到3.11×107 copies·ng-1DNA，而病株則為1.76×107 copies·ng-1 DNA，存在顯著性差異（見(jiàn)圖5A）；魯棉研28結(jié)果與中棉所49類(lèi)似，魯棉研28健康植株根際土壤中含有的細(xì)菌拷貝數(shù)為1.33×107～3.46×107 copies·ng-1DNA，病株則為4.56×106～1.15×107 copies·ng-1DNA，健康植株根際土壤細(xì)菌拷貝數(shù)中位數(shù)為2.94×107 copies·ng-1 DNA，病株為1.03×107 copies·ng-1DNA，健株較病株有更高的細(xì)菌拷貝數(shù)。

根際真菌數(shù)量恰好與細(xì)菌相反，在中棉所49健康植株根際土壤中真菌拷貝數(shù)范圍在9.01×106～2.53×107 copies·ng-1DNA，病株為1.17×107～3.12×107 copies·ng-1 DNA，健康植株與發(fā)病植株根際土壤真菌拷貝數(shù)的中位數(shù)分別為6.41×106 copies·ng-1DNA和2.48×107 copies·ng-1DNA（見(jiàn)圖5B）；魯棉研28中健康植株根際土壤中真菌拷貝數(shù)范圍在3.44×106～9.16×106 copies·ng-1DNA，病株為8.86×106～3.18×107 copies·ng-1DNA，健康與發(fā)病植株的中位數(shù)分別為7.25×106 copies·ng-1DNA和2.27×107 copies·ng-1DNA，病株根際土壤真菌數(shù)量顯著高于健株（見(jiàn)圖5B）。

2.4" 健康與發(fā)病棉株根際土壤中的細(xì)菌與真菌數(shù)量的比值

中棉所49健康植株根際細(xì)菌與真菌的比值始終大于1，范圍在3.11～17.03之間，細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌數(shù)量（見(jiàn)圖5C）；在魯棉研28健康植株中也存在這種規(guī)律，細(xì)菌與真菌的比值大于1，范圍在2.09～7.84之間（見(jiàn)圖5C）。然而在發(fā)病植株中的這個(gè)比值往往小于1，中棉所49的發(fā)病植株根際細(xì)菌與真菌的比值在0.24～0.83之間，魯棉研28發(fā)病植株根際細(xì)菌與真菌的比值在0.23～1.31之間。健康植株根際細(xì)菌數(shù)量占主導(dǎo)地位，是根際真菌的幾倍甚至十幾倍，在大麗輪枝菌侵染植株造成發(fā)病以后，真菌的數(shù)量顯著增加，根際土壤由原來(lái)的 “細(xì)菌型”土壤逐漸向“真菌型”土壤轉(zhuǎn)變，病害發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重。

3" 討論與結(jié)論

3.1" 討論

前人研究表明，微菌核密度與棉花黃萎病的發(fā)生密切相關(guān)，微菌核作為棉花黃萎病菌抵抗不良環(huán)境而產(chǎn)生的一種休眠結(jié)構(gòu)，由菌絲體變態(tài)形成，在沒(méi)有寄主存在的土壤中微菌核可存活超過(guò)10年，其數(shù)量對(duì)棉花黃萎病的動(dòng)態(tài)發(fā)生、流行起著至關(guān)重要的作用[11]。Ashworth等研究棉花黃萎菌的侵染閾值后指出，土壤中微菌核含有3.5個(gè)·g-1時(shí)就能造成棉株100%感病[12]；Wei等研究發(fā)現(xiàn)，增加微菌核的密度會(huì)導(dǎo)致黃萎病較高的發(fā)生率[13]。本研究的目的是比較棉花健株與病株之間根際微生物豐度的差異，為了盡量消除土壤中病原菌差異，采用成對(duì)選取相鄰的2株棉花，1株表現(xiàn)健康，1株有明顯的黃萎病癥狀，結(jié)果與預(yù)期一樣，健株與病株土壤中微菌核密度無(wú)顯著差異。

病原菌無(wú)顯著差異，發(fā)病狀況卻明顯不同，之前有研究表明，根際微生物在維持植物健康方面起到了重要作用[14-15]。那么，根際微生物豐度的差異與發(fā)病狀況到底存在何種關(guān)系？本研究發(fā)現(xiàn)，在兩個(gè)品種中健株根際細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)高于病株根際細(xì)菌數(shù)量，根際細(xì)菌數(shù)量與植株的健康呈正相關(guān)。宋旭紅等在對(duì)黃連根腐病的研究中證實(shí)，罹患根腐病的黃連植株根際土壤細(xì)菌種群豐富度顯著低于健康黃連土（p＜0.05），病株土樣中，細(xì)菌種群豐富度的顯著降低和種群多樣性的降低，有可能是導(dǎo)致黃連根腐病的一個(gè)重要原因[16]。賴(lài)寶春等研究發(fā)現(xiàn)，根際土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變及物種多樣性降低是辣椒枯萎病的一個(gè)重要特征[17]。

本研究表明，棉花黃萎病的發(fā)生總是伴隨根際真菌數(shù)量大幅度增加，且病株根際真菌（F）與細(xì)菌（B）的比值大于1，屬于“真菌型”（B/F?。┩寥溃欢】抵仓曛屑?xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于病株，屬于“細(xì)菌型”（B/F大）土壤?！凹?xì)菌型”根際土壤對(duì)棉花黃萎病有抑制作用，“真菌型”根際土壤則有利于黃萎病的發(fā)生。Dong等對(duì)三七土傳病害的研究也證明了這一點(diǎn)，病害的發(fā)生導(dǎo)致真菌與細(xì)菌的比值呈增加的趨勢(shì)[18]。植物病害的發(fā)生往往伴隨微生物數(shù)量、組成及功能的改變，最終破壞了微生物群落的穩(wěn)定性，所以恢復(fù)健康穩(wěn)定的微生物群落可能比單純控制病原體能更有效地預(yù)防病害的發(fā)生，更高的土壤微生物豐度也能保護(hù)植物免受病原微生物的侵害[19]。提高根際有益微生物數(shù)量并保持其較高的活性從而構(gòu)成更穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，對(duì)于保持生態(tài)平衡、維持土壤健康、控制棉花黃萎病或許是一個(gè)更有效的手段。

3.2" 結(jié)論

本研究克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，為分析根際微生物群落提供了一種快速、可靠而可重現(xiàn)的方法。利用此技術(shù)，通過(guò)對(duì)中棉所49、魯棉研28兩個(gè)品種緊鄰植株間根際細(xì)菌、真菌的絕對(duì)定量結(jié)合對(duì)病原菌微菌核的檢測(cè)，明確了健康植株根際屬于“細(xì)菌型”土壤，發(fā)病植株根際屬于“真菌型”土壤，“細(xì)菌型”土壤比“真菌型”土壤對(duì)棉花黃萎病有更大的抑制作用。

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（責(zé)任編輯：易" 婧）