摘要：【目的】明確細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1基因（SOCS1）過表達對乳腺發(fā)育關(guān)鍵信號通路（JAK/STAT）相關(guān)基因表達的影響，為揭示SOCS1基因調(diào)節(jié)豬乳腺上皮細胞增殖和凋亡的作用機制提供參考依據(jù)?！痉椒ā繕?gòu)建SOCS1基因過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC，分別轉(zhuǎn)染豬乳腺上皮細胞，然后通過CCK-8檢測細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測細胞周期及細胞凋亡情況，實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后JAK/STAT信號通路相關(guān)基因的表達變化?！窘Y(jié)果】以過表達載體pcDNA3.1-SOCS7和陰性對照載體pcDNA3.1-NC分別轉(zhuǎn)染豬乳腺上皮細胞，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染組的SOCS1基因相對表達量極顯著高于陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染組（Plt;0.01，下同）;轉(zhuǎn)染48和72h后，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染組豬乳腺上皮細胞的OD值極顯著低于陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染組，說明過表達載體pcDNA3.1-SOCS1能有效抑制豬乳腺上皮細胞的增殖能力；過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率[（36.15±0.92）%]顯著高于陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染組[（30.55±0.35）%]（Plt;0.05，下同），且過表達載體pcDNA3.1-SOCS?轉(zhuǎn)染組中的G1期細胞比例極顯著降低，而S期和G2期細胞比例顯著升高。與陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染組相比，除JAK2、STAT3和TYK2基因外，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染組中的SOCS2、SOCS3、JAK1、STAT2、STAT5A、IL-6、PRLR、MCL1和PIAS3等9個JAK/STAT信號通路相關(guān)基因的相對表達量均極顯著升高。【結(jié)論]SOCS1基因過表達可抑制豬乳腺上皮細胞增殖及促進細胞凋亡，并影響JAK/STAT信號通路相關(guān)基因的表達變化，從而在豬的乳腺發(fā)生發(fā)育調(diào)控機制中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：豬；乳腺上皮細胞；SOCS1基因；細胞增殖；細胞凋亡；JAK/STAT信號通路

中圖分類號：S828.3文獻標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）01-0207-10

Effects of SOCS1 gene overexpression on proliferation and apoptosis of porcine mammary epithelial cells

MAO Tong-hui122，YANG Suan3，LUO Jie2，SU Zheng2，ZHANG Yi-yu3?

（'Tongren Animal Husbandry Technology Promotion Station，Tongren，Guizhou554300，China;2Tongren Polytechnic College，Tongren，Guizhou554300，China;3College of Animal Science，Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics，Breedingand Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，Guiyang，Guizhou550025，China）

Abstract：[Objective]The purpose of the study was to clarify the effect of overexpressed cytokine signal transducer suppressor1（SOCS1）gene on the expression of key signaling pathway（JAK/STAT）related genes in mammary gland de-velopment，and to provide reference for revealing the mechanism of SOCS1 gene regulating proliferation and apoptosis of porcine mammary epithelial cells.【Method]The overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 and the negative control vector pcDNA3.1-NC were constructed and transfected into porcine mammary epithelial cells，respectively.Then，cell prolifera-tion was detected by CCK-8，cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry，and the expression changes of JAK/STAT signaling pathway related genes after transfection were detected by real-time fluorescence quantitative PCR【Result]Porcine mammary epithelial cells were transfected with overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 and negative control vector pcDNA3.1-NC，respectively.The relative expression of SOCS1 gene in the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 transfection group was extremely significantly higher than that in the negative control vector pcDNA3.1-NC transfection group（Plt;0.01，thesame below）.After transfection for48and72h，the OD value of porcine mammary epithelial cells in the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 transfection group was extremely significantly""""" lower than that in the negative control vector pcDNA3.1-NC transfection group，indicating that the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 could effectively inhibit the proliferation ability of porcine mammary epithelial cells.The apoptosis"""""" rate of cells in the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 transfection group[（36.15±0.92）%]was significantly higher"""" than that of the negative control vector pcDNA3.1-NC transfection group[（30.55±0.35）%]（Plt;0.05，the same below），""" and the rate of G1phase cells in the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 transfection group was extremely signifi-cantly decreased，while the rates of Sand G2phase cells were significantly increased.Compared with thenegative control vector pcDNA3.1-NC transfection group，except for JAK2，STAT3and TYK2genes，the relative expressions of9JAK/STAT signaling pathway related genes，including SOCS2，SOCS3，JAK1，STAT2，STAT5A，IL-6，PRLR，MCLI and PLAS3，in the overexpressed vector pcDNA3.1-SOCS1 transfection group were extremely significantly increased.【Con-" clusion]Overexpression of SOCS1gene can inhibit the proliferation of porcine mammary epithelial cells and promote the""" apoptosis of cells and affect the expression changes of JAK/STAT signaling pathway related genes，thus playing an impor-"""" tan rolein the regulation mechanism of mammarygland development in pigs

Keywords：pig;porcine mammary epithelial cells;SOCS1 gene;cell proliferation;cell apoptosis;JAK/STAT sig-naling pathway

Foundation items：Guizhou Outstanding Young Scientific and Technological Talents Training Project（QKHPTRC〔2021〕5630）;Guizhou Science and Technology Support Plan Project（QKHZC〔2021〕Yiban147，QKHZC〔2022〕1Y038）;Animal Husbandry and Veterinary Professional Group Technical Skills Platform Project of Tongren Polytechnic College（〔2022〕02）

0引言

【研究意義】豬作為產(chǎn)仔數(shù)較多的家畜，其乳腺發(fā)育情況直接影響仔豬的生長，從而關(guān)系到整體的生產(chǎn)力。在哺乳動物的乳腺發(fā)育過程中，由關(guān)鍵調(diào)控因子和激素控制的遺傳信息與表皮生長因子家族成員調(diào)控的通路協(xié)同作用，在青春期、懷孕及哺乳期間協(xié)調(diào)生長和形態(tài)發(fā)生（Macias and Hinck，2012;劉嘉爍等，2023），但有關(guān)各類調(diào)控因子與生長因子通路之間的相互作用機制尚未明確。因此，亟待開展相關(guān)基因超表達對豬乳腺上皮細胞增殖和凋亡的影響研究，探明其調(diào)控機制，為研究豬乳腺發(fā)育提供科學(xué)依據(jù)。【前人研究進展】Chu等（2018）通過抑制和過表達miR-15b，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-15b能下調(diào)小鼠乳腺上皮細胞的脂質(zhì)代謝；華麗萍等（2020）通過干擾和過表達盤狀蛋白結(jié)構(gòu)域受體1基因（DDR1），證實該基因能促進奶牛乳腺上皮細胞增殖，并顯著抑制細胞凋亡；Li等（2022）在探究牛miR-199a-3p調(diào)節(jié)牛乳腺上皮細胞炎癥免疫反應(yīng)的潛在機制時發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p的沉默能完全逆轉(zhuǎn)其過表達所產(chǎn)生的效應(yīng)，進一步揭示miR-199a-3p可作為治療牛乳腺炎的有效靶點；朱俊儒等（2023）通過干擾和過表達方式探究程序性細胞死亡因子4（PDCD4）對奶山羊乳腺上皮細胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾PDCD4基因表達可促進乳腺上皮細胞增殖并降低凋亡水平，過表達PDCD4基因則抑制細胞增殖及促進細胞凋亡。細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（SOCS）家族蛋白通過SH2結(jié)構(gòu)域和SOCS box結(jié)構(gòu)域調(diào)控下游蛋白GHR、JAK激酶、STAT蛋白的磷酸化作用，進而影響GH信號通路反應(yīng)，調(diào)控動物生長發(fā)育（González et al.，2002;楊忠誠等，2015）。細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（SOCS1）作為SOCS家族的成員之一，近年來在人類疾病和藥物研發(fā)領(lǐng)域已有大量研究，尤其是探究SOCS1在各類癌癥及炎癥疾病中的調(diào)控機制（鄧楨等，2021）。Lindeman等（2001）利用SOCS1基因缺陷小鼠研究SOCS1基因作為催乳素反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOCS1基因缺陷小鼠在妊娠晚期和早泌乳期表現(xiàn)出乳腺小葉肺泡發(fā)育加速，證實了SOCS1基因在分娩前預(yù)防泌乳機制中的關(guān)鍵性。與SOCS1基因同樣具有KIR特殊結(jié)構(gòu)的SOCS3基因，參與JAK2-STAT5A信號通路而調(diào)控奶牛乳腺上皮細胞增殖及泌乳，且SOCS3基因沉默能促進奶牛乳腺上皮細胞泌乳和增殖相關(guān)基因的表達（Huang et al.，2013;Geng et al.，2021）。由此推測，干擾SOCS1基因也可抑制豬乳腺上皮細胞細胞增殖，但其作用機制尚未明確?！颈狙芯壳腥朦c】至今，已發(fā)掘出大量乳腺相關(guān)調(diào)控關(guān)鍵因子，但還需從關(guān)鍵基因的變量表達進一步驗證其調(diào)控效應(yīng)，包括SOCS1基因在不同物種乳腺中如何調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等，尤其對于繁殖性能較差的地方豬種，亟待揭示SOCS1基因調(diào)控豬乳腺發(fā)育的作用機制以推進地方豬種的品種改良?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過構(gòu)建SOCS1基因過表達載體并轉(zhuǎn)染豬乳腺上皮細胞，采用實時熒光定量RCR、CCK-8試劑及流式細胞術(shù)等檢測方法分析SOCS1基因?qū)θ橄侔l(fā)育關(guān)鍵信號通路（JAK/STAT）相關(guān)基因表達的影響，為揭示SOCS1基因調(diào)節(jié)豬乳腺上皮細胞增殖和凋亡的作用機制提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試健康母豬由貴州省赫章縣種豬場提供，其經(jīng)產(chǎn)3代，乳腺發(fā)育良好，無病灶。于斷奶后1周屠宰，以無菌剪刀采集其乳腺組織進行原代乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)。動物試驗由貴州大學(xué)動物倫理委員會批準，批準號EAE-GZU-2022-P049。胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、F12培養(yǎng)基、Opti-MEMIM減血清培養(yǎng)基和青鏈霉素混合液購自Gibco公司；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；2×T5Fast qPCR Mix和核酸染料購自天根生化科技（北京）有限公司；RNA提取液及cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo-Fisher Scientific公司；細胞內(nèi)角蛋白18（CK18）抗體（10712-1-AP，一抗）和Alexa Fluor488標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（SA00006-2，二抗）購自Proteintech公司。

1.2豬乳腺上皮細胞培養(yǎng)及鑒定

參照張亞林（2016）的方法，將乳腺組織置于無菌培養(yǎng)皿中，PBS多次清洗，采用眼科剪修剪整塊乳腺，剔除皮膚和脂肪等多余組織，剪成1mm

大小的顆粒并裝入50mL無酶離心管中，加入組織塊體積3倍的IV型膠原酶溶液，置于37℃恒溫水浴鍋中消化50min，期間每隔5min搖晃1次；消化結(jié)束后吸取離心管內(nèi)的上清液，用400目不銹鋼細胞過濾篩將其過濾至培養(yǎng)皿中，向濾液加入適量的完全培養(yǎng)基終止消化，制成細胞消化液。將細胞消化液轉(zhuǎn)入15mL離心管中，1000r/min離心10min，棄上清液；再加入5mL完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，再次離心；最后以2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀并鋪板，置于37℃、5%CO?細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

為鑒定豬乳腺上皮細胞，采用間接免疫熒光法對細胞CK18進行染色，具體操作如下：將玻璃爬片平放于細胞培養(yǎng)板中，加入適量培養(yǎng)基，細胞數(shù)量控制在2000個孔，置于CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。待細胞爬片后棄培養(yǎng)基，以PBS清洗，加入4%多聚甲醛（PFA），在4℃下固定30min，再以PBS清洗3次。將玻璃爬片取出，置于培養(yǎng)皿支撐物上，滴加50.0μL破膜封閉液（0.5%Trition X-100與PBS按1：1混合，再加入10%血清）于防水膜上封閉約2h。取50.0μL一抗（用PBS按1：100稀釋）滴加于防水膜上，4℃下孵育過夜；二抗避光孵育（用PBS按1：500稀釋）2h，以PBS清洗3次，加入300.0μLDAPI染色5min，以PBS再清洗3次。每個樣品玻璃爬片上各滴加1滴Fluoromount-G熒光封片劑，避光封片1h后置于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3SOCS1基因過表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

以pcDNA3.1為載體，委托北京擎科生物科技股份有限公司構(gòu)建過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC。SOCS1基因過表達載體引物序列信息見表1。將狀態(tài)良好的豬乳腺上皮細胞接種至6孔細胞板，待細胞生長匯合度達70%左右時，按Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明進行轉(zhuǎn)染，在2支1.5mL無菌無酶EP管中各加入125.0μLOpti-MEMTM減血清培養(yǎng)基，然后向其中一支EP管中加入5.0μL Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，而另一支EP管中加入5.0μLP3000M試劑和5.0μL表達載體（500ng/μL），最后將2支EP管溶液混合，室溫孵育30min，將孵育好的混合溶液均勻滴加到6孔細胞板中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染24～48h，利用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光的發(fā)光情況。

1.4CCK-8檢測細胞增殖

將豬乳腺上皮細胞接種至96孔細胞板中，分別以過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC進行轉(zhuǎn)染，于細胞貼壁后6、12、24、48和72h，按CCK-8試劑盒說明向?qū)?yīng)細胞孔各加入15.0μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2h后通過酶標(biāo)儀于450nm處檢測不同處理組的細胞吸光值。每個轉(zhuǎn)染載體設(shè)5個重復(fù)細胞孔，每個轉(zhuǎn)染組重復(fù)3次。

1.5流式細胞術(shù)檢測細胞周期及細胞凋亡

豬乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)染48h后棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶進行消化，1000r/min離心5min，棄上清液，獲得細胞沉淀，通過流式細胞儀測定細胞周期及細胞凋亡情況。（1）細胞周期檢測：用PBS洗滌細胞沉淀，250r/min離心6min，棄上清液，加入2mL預(yù)冷的70%乙醇，-20℃保存或用于DNA染色；取出細胞樣本，250r/min離心5min，棄上清液，PBS洗滌2次，相同條件重復(fù)離心1次，棄上清液；加入60.0μLRNase（10mg/mL），37℃水浴30min，加入400.0μLPI染液，混勻，4℃避光反應(yīng)20min，在激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長585±21nm下進行流式細胞術(shù)檢測。（2）細胞凋亡檢測：向細胞

沉淀加入500.0μLPBS，1000r/min離心6min，棄上清液；加入1×Binding Buffer緩沖液，制成1×106個/mL的細胞懸液，采用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（BD5556574）進行檢測。流式細胞儀測定參數(shù)：激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長FL1為525±20nm FL2為585±21nm。

1.6總RNA提取及cDNA合成

豬乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)染48h后棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，每孔加入1mL TRIzol裂解液，將混合溶液轉(zhuǎn)入EP管并加入200.0μL氯仿，混勻，4℃孵育10min后，4℃下12000r/min離心15min。吸取上層水相至新的EP管中，加入500.0μL異丙醇，混勻，冰上靜置15min，4℃下12000r/min離心10min，棄上清液；向EP管中加入1mL75%乙醇洗滌沉淀，4℃下7500r/min離心5min，棄上清液；打開EP管置于超凈工作臺中風(fēng)干，待沉淀由白色變成透明時加入30.0μL DEPC水溶解沉淀，利用超微量紫外可見分光光度計檢測RNA濃度和純度。按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)紫外可見分光光度計測定其濃度后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7實時熒光定量PCR檢測JAK/STAT信號通路相關(guān)基因表達

根據(jù)NCBI已公布的豬SOCS1基因和JAK/STAT信號通路相關(guān)基因序列，利用Primer-BLAST設(shè)計實時熒光定量PCR擴增引物（表2），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以β-actin為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR檢測，反應(yīng)體系10.0μL：2×UltraSYBR Mixture5.0μL，cDNA模板（100ng/μL）1.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，ddH?O補足至10.0μL。擴增程序：95℃預(yù)變性10min;95℃10s，退火45s，72℃32s，進行35個循環(huán)。每個樣設(shè)3次重復(fù)，采用2-～法計算目的基因相對表達量。

1.8統(tǒng)計分析

利用WPS Office對豬乳腺上皮細胞的增殖、凋亡和周期，以及SOCS1基因和JAK/STAT信號通路相關(guān)基因的相對表達量進行統(tǒng)計分析；采用Modfit分析流式細胞數(shù)據(jù)，以確定細胞周期分布情況；使用FlowJo10.0.0分析豬乳腺上皮細胞在不同狀態(tài)下的凋亡比例；利用SPSS26.0對各基因相對表達量進行單因素方差分析（One-way ANOVA），并以Graphpad Prism6.0制圖。

2結(jié)果與分析

2.1豬乳腺上皮細胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

由母豬乳腺組織分離培養(yǎng)獲得的豬乳腺上皮細胞如圖1所示。分離獲得的豬原代乳腺上皮細胞呈上皮樣，其形狀不規(guī)則，以鋪路石狀生長分裂（圖1-A和圖1-B）。細胞免疫熒光鑒定結(jié)果（圖1-C、圖1-D和圖1-E）顯示，CK18免疫熒光染色呈陽性，且細胞純度在90%以上。

2.2SOCS1基因過表達載體構(gòu)建情況

對完成測序的SOCS7基因過表達載體pcDNA3.1-SOCS1進行EcoRI和AvrⅡ雙酶切鑒定，結(jié)果（圖2）顯示獲得的目的條帶大小（1756bp/4326bp）與預(yù)期結(jié)果相符，其中1條與SOCS1基因大小一致，表明成功構(gòu)建獲得過表達載體pcDNA3.1-SOCS1。

2.3SOCS1基因在豬乳腺上皮細胞中的表達情況

分別以過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC瞬時轉(zhuǎn)染豬乳腺上皮細胞，轉(zhuǎn)染24h后即可觀察到載體pcDNA3.1（+）中的綠色熒光蛋白普遍發(fā)光（圖3-A），能明顯觀察到上皮樣細胞，說明過表達載體pcDNA3.1-SOCS7和陰性對照載體pcDNA3.1-NC均成功轉(zhuǎn)染豬乳腺上皮細胞。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖3-B）顯示，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染豬乳腺上皮細胞中的SOCS1基因相對表達量極顯著高于陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染豬乳腺上皮細胞（Plt;0.01，下同）。

2.4SOCS1基因過表達對豬乳腺上皮細胞增殖的影響

分別以過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染豬乳腺上皮細胞，采用CCK-8法在酶標(biāo)儀450nm波長處檢測轉(zhuǎn)染6、12、24、48和72h后豬乳腺上皮細胞的增殖情況，結(jié)果（圖4）顯示：與陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染組相比，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染組豬乳腺上皮細胞OD值在轉(zhuǎn)染48和72h時極顯著降低，說明過表達載體pcDNA3.1-SOCS1能有效抑制豬乳腺上皮細胞的增殖能力。

2.5SOCS1基因過表達對豬乳腺上皮細胞凋亡及細胞周期的影響

以流式細胞儀檢測過表達載體pcDNA3.1-SOCS1和陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染后的豬乳腺上皮細胞凋亡水平，結(jié)果（圖5）顯示，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率[（36.15±0.92）%]顯著高于陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染組[（30.55±0.35）%]（Plt;0.05，下同）。由圖6可看出，與陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染組相比，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染組中的G1期細胞比例極顯著降低，而S期和G2期細胞比例顯著升高，說明過表達SOCS1基因?qū)⒋偈关i乳腺上皮細胞阻滯于G2期和S期，從而改變細胞周期進程。

2.6SOCS1基因過表達對JAK/STAT信號通路相關(guān)基因表達的影響

采用實時熒光定量PCR對SOCS1基因過表達后JAK/STAT信號通路相關(guān)基因的相對表達量進行檢測，結(jié)果（表3）顯示，與陰性對照載體pcDNA3.1-NC轉(zhuǎn)染組相比，除JAK2、STAT3和TYK2基因外，過表達載體pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染組中的SOCS2、SOCS3、JAK1、STAT2、STAT5A、IL-6、PRLR、MCLI和PIAS3等9個JAK/STAT信號通路相關(guān)基因的相對表達量均極顯著升高。

3討論

在哺乳動物的一生中，其乳腺上皮細胞不斷經(jīng)歷增殖、分化和凋亡等過程。已有許多研究表明，乳腺上皮細胞的增殖和凋亡受許多因素影響，包括激素（Annen et al.，2008）、營養(yǎng)（Meng et al.，2017）及環(huán)境（Kapila et al.，2018）等。酵母硒（SeY）和蛋氨酸硒（Sel-Met）通過p38/JNK信號通路調(diào)控硒蛋白表達和抗氧化能力，從而抑制豬乳腺上皮細胞凋亡（Wu et al.，2020）;血清素（5-HTP）通過MAPK/ERK/Bcl-3途徑能抑制山羊乳腺上皮細胞凋亡（Zhao et al.，2021）;補充葉酸可促進牛乳腺上皮細胞增殖并減少凋亡（Bae et al.，2022）;橙皮苷通過Bcl-2/Bax-Caspase3信號通路能阻抑H?O?誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細胞凋亡，有效提高細胞活性（劉嘉爍等，2023）。SOCS家族基因與JAK/STAT信號通路調(diào)控多種細胞的增殖與凋亡變化，敲除SOCS1基因可促進人類肺泡上皮細胞凋亡（Qian et al.，2012）;非編碼microRNA-155（miR-155）通過沉默SOCS1基因而促進肝星狀細胞周期進程及減少細胞凋亡，而沉默miR-155可上調(diào)SOCS1基因并促使MAPK信號通路失活，進而抑制酒精性肝星狀細胞增殖及促進細胞凋亡（Liu et al.，2020）;SOCS1基因過表達能誘導(dǎo)G2/M期細胞周期阻滯和凋亡，顯著降低細胞增殖（Kajiyama et al.，2022）。綜上所述，SOCS1基因能抑制細胞增殖及促進細胞凋亡，且與相關(guān)泌乳的信號通路緊密相關(guān)。此外，與SOCS1基因同樣具有特殊結(jié)構(gòu)KIR的SOCS3基因沉默會促進奶牛乳腺上皮細胞泌乳及上調(diào)相關(guān)基因表達（Huang et al.，2013），且有研究證實SOCS3基因能促進卵巢上皮癌細胞凋亡（王茹等，2022），故推測過表達SOCS1基因能抑制豬乳腺上皮細胞增殖并促進細胞凋亡。

在動物生產(chǎn)方面，已有研究圍繞SOCS基因及JAK/STAT信號通路在奶牛產(chǎn)奶量、乳房炎癥、乳蛋白合成等作用機制方面開展深入探索（Coskun et al.，2013;Khan et al.，2020），證實JAK/STAT信號通路是在幾種多肽激素和細胞因子的下游運作，且這些激素和細胞因子是乳腺產(chǎn)后分泌功能的關(guān)鍵（Hennighausen and Robinson，2001）。JAK/STAT信號通路的激活參與促進多種細胞增殖。Yin等（2021）研究表明，在細胞滋養(yǎng)層中過表達SOCS3基因能減少細胞凋亡，敲低SCOS3基因則獲得相反效果，證實SOCS3基因過表達能抑制JAK2和STAT3磷酸化。郝蘭等（2022）在探究祛腐生肌合劑聯(lián)合表皮細胞生長因子調(diào)控壓瘡創(chuàng)面修復(fù)作用機制時發(fā)現(xiàn)，上調(diào)SOCS1蛋白表達水平能抑制JAK2/STAT3信號通路表達。此外，有研究報道沉默.JAK2基因表達后牛乳腺上皮細胞的增殖和分化降低95%以上（Shillingford et al.，2002）。在本研究中，SOCS1基因過表達能極顯著提高JAK/STAT信號通路內(nèi)大部分相關(guān)基因（SOCS2、SOCS3、JAK1、STAT2、STAT5A、IL-6、PRLR、MCL1和PIAS3）的相對表達量。其中，JAK2和STAT3基因相對表達量呈降低趨勢，不僅證實了SOCS1基因與JAK2和STAT3基因間的負反饋抑制關(guān)系，還提示JAK2和STAT3基因在豬乳腺上皮細胞增殖與凋亡調(diào)控中與SOCS1基因存在密切關(guān)系。STAT3基因能特異性二聚化誘導(dǎo)細胞凋亡，而STAT5基因會減弱由STAT3基因誘導(dǎo)劑LIF介導(dǎo)的細胞凋亡（Clarkson et al.，2006）。STAT3和STAT5A在整個乳腺發(fā)育周期中具有相互激活的作用模式，其中，STAT5A可能是分化乳腺上皮細胞的生存因子，而STAT3可能是細胞凋亡的關(guān)鍵因子（Chapman et al.，2000）。李輝（2014）研究表明，抑制STAT5A基因表達后，山羊乳腺上皮細胞增殖受抑制，而細胞凋亡率明顯上升。本研究中，隨著SOCS1基因在豬乳腺上皮細胞中的過表達，STAT3和STAT5A基因的表達呈現(xiàn)相反的變化趨勢，其中STAT5A基因表達量極顯著升高。綜合STAT家族基因在乳腺上皮細胞中的調(diào)控研究結(jié)論，以及SOCS蛋白是STATs的直接轉(zhuǎn)錄靶點，可推測SOCS1基因與STAT3和STAT5A基因間的相互作用對于豬乳腺上皮細胞的增殖和凋亡起關(guān)鍵作用，但具體調(diào)控機制還需進一步探究。

4結(jié)論

SOCS1基因過表達可抑制豬乳腺上皮細胞增殖及促進細胞凋亡，并影響JAK/STAT信號通路相關(guān)基因的表達變化，從而在豬的乳腺發(fā)生發(fā)育調(diào)控機制中發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）