關(guān)鍵詞：LeGlyⅠ基因：番茄；生物信息學(xué)分析；氧化脅迫：基因表達(dá)：亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)：S641.2：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）06-0001-06

番茄（Solanum lycopersicum L.）是一年生或多年生草本植物，屬于雙子葉植物綱茄科茄屬。番茄果實(shí)有很高的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，不僅富含鉀、鈣、鎂等礦物質(zhì)和多種維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，而且風(fēng)味獨(dú)特，可蔬菜和水果兼用，在全球廣泛種植，是重要的經(jīng)濟(jì)作物。但在自然條件下，番茄植株的生長(zhǎng)發(fā)育易遭受各種逆境脅迫，導(dǎo)致產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益降低。因此，研究抗逆機(jī)制，挖掘抗逆基因，選育抗逆品種，對(duì)于保障番茄高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效生產(chǎn)具有重要意義。

逆境脅迫主要分為生物脅迫和非生物脅迫。當(dāng)遭受逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)過量累積活性氧（ROS）、甲基乙二醛（MG）等有害物質(zhì)，造成代謝紊亂，損傷生物膜系統(tǒng)，從而影響植株生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明，植物體內(nèi)的乙二醛酶（glyoxalase，Gly）系統(tǒng)能夠通過酶促反應(yīng)將醛類有毒化合物轉(zhuǎn)化為無毒代謝物，降低過量MG對(duì)植物細(xì)胞的損傷，維持植物體的正常狀態(tài)。Gly系統(tǒng)包含協(xié)同作用的GlyⅠ和GlyⅡ，以及獨(dú)立反應(yīng)的Gly Ⅲ。GlyⅠ又稱作乳酰谷胱甘肽裂解酶（lactoylglutathione lyase），是Gly系統(tǒng)中發(fā)揮作用的第一個(gè)酶，其主要以谷胱甘肽為底物，催化MG轉(zhuǎn)化為S-D-乳酰谷胱甘肽，從而降低MG的生理活性濃度。許多植物的研究都表明GlyⅠ能夠參與抵御多種非生物脅迫，如：蕓苔屬GlyⅠ基因在煙草中的異源表達(dá)可以增強(qiáng)煙株對(duì)MG和高鹽的耐受性；GlyⅠ基因在黑豆中過表達(dá)后也能使植株獲得耐鹽性：將小麥GlyⅠ基因和水稻OsGLYⅠ-11.2基因在煙草中異位表達(dá)，都能使煙株獲得對(duì)多種非生物脅迫和重金屬毒性的耐受性；過表達(dá)OsGlyl基因可提高水稻的非生物耐受力和籽粒產(chǎn)量；過表達(dá)玉米ZmGLYI-8基因能增強(qiáng)擬南芥苗期對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性?？梢姡珿lyⅠ基因參與了植物對(duì)多種逆境的抵抗，但有關(guān)其在番茄中的功能研究鮮有報(bào)道。

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，在番茄遭受多種非生物脅迫前后，LeGlyⅠ基因的表達(dá)量有所差異，推測(cè)該基因參與了番茄抵抗多種非生物脅迫的過程。為進(jìn)一步研究該基因在番茄抵御非生物脅迫中的功能，本研究從番茄葉片中克隆了LeGlyⅠ基因，分析了其生物信息學(xué)特征、組織表達(dá)特性及在Mv模擬氧化脅迫下的表達(dá)情況，并對(duì)其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析，以期為深入研究Le GlyⅠ基因在番茄抵御逆境脅迫中的分子機(jī)制和選育抗逆品種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1植物材料及試驗(yàn)處理方法

本試驗(yàn)所用番茄品種為野生型番茄‘Heinz1706’。種子經(jīng)28℃恒溫催芽后，于2021年9月30日將其定植于裝有育苗基質(zhì)（營(yíng)養(yǎng)土與蛭石的比例為3：1）的穴盤中，于光照培養(yǎng)箱中在25℃光照18h、18℃黑暗6h、濕度60%、光照12000lx條件下培養(yǎng)。

于2021年11月10日取六葉一心番茄的根、莖、葉在液氮中速凍后-80℃保存，用于LeGlyⅠ基因的組織表達(dá)分析。2021年11月15日選取六葉一心期長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的番茄幼苗，用20μmol/L Mv水溶液進(jìn)行灌根處理，以清水灌根作為對(duì)照，分別在處理0、2、4、8、12、24、48 h取相同部位的番茄葉片，液氮速凍后-80℃保存，用于分析氧化脅迫對(duì)Le GlyⅠ基因表達(dá)的影響。

1.2LeGlyⅠ基因的克隆

取番茄葉片材料，經(jīng)液氮研磨后，采用Trizol法提取總RNA，并用HiScriptⅡQ RT SuperMixfor qPCR（+g DNA wiper）試劑盒（Vazymme^TM）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以獲得的番茄cDNA為模板，用DNA Club設(shè)計(jì)引物（表1）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50μL）：cDNA模板4μL，2×Phanta FlashMaster Mix 25μL，前后引物各2μL，ddH₂O 17μL。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性30s;98℃變性10s，52℃（Tm值）退火5s，72℃延伸4s，共35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸1min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，約25 min后觀察目的條帶，拍照并回收：將膠回收得到的目的片段與克隆載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)人大腸桿菌DH5α，篩選陽性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3 LeGly Ⅰ蛋白的生物信息學(xué)分析

利用NCBI（https：//www.ncbi. nlm，nih.gov/）進(jìn)行序列查詢；采用SWISS-MODEL網(wǎng)站（ht-tps：//swissmodel.expasy.org/）對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）對(duì)蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用Con-served Domain（https：//www. ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子分析；利用CELLO（http：//cello.life. nctu. edu.tw/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.4 LeGlyⅠ的亞細(xì)胞定位分析

利用Bam HⅠ和KpnⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切，將酶切的目的基因片段連接到含有GFP（綠色熒光蛋白）標(biāo)簽的融合表達(dá)載體pROKⅡ-GFP上，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404菌株中。取200μL含有目的片段的農(nóng)桿菌菌液，加到10 mL YEP液體培養(yǎng)基（每百毫升含1g胰蛋白胨、一g酵母粉、0.5 g NaCl）中，28℃、200r/min搖床培養(yǎng)12 h：取1 mL培養(yǎng)后的菌液以及10mLYEP液體培養(yǎng)基相同條件下進(jìn)行二次活化：在YEP誘導(dǎo)液（含MES、MgCl₂、AS）中加入1 mL二次活化過的農(nóng)桿菌菌液，28℃、200r/min培養(yǎng)4～5h；培養(yǎng)完成后，收集菌體，調(diào)OD_600nm=1.5，黑暗條件下28℃靜置3h：等比例混合含有目的基因的重懸液和P19（沉默抑制因子）重懸液，注射在煙草葉片背面；室溫培養(yǎng)3d，撕下葉片表皮，利用激光共聚焦顯微鏡觀察亞細(xì)胞定位。

1.5 Le GlyⅠ基因表達(dá)分析

利用Biosharp公司的SYBR Green qPCR Mix試劑盒檢測(cè)LeGlyⅠ基因表達(dá)情況，每組樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1 LeGlyⅠ基因的克隆

以野生型番茄品種‘Heinz 1706’的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了489 bp的條帶（圖1A）。連接克隆載體pMD19-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明該基因包含489 bp的CDS序列，得到了與預(yù)期結(jié)果完全匹配的陽性質(zhì)粒。

2.2 LeGlyⅠ蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1LeGlyⅠ蛋白理化性質(zhì) LeGlyⅠ共編碼162個(gè)氨基酸，蛋白分子式為C₇₉₈ H₁₂₂₆N₂₁₄O₂₃₅S₄，分子量為17706.05 Da，等電點(diǎn)為6.51，親水性平均值（GRAVY）為-0.386，不穩(wěn)定系數(shù)為39.32，疏水性分析結(jié)果顯示最大值為1.400、最小值為-2.756（圖2A），預(yù)測(cè)為親水性穩(wěn)定蛋白，其三維結(jié)構(gòu)見圖2B。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第25～151個(gè)氨基酸處存在一個(gè)VOC-like結(jié)構(gòu)域（圖2C）；該結(jié)構(gòu)域存在于多種金屬蛋白中，而此類蛋白的激活需要結(jié)合金屬離子，該結(jié)構(gòu)域中即具有2～3個(gè)開放或容易接近配位位點(diǎn)的金屬配位環(huán)境，能夠促進(jìn)催化反應(yīng)中金屬離子的直接親電參與。

2.2.2 LeGlyⅠ的系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用MEGA 5.0軟件，將LeGlyl蛋白序列與其他物種的GlyⅠ蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹分析表明LeGly Ⅰ蛋白與Lactuca sativa（萵苣）、Solanum verrucosum（野生馬鈴薯）、Solanum pennellii（野生番茄）的GlyⅠ同源性最高（圖3）。

2.2.3 LeGlyⅠ啟動(dòng)子順式作用元件分析 利用在線軟件PlantCare分析Le GlyⅠ基因上游2000bp的啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)其中包含多種順式作用元件，包括無氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、干旱響應(yīng)元件以及茉莉酸甲酯、脫落酸、生長(zhǎng)素、赤霉素等激素響應(yīng)元件（表2）。

2.3LeGlyⅠ在不同器官中的表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR對(duì)野生番茄不同器官中的LeGlyⅠ基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（圖4）顯示，LeGlyⅠ基因在番茄的根、莖、葉中均有表達(dá)，且在葉中的表達(dá)量最高，是莖中的4.7倍，是根中的8.7倍，差異達(dá)顯著水平。

2.4 LeGlyⅠ在Mv模擬氧化脅迫下的表達(dá)分析

利用qRT-PCR對(duì)Mv模擬氧化脅迫處理不同時(shí)間后番茄葉片中的Le GlyⅠ基因表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（圖5）顯示，LeGlyⅠ基因受到氧化脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，在氧化脅迫處理8h和12 h時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量分別是對(duì)照的2.8倍、3.1倍；在24h時(shí)表達(dá)量最低。

2.5 LeGlyⅠ的亞細(xì)胞定位分析

CELLO預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LeGlyⅠ可能存在于線粒體和過氧化物酶體中。通過構(gòu)建LeGlyⅠ-GFP融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，與融合了RFP的線粒體marker共侵染本生煙葉片，通過激光共聚焦顯微鏡觀察到細(xì)胞中線粒體和細(xì)胞核均有比較強(qiáng)的熒光信號(hào)，且GFP信號(hào)與RFP信號(hào)高度重合（圖6）。證明LeGlyⅠ定位在番茄細(xì)胞的線粒體與細(xì)胞核上。

3討論與結(jié)論

Glyl作為清除MG系統(tǒng)中第一個(gè)作用酶，在植物抵抗多種非生物脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。本研究成功在番茄葉片中克隆出LeGlyⅠ基因，通過生物學(xué)信息分析，LeGlyⅠ基因CDS全長(zhǎng)為489bp，共編碼162個(gè)氨基酸，蛋白預(yù)測(cè)為親水性穩(wěn)定蛋白。Gly Ⅰ作為金屬酶類，需要金屬離子作為輔因子發(fā)揮功能，通過保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)存在VOC-like結(jié)構(gòu)域。

GlyⅠ廣泛存在于各類生物中，GlyⅠ基因表達(dá)具有組織特異性。例如在蕓薹屬（Brassica）植物中，GlyⅠ在種子、根、下胚軸、子葉和花中均有表達(dá)，但主要在子葉中表達(dá)：玉米ZmGLyⅠ-8基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，但在葉中的表達(dá)量最高，根中最低。本研究結(jié)果也顯示Le GlyⅠ基因在番茄根、莖、葉中均有表達(dá)，且在葉中的表達(dá)量顯著高于莖和根中，根中的表達(dá)量最低?？梢?，GlyⅠ的器官分布在不同物種間存在相似性。研究表明，GlyⅠ在亞細(xì)胞定位上存在一定種間差異，玉米ZmGLYⅠ-8在細(xì)胞質(zhì)中定位，水稻OsGLYⅠ-8、擬南芥AtGLYⅠ-2蛋白均被發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞核中。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄LeGlyⅠ定位在線粒體和細(xì)胞核中，推測(cè)其可能主要在線粒體和細(xì)胞核中發(fā)揮功能。

MG與ROS的代謝調(diào)控密切相關(guān)。逆境脅迫誘導(dǎo)的MG水平上升可以通過抗氧化酶失活、GSH（谷胱甘肽）競(jìng)爭(zhēng)、脂質(zhì)過氧化等方式促使ROS積累，引發(fā)植物細(xì)胞氧化損傷：而MG和ROS水平的上升又可反饋激活Gly的過量表達(dá)，進(jìn)而通過蛋白互作等方式提高抗氧化酶活性，來降低ROS水平，從而提高植物抗逆境脅迫的能力。本研究結(jié)果顯示，LeGlyⅠ基因的表達(dá)量在Mv模擬氧化脅迫處理8、12 h顯著上升，24 h顯著下降，表明其參與了番茄植株對(duì)氧化脅迫的應(yīng)答。

綜上，LeGlyⅠ基因在番茄抵抗氧化脅迫過程中發(fā)揮了重要作用，這為后續(xù)深入研究Gly參與抵抗非生物脅迫以及提高番茄抗逆能力提供理論參考依據(jù)。