【關(guān)鍵詞】氟苯尼考；蛻膜化；子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞；線粒體

【中圖分類(lèi)號(hào)】R715.3 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-01-08

氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)LO）作為一種新型抗生素，因能替代有嚴(yán)重不良反應(yīng)的氯霉素而得到廣泛應(yīng)用[1]。研究發(fā)現(xiàn)FLO具有明顯的生殖毒性，不僅損傷哺乳動(dòng)物生殖能力、影響后代存活率，而且孕期母體持續(xù)性接觸FLO會(huì)對(duì)母體和胎兒造成影響，但其機(jī)制仍有待補(bǔ)充[2-5]。

小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化過(guò)程是指早期妊娠階段，小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（mouse endometrial stromalcells，mESCs）在激素的精確調(diào)節(jié)下，體積增大并快速增殖，分化為小鼠蛻膜基質(zhì)細(xì)胞（mouse decidualstromal cells，mDSCs）[6，11]。增殖和凋亡平衡是蛻膜化順利進(jìn)行的關(guān)鍵因素之一，這種平衡被打破可能會(huì)導(dǎo)致蛻膜化異常，產(chǎn)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和胎兒死亡等嚴(yán)重后果[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)FLO 能抑制胚胎干細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)而影響雞胚胎發(fā)育并誘導(dǎo)早期胚胎死亡[8]。然而，F(xiàn)LO與蛻膜化的關(guān)系尚不完全清楚。

線粒體是細(xì)胞的能量工廠，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞死亡等過(guò)程[9]。子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化是一個(gè)需要大量ATP的過(guò)程，因此線粒體在蛻膜化過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[10]。研究表明FLO可以抑制細(xì)菌和線粒體蛋白的合成，降低線粒體膜電位，影響ATP水平及產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性[5]。然而，在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過(guò)程中，F(xiàn)LO是否會(huì)影響其線粒體功能，有待進(jìn)一步研究。

鑒于此，本課題組構(gòu)建了FLO暴露的原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型，探究FLO暴露對(duì)蛻膜化的影響及線粒體在其中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

FLO 為中國(guó)MCE 公司產(chǎn)品；無(wú)酚紅DMEM/F-12 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雌二醇、孕酮、牛血清蛋白和鬼筆環(huán)肽為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；膠原酶Ⅱ、Ⅱ型中性蛋白酶為中國(guó)索萊寶公司產(chǎn)品；4%多聚甲醛、HBSS、HRP-羊抗兔IgG和HRP-羊抗小鼠IgG為中國(guó)博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記羊抗兔IgG、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒為中國(guó)碧云天公司產(chǎn)品；HOXA10為美國(guó)Santa公司產(chǎn)品；PCNA、TOMM20為中國(guó)proteintech 公司產(chǎn)品；凝膠成像儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；激光共聚焦顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 mESCs分離與處理

昆明小鼠（8～10周齡，25～30 g）購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IACUC-CQMU-2023-12052）后依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理和福利標(biāo)準(zhǔn)按照已有報(bào)道分離與培養(yǎng)mESCs，具體步驟如下。使用吸入過(guò)量二氧化碳窒息法處死昆明鼠后取出子宮，HBSS清洗后加入酶Ⅰ（Ⅱ型中性蛋白酶和胰蛋白酶配置）剪碎子宮，酶I消化2.5 h。離心后加入酶Ⅱ（膠原酶Ⅱ配置）置于37 ℃消化30 min，過(guò)濾后離心2次，加入培養(yǎng)基重懸后種板。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后加入10 nmol/L雌二醇和1 μmol/L的孕酮處理48 h進(jìn)行蛻膜化誘導(dǎo)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道本課題組分別加入1.56、6.25、25.00 μg/mL FLO[5，7]，構(gòu)建FLO暴露的原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型。

1.3 ATP檢測(cè)

按照上述方法構(gòu)建FLO暴露的原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型，細(xì)胞處理48 h后根據(jù)ATP檢測(cè)試劑盒配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后配置ATP檢測(cè)工作液（ATP 檢測(cè)試劑稀釋液：ATP 檢測(cè)試劑=1∶9），每孔加入200 μL ATP裂解液充分吹打后使用4 ℃離心機(jī)離心，離心后取上清。每個(gè)檢測(cè)孔加入100 μL ATP工作液，室溫放置3～5 min后每個(gè)檢測(cè)孔加入20 μL樣本，立刻用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)RLU值。再使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，用RLU值除以樣本的蛋白濃度，得到樣本ATP水平。

1.4 Western blo

t按照上述方法構(gòu)建FLO暴露的原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型，細(xì)胞處理48 h后加入適量RIPA裂解液，裂解15 min后100 ℃煮15 min，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度上樣。配置10% SDS-PAGE分離膠進(jìn)行電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，封閉后孵育一抗（HOXA10、PCNA），4 ℃過(guò)夜后洗滌3次，孵育二抗，再洗滌后使用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.5 免疫熒光

按照上述方法構(gòu)建FLO暴露的原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型，細(xì)胞處理48 h后加入4%多聚甲醛固定，洗滌后滴加一抗（TOMM20）于4 ℃過(guò)夜，洗滌后滴加熒光二抗（FITC標(biāo)記羊抗兔）避光孵育1 h。再次洗滌后滴加含DAPI的抗熒光猝滅劑，使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞并拍攝成像。

1.6 Mito-tracker red染色

按照上述方法構(gòu)建FLO暴露的原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型，細(xì)胞處理48 h后將0.5 μL Mitotrackerred母液加入5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基中，得到100 mmol/LMito-tracker red工作液。洗滌細(xì)胞后取適量工作液，于37 ℃避光孵育30 min，清洗后使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞并拍攝成像。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FLO對(duì)mDSCs細(xì)胞凋亡的影響

將細(xì)胞接種于6孔板后，按照上述方法構(gòu)建FLO暴露的原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型，細(xì)胞處理48 h后使用PBS清洗細(xì)胞，然后胰酶消化細(xì)胞，離心、重懸2次后加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，立即使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間樣本比較：當(dāng)參數(shù)符合正態(tài)分布、方差齊時(shí)，運(yùn)用One-wayANOVA方法進(jìn)行比較。當(dāng)參數(shù)符合正態(tài)分布、方差不齊時(shí)，運(yùn)用Tamhane’s T2方法進(jìn)行比較；當(dāng)參數(shù)不符合正態(tài)分布時(shí)，運(yùn)用Kruskal-Wallis方法進(jìn)行比較。使用GraphPad Prism8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 FLO損傷子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化進(jìn)程

首先，構(gòu)建了原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型，采用雌二醇、孕酮將小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)為小鼠子宮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞（mDSCs）。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，采用1.56、6.25、25.00 μg/mL FLO[5，7]暴露48 h后，檢測(cè)FLO對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的影響。鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1.56、6.25 μg/mL劑量組mDSCs的細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯改變，25.00 μg/mL劑量組的子宮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)異常（圖1）。

采用Western Blot對(duì)蛻膜化標(biāo)志分子HOXA10的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，25.00 μg/mL 劑量組HOXA10的表達(dá)顯著降低（圖2A、B，F(xiàn)=4.695、P=0.002）。

2.2 FLO暴露導(dǎo)致子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過(guò)程中的細(xì)胞增殖、凋亡紊亂

蛻膜化伴隨著子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖與凋亡等一系列過(guò)程，本課題組檢測(cè)FLO 暴露對(duì)其增殖、凋亡的影響[8]。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1.56和6.25 μg/mL劑量組的細(xì)胞凋亡水平（早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞之和）未見(jiàn)明顯差異，25.00 μg/mL劑量組的細(xì)胞凋亡水平顯著增加（圖3A、B，F(xiàn)=0.2395、P=0.024）。

隨后，本課題組采用Western blot對(duì)細(xì)胞增殖標(biāo)志分子進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。結(jié)果顯示，F(xiàn)LO暴露48 h后，增殖相關(guān)分子PCNA的表達(dá)在25.00 μg/mL劑量組顯著降低（圖4A、B，F(xiàn)=1.306、P=0.039）。以上結(jié)果提示，25.00 μg/mL FLO 暴露抑制mDSCs細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡，導(dǎo)致蛻膜化損傷。

2.3 FLO暴露損傷子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過(guò)程中的線粒體功能

蛻膜化過(guò)程需要大量能量，而線粒體是機(jī)體能量釋放的重要場(chǎng)所，本研究進(jìn)一步探究FLO暴露對(duì)mDSCs線粒體功能的影響[1，9]。TOMM20免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，25.00 μg/mL 劑量組熒光強(qiáng)度降低（圖5A、B，F(xiàn)=1.897、P=0.010）。采用Mito-tracker Red對(duì)線粒體進(jìn)行熒光染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，25.00 μg/mL 劑量組的線粒體形態(tài)異常，呈短棒狀或顆粒狀（圖6A）。此外，與對(duì)照組相比，25.00 μg/mL劑量組的ATP水平降低（圖6B，F(xiàn)=3.971、P=0.003）。以上結(jié)果提示，25.00 μg/mL FLO暴露導(dǎo)致的蛻膜化損傷與線粒體功能障礙密切相關(guān)。

3討論

抗生素廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域，以應(yīng)對(duì)動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療需求。隨著人口增長(zhǎng)和生活條件的變遷，抗生素的使用量隨之增加，從而增加了人類(lèi)接觸抗生素的機(jī)會(huì)[12]。人類(lèi)可以通過(guò)藥物、皮膚、吸入攝入、飲食攝入等接觸抗生素，與短期內(nèi)通過(guò)治療疾病的藥物攝入相比，膳食攝入因?yàn)榭赡軐?dǎo)致長(zhǎng)期、低劑量的暴露在近年來(lái)受到更多的關(guān)注[13]。

FLO 已經(jīng)成為畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用范圍最廣、使用量最大的抗生素之一[14]。隨著FLO的大量應(yīng)用，關(guān)于其在各類(lèi)食品動(dòng)物和人體中的超標(biāo)殘留報(bào)道也與日俱增，引起了公眾的廣泛關(guān)注[15]。越來(lái)越多的研究表明，F(xiàn)LO具有免疫毒性和生殖毒性，干擾人體代謝，危害雌性和雄性的生殖健康[3]。抗生素暴露與女性不孕不育關(guān)系的研究表明，一定濃度抗生素暴露可以降低女性不孕不育風(fēng)險(xiǎn)，但暴露劑量增加，則會(huì)增加不孕不育風(fēng)險(xiǎn)[16]；對(duì)人群抗生素暴露進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LO作為獸用抗生素，具有潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)[4]。FLO的平均每日允許攝入量為0～3 μg（/ kg·d），即60 kg體質(zhì)量成人每日從飲食中攝取0～180 μg的FLO沒(méi)有健康危害[17]，遠(yuǎn)高于本實(shí)驗(yàn)最高劑量25.00 μg/mL。本研究進(jìn)一步探究了FLO對(duì)哺乳動(dòng)物生殖能力的影響，更全面地評(píng)估其潛在的生殖毒性，為FLO的合理使用提供更為可靠的科學(xué)依據(jù)。

本研究首次探究了FLO在子宮內(nèi)膜蛻膜化過(guò)程中的作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)小鼠子宮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)FLO暴露48 h后，25.00 μg/mL劑量組的細(xì)胞形態(tài)異常，蛻膜化標(biāo)志分子HOXA10的表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)25.00 μg/mL劑量組小鼠子宮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平顯著增加、增殖相關(guān)分子增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)顯著降低，提示在蛻膜化過(guò)程中，F(xiàn)LO暴露打破了小鼠子宮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞增殖、凋亡平衡。此外，本課題組還發(fā)現(xiàn)25.00 μg/mL劑量組小鼠蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的線粒體功能異常，線粒體形態(tài)受損、線粒體外膜蛋白TOMM20表達(dá)顯著降低和ATP水平顯著降低，提示線粒體外膜、內(nèi)膜受損。綜上，本研究提出FLO暴露可能與線粒體功能打破mDSCs的細(xì)胞增殖、凋亡平衡，損傷蛻膜化進(jìn)程有關(guān)。然而需要指出的是本研究集中在線粒體結(jié)構(gòu)的觀察和某些功能指標(biāo)的變化，關(guān)于氟苯尼考損傷子宮內(nèi)膜蛻膜化的機(jī)制探索還需要更深入的研究。

抗生素在人體內(nèi)的濃度直接影響生理過(guò)程，在適當(dāng)?shù)臐舛认?，抗生素能夠減輕癥狀、恢復(fù)正常生理狀態(tài)，對(duì)人體有益[18]；然而，當(dāng)濃度超過(guò)一定閾值時(shí)，這些抗生素可能引發(fā)毒性反應(yīng)、損傷細(xì)胞或器官，甚至產(chǎn)生耐藥性[19]。本研究發(fā)現(xiàn)1.56和6.25 μg/mL劑量組FLO對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化進(jìn)程沒(méi)有損傷作用。然而，在25.00 μg/mL 劑量組中，F(xiàn)LO明顯打破了子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在蛻膜化過(guò)程中的增殖、凋亡平衡，導(dǎo)致蛻膜化損傷。此外本課題組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)25.00 μg/mL劑量組FLO處理的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在蛻膜化過(guò)程中的線粒體功能異常。因此，本課題組推測(cè)25.00 μg/mL 劑量組FLO可能通過(guò)干擾子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞線粒體功能導(dǎo)致蛻膜化受損。

線粒體損傷可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)不足，影響蛻膜化過(guò)程中細(xì)胞的代謝活動(dòng)和正常功能，進(jìn)而干擾蛻膜化過(guò)程[20]。對(duì)于這種影響機(jī)制，一種可能的作用途徑是FLO破壞線粒體膜的完整性，導(dǎo)致線粒體內(nèi)部環(huán)境紊亂，影響到氧化磷酸化和細(xì)胞呼吸鏈等重要代謝過(guò)程，導(dǎo)致線粒體功能障礙[21]。這可能使蛻膜化過(guò)程中細(xì)胞無(wú)法獲得足夠能量和代謝物質(zhì)來(lái)支持正常的蛻膜化進(jìn)程，從而影響到器官形成以及胚胎發(fā)育[22]。FLO還可能干擾線粒體內(nèi)酶活性，影響到線粒體的代謝反應(yīng)，這些影響可能導(dǎo)致線粒體功能異常，影響細(xì)胞的正常生理功能和代謝活動(dòng)[23]。然而，F(xiàn)LO通過(guò)何種機(jī)制影響子宮蛻膜基質(zhì)細(xì)胞線粒體功能，進(jìn)而損傷蛻膜化進(jìn)程，有待進(jìn)一步研究。對(duì)于具體的機(jī)制和在胚胎著床中的作用，還需要更多的科學(xué)研究和證據(jù)來(lái)全面了解。

（責(zé)任編輯：李青穎）