【關(guān)鍵詞】非小細(xì)胞肺癌；同源重組修復(fù)缺陷；基因組不穩(wěn)定評(píng)分；同源重組通路

【中圖分類號(hào)】R734.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-10-30

據(jù)國(guó)家癌癥中心2022年發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示：2016年我國(guó)肺癌新發(fā)病例82.8萬(wàn)例，死亡病例65.7萬(wàn)例，發(fā)病率和死亡率均位于惡性腫瘤之首[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是常見(jiàn)的病理亞型，具有高侵襲性、快速轉(zhuǎn)移性，目前靶向治療和免疫治療已廣泛應(yīng)用于晚期NSCLC的一線治療中，然而，仍有很多患者不能從現(xiàn)有療法中受益或進(jìn)展，導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率增加。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]抑制劑是一類很有前途的新型癌癥治療劑，對(duì)同源重組（homologous recombination，HR）介導(dǎo)的DNA修復(fù)受損的腫瘤最有效[2]。它們已被批準(zhǔn)用于治療乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌等常與關(guān)鍵HR基因（如BRCA1/2）功能喪失突變相關(guān)的實(shí)體瘤類型[3]。其他具有HR缺陷的腫瘤類型也可能受益于PARP抑制劑治療。

DNA損傷常通過(guò)相互關(guān)聯(lián)的多種途徑修復(fù)，其中同源重組修復(fù)（homologous recombination repair，HRR）是負(fù)責(zé)修復(fù)真核細(xì)胞DNA 雙鏈損傷（DNAdouble-strand breaks，DSBs）與DNA鏈間交聯(lián)（inter?strand crosslinks）最為準(zhǔn)確且高保真的DNA修復(fù)系統(tǒng)。同源重組依賴眾多的同源重組修復(fù)蛋白，包括BRCA1/2，MNR 復(fù)合物（MRE11/RAD50/NBS1）等。一旦編碼同源重組修復(fù)蛋白的基因發(fā)生突變，可能導(dǎo)致蛋白功能改變或缺失，引起同源重組修復(fù)缺陷（homologous recombination deficiency，HRD），此時(shí)細(xì)胞只能依賴精確性差的非同源末端鏈接（NonhomologousEnd-joining，NHEJ）進(jìn)行DSB損傷修復(fù)，從而導(dǎo)致突變的累積以及基因組的不穩(wěn)定。目前常用基因組不穩(wěn)定評(píng)分（genomic instability score，GIS）來(lái)評(píng)價(jià)HRD狀態(tài)。

HRD作為NSCLC不同療法反應(yīng)的生物標(biāo)志物的作用仍在研究中。Doissy M等人發(fā)現(xiàn)在接受含鉑化療的肺腺癌患者中，具有較高GIS評(píng)分的人群獲得了超過(guò)20個(gè)月的反應(yīng)持續(xù)時(shí)間，這些患者的評(píng)分在GDC數(shù)據(jù)門戶中排名在489例肺癌病例中名列前茅。同時(shí)，該研究使用HRDetect測(cè)定的高GIS評(píng)分（gt;0.70）可預(yù)測(cè)肺癌細(xì)胞系對(duì)奧拉帕利和他拉唑帕尼的敏感性，提示PARP抑制劑在特定人群中可能起作用[4]。

本研究旨在通過(guò)高通量測(cè)序檢測(cè)NSCLC患者GIS評(píng)分，分析其與臨床病理特征有無(wú)相關(guān)性及其分布類型，探索NSCLC患者HRD的臨床意義及應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 患者和樣本

將2020年1月至2022年1月在本院接受治療的490例NSCLC患者納入研究，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本或手術(shù)后標(biāo)本病理檢查確診為NSCLC。病理類型依據(jù)世界衛(wèi)生組織2015版《肺部腫瘤分類》由本院病理亞專科醫(yī)師確認(rèn)[5]。肺癌TNM分期參照AJCC肺癌TNM分期系統(tǒng)（2017年第八版）[6]。癌組織的石蠟切片由本院病理科制作成厚度為4～5 μm。組織腫瘤占比≥30% 的樣本為335 例，納入后續(xù)分析。抽取外周血2 mL用于對(duì)照。所有的患者都提供了知情同意書。收集的臨床信息包括年齡、性別、吸煙史、分期、組織學(xué)類型等。本研究方案經(jīng)過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有進(jìn)入本研究患者檢查前均先簽署知情同意書。

1.2 HRD狀態(tài)的確定

1.2.1 DNA 測(cè)序 采用廣州燃石醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司的Oncoscreen Plus 520個(gè)基因的檢測(cè)試劑盒，采用雜交捕獲的建庫(kù)方法，對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行靶向捕獲和擴(kuò)增，構(gòu)建樣本文庫(kù)。目標(biāo)區(qū)域大小1.83 M，選擇均勻分布于人類基因組上的9 000個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)而成，目標(biāo)基因區(qū)域的變異檢測(cè)HRD算法基于BRIDGE算法，使用Nextseq550（Illumina，Inc，Madison，WI，USA）進(jìn)行測(cè)序，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域的變異檢測(cè)。HR通路相關(guān)的35 個(gè)基因包括：ATM、ATR、BARD1、BLM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCI、FANCL、FANCM、GEN1、NBN、PALB2、POLD1、RAD21、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51D、RAD52、RAD54L、RECQL4、RPA1、WRN、XRCC2、BAP1、CDK12、PPP2R2A。

1.2.2 GIS評(píng)分檢測(cè) 對(duì)下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)拆分，數(shù)據(jù)質(zhì)控，并與人類參考基因組進(jìn)行比對(duì)。每個(gè)染色體拷貝數(shù)根據(jù)物理或生物學(xué)特性被分為3類：雜合性缺失（loss of hetero?zygosity，LOH）、端粒等位基因失衡（telomeric allelic imbal?ance，TAI）、大片段遷移（large-scale state transition，LST），LOH定義為大于15 Mb且小于整個(gè)染色體長(zhǎng)度的雜合性缺失；TAI定義為延伸到其中1個(gè)亞端粒但不超過(guò)著絲粒且大于11 Mb的等位基因不平衡的染色體片段；LST定義為2個(gè)相鄰區(qū)域（2個(gè)區(qū)域長(zhǎng)度均≥10 Mb，且區(qū)域間距小于3 Mb）之間的染色體斷裂位點(diǎn)，評(píng)估方法參照之前報(bào)道的文獻(xiàn)而得[7-10]。最后，LOH、TAI、LST三者分值相加，得到評(píng)分結(jié)果。

1.3 變異分類

參照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American Col?lege of Medical Genetics and Genomics，ACMG）的變異分類標(biāo)準(zhǔn)，分為5 類：①良性（benign，LB）；②可能良性（likely be?nign，LB）；③ 意義未明（variant of uncertain significance，VUS）；④ 可能致病性（likely pathogenic，LP）；⑤ 致病性（pathogenic，P）。將變異按照體系和胚系分為2類，攜帶P及LP的胚系變異的患者列為胚系突變組，攜帶P/LP/VUS的體系變異的患者列為體系突變組。

1.4 腫瘤突變負(fù)荷檢測(cè)

腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）表示基因組上每一百萬(wàn)個(gè)堿基發(fā)生的體細(xì)胞突變個(gè)數(shù)。本檢測(cè)根據(jù)520個(gè)基因檢測(cè)范圍內(nèi)的非沉默突變（排除腫瘤熱點(diǎn)突變）來(lái)評(píng)估基因組的突變負(fù)荷。算法=體細(xì)胞突變個(gè)數(shù)/靶區(qū)域大?。?.83 M）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，本研究中計(jì)量資料均不符合正態(tài)分布，采用四分位數(shù)Md（P25，P75）描述非正態(tài)分布計(jì)量資料情況，非正態(tài)分布計(jì)量資料以及等級(jí)資料2組時(shí)使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較組間差異；超過(guò)2組時(shí)使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)來(lái)確定組間整體差異，并進(jìn)一步使用Dunn-Bonferroni檢驗(yàn)比較兩兩組間差異；使用Spearman相關(guān)分析TMB和GIS評(píng)分之間的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 GIS評(píng)分和患者臨床特征的關(guān)系

335 例NSCLC 患者的中位年齡59 歲（28～84 歲），男性184例，女性151例。其中有277例腺癌，46例鱗癌，12例為其他病理類型（5例肉瘤樣癌，6例腺鱗癌，1例神經(jīng)內(nèi)分泌癌）。Tis期14例，Ⅰ期190例，Ⅱ期27例，Ⅲ期40例，Ⅳ期64例。如前所述，本課題組確定了每個(gè)患者的GIS評(píng)分，其中男性患者、年齡大、腫瘤TNM分期晚、有吸煙史、鱗癌類型較腺癌會(huì)導(dǎo)致評(píng)分更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-5.083，Plt;0.001；Z=2.973，P=0.003；Z=8.225，Plt;0.001；Z=4.655，Plt;0.001；Z=-7.082，Plt;0.001）（表1）。

2.2 HRR通路基因變異類型和GIS評(píng)分的相關(guān)性

將基因變異進(jìn)一步分為體系和胚系突變，分析胚系突變僅篩選與HRR相關(guān)的P/LP胚系突變基因，體系突變篩選與HRR相關(guān)的VUS/P/LP體系突變基因，有25個(gè)樣本存在HRR基因胚系突變，有88個(gè)樣本存在HRR基因體系突變。所有樣本按照胚系突變（P/LP），體系突變（VUS/P/LP），其余則劃分為野生型。3組GIS評(píng)分有差異（Z=25.563，Plt;0.001），其中體系突變樣本GIS評(píng)分高于野生型（Z=5.012，Plt;0.001），但是胚系vs. 體系（Z=1.387，P=0.497），野生型vs. 胚系（Z=1.503，P=0.398）之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.3 HRR通路基因突變率

335例NSCLC患者共檢出33個(gè)HRR相關(guān)基因的胚系P/LP和體系P/LP/VUS突變位點(diǎn)共162個(gè)，這些位點(diǎn)主要集中在下列HRR 基因：ATM、RECQL4、ATR、FANCM、BRCA1、FANCA、BRIP1、NBN、WRN 等（圖1），其中ATM 基因占11%（18/162）、RECQL4基因占9%（14/162）、ATR 基因占6%（10/162）、FANCM 基因占6%（9/162）、BRCA1 基因占5%（8/162）、FANCA 基因占5%（8/162）、BRIP1 基因占4%（7/162）、NBN 基因占4%（7/162）、WRN 基因占4%（7/162）。

2.4 與GIS評(píng)分顯著相關(guān)的HRR基因

進(jìn)一步分析HRR通路里具體是哪些基因變異導(dǎo)致GIS評(píng)分升高，納入P/LP胚系突變基因及VUS/P/LP體系突變基因，明確了HRR 通路35個(gè)基因里BRCA2、FANCI 和FANCA基因變異會(huì)導(dǎo)致GIS 評(píng)分升高（Z=-2.805，P=0.005；Z=-2.216，P=0.027；Z=-2.478，P=0.013）。HRR 通路其他基因與GIS評(píng)分升高無(wú)相關(guān)性（表3）。

2.5 GIS評(píng)分與TMB之間的相關(guān)性

采用Spearman相關(guān)分析患者GIS評(píng)分和TMB值之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示GIS評(píng)分和TMB之間存在正相關(guān)性（rs=0.504，Plt;0.001）。

3討論

肺癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率一直位于惡性腫瘤前列，在我國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率也是逐年增加[1]。同源重組修復(fù)缺陷可通過(guò)同源重組修復(fù)途徑基因的有害改變或基因組瘢痕的產(chǎn)生特征來(lái)識(shí)別，已被證明可以識(shí)別受益于PARP 抑制劑的患者[11]。PARP 抑制劑是小分子DNA損傷藥物，對(duì)有HRD的細(xì)胞發(fā)揮“合成致死”作用[12]。雖然鉑類敏感性通常被認(rèn)為是PARP 抑制劑敏感性的替代標(biāo)志物（因?yàn)镠RD增強(qiáng)了兩種藥物的毒性），但相關(guān)性并不完全：PARP抑制劑反應(yīng)同樣也可發(fā)生在鉑類耐藥患者中[13]，并非所有鉑類敏感患者都受益于PARP抑制劑。更直接的HRD評(píng)分方法可能有助于識(shí)別PARP抑制劑敏感患者，而無(wú)論鉑類狀態(tài)如何。因HRD可產(chǎn)生特定的、穩(wěn)定的且可量化的基因組改變，因此可通過(guò)構(gòu)建基于基因組特征分析的評(píng)估方法來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤HRD狀態(tài)及其程度，目前國(guó)際國(guó)內(nèi)主流大多采用LOH、TAI和LST3個(gè)指標(biāo)來(lái)綜合評(píng)價(jià)HRD狀態(tài)，其相較于單個(gè)指標(biāo)而言，基于SNPs的綜合計(jì)算評(píng)分的方法能更全面地反映整個(gè)人類基因組的瘢痕狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)基因組不穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。

本研究發(fā)現(xiàn)男性患者、年齡大、有吸煙史、腫瘤TNM分期晚、鱗癌等因素均會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定評(píng)分更高。眾所周知，基因組不穩(wěn)定性與涉及氧化應(yīng)激的幾種機(jī)制有關(guān)，這些因素包括吸煙、身體成分受損、不健康的生活方式和遺傳性癌癥史等。而氧化應(yīng)激會(huì)增加DNA斷裂的速度[14]。對(duì)肺鱗癌患者吸煙相關(guān)基因及其功能分析研究發(fā)現(xiàn)，HR通路是吸煙加重癌癥的重要途徑。香煙煙霧誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂主要可以通過(guò)HRR來(lái)修復(fù)[15]。HRR通路的許多基因與吸煙影響肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)[16-17]。Hammouz RY 等[18]還構(gòu)建了1 個(gè)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)吸煙顯著影響HR誘發(fā)肺腺癌。本研究發(fā)現(xiàn)男性患者GIS評(píng)分顯著高于女性患者，可能的原因在于吸煙人群主要集中于男性所致。同時(shí)相較于年齡小的人群，年齡大的患者人群GIS評(píng)分更高。Qing T[19]等的研究也曾報(bào)道HRD評(píng)分與患者確診時(shí)的年齡和遺傳背景相關(guān)。Su RJ等[20]報(bào)道較高的GIS評(píng)分與較晚的腫瘤分期有關(guān)，和本研究結(jié)果一致。1項(xiàng)基于卵巢癌GIS評(píng)分的研究中發(fā)現(xiàn)，胚系突變組的GIS評(píng)分高于體系突變組[21]。而另一項(xiàng)關(guān)于HRD評(píng)分在泛癌腫的分布顯示，HRR基因的胚系和體系變異都會(huì)顯著影響乳腺癌和卵巢癌的HRD評(píng)分，而在肺腺癌中，HRD評(píng)分升高與體系變異相關(guān)[19]，這與本研究結(jié)果一致。

在5%～10%的NSCLC病例中發(fā)現(xiàn)攜帶BRCA1/2基因的體細(xì)胞致病變異[22]，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)其他各種DNA損傷檢查點(diǎn)（DNA damage repair，DDR）基因的突變[23]。目前尚不明確肺癌HR通路里的HRR 基因突變情況。本研究分析發(fā)現(xiàn)ATM、RECQL4、ATR、FANCM、BRCA1、FANCA、BRIP1、NBN、WRN 等基因突變頻率較高。ATM 和ATR 基因是DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)中的核心成分，分別在雙鏈斷裂修復(fù)和單鏈斷裂修復(fù)中起著中心調(diào)節(jié)作用[24]。ATM 是乳腺癌、卵巢癌和其他腫瘤里僅次于BRCA1/2以外最常見(jiàn)的HRR通路突變基因。BRCA1/2、ATM、ATR 基因是乳腺癌、卵巢癌中主要導(dǎo)致HRD的相關(guān)基因，1項(xiàng)關(guān)于DDR 基因在NSCLC中的研究表明，在DDR 陽(yáng)性NSCLC，最常見(jiàn)的DDR 突變基因是ATM（9.4%）、ATR（4.8%）、BRCA2（4.1%）[25]。CDK12 基因突變已被證明對(duì)乳腺癌和卵巢細(xì)胞系中的PARP抑制劑具有敏感性[26]。Study19回顧性研究分析也發(fā)現(xiàn)，攜帶CDK12、RAD51B、BRIP1 等基因突變與攜帶BRCA1/2基因突變的患者接受PARP抑制劑維持治療獲得類似的PFS生存獲益[27]。進(jìn)一步分析HRR 通路里具體哪些基因變異導(dǎo)致GIS 評(píng)分升高，發(fā)現(xiàn)BRCA2、FANCI 和FANCA 基因變異與GIS 評(píng)分升高顯著相關(guān)，而其他基因與GIS評(píng)分無(wú)顯著相關(guān)性，區(qū)別于乳腺癌、卵巢癌里主要是BRCA1/2、ATM 和ATR 基因變異影響基因組不穩(wěn)定性，導(dǎo)致HRD。

對(duì)與肺鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的DDR 基因的分析表明，DDR 基因的致病突變與腫瘤突變負(fù)荷之間存在相關(guān)性，并且腫瘤負(fù)荷增加與受影響的DDR 基因的數(shù)量相關(guān)[28]。1項(xiàng)針對(duì)頭頸鱗癌患者的分析發(fā)現(xiàn)，HRD 評(píng)分升高的患者具有顯著更高的TMB 值[29]。同時(shí)，無(wú)論治療方案和臨床病理特征如何，HR通路基因突變?cè)诜磻?yīng)更好的免疫治療患者中發(fā)生得更頻繁。免疫治療患者HR突變帶來(lái)的更高的TMB和更長(zhǎng)的生存期，所有這些都支持HRD檢測(cè)作為新型NSCLC免疫治療生物標(biāo)志物的潛力[30]。

（責(zé)任編輯：李青穎）