摘要：【目的】篩選出對生姜青枯病病原菌具有較好拮抗效果的芽孢桿菌，并優(yōu)化其發(fā)酵條件，旨在為豐富生姜青枯病的生防芽孢桿菌菌種資源及生防制劑的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。【方法】以生姜根際土壤為研究對象，以生姜青枯病菌為靶標(biāo)，通過稀釋涂布法和抑菌圈法從中分離并篩選出能高效拮抗生姜青枯病菌的芽孢桿菌；通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測定和分子生物學(xué)鑒定，確定拮抗菌株的分類地位；采用牛津杯法測定拮抗菌株對生姜青枯病菌的抑菌活性，并結(jié)合單因素和正交試驗對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化?！窘Y(jié)果】從生姜根際土壤中分離出1株對生姜青枯病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的菌株HC-5，其抑菌圈直徑達(dá)0.71 cm。綜合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及分子鑒定結(jié)果，將菌株HC-5鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。單因素和正交試驗結(jié)果顯示，菌株HC-5的最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分為糯米粉5.0 g/L、酵母浸粉7.0 g/L、硫酸鋅11.0 g/L，最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度35℃、培養(yǎng)時間36 h、接種量1.0%、轉(zhuǎn)速180 r/min、初始pH 5.5、裝液量100 mL。優(yōu)化后菌株HC-5無菌上清液對生姜青枯病菌的抑菌圈直徑增大至3.03 cm，相比于LB和發(fā)酵培養(yǎng)基條件下分別增大76.2%和62.9%?！窘Y(jié)論】菌株HC-5對生姜青枯病菌具有良好的拮抗效果，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后其無菌上清液對生姜青枯病菌的抑菌活性顯著增強(qiáng)。菌株HC-5具有開發(fā)成生姜青枯病生防菌劑的潛力。

關(guān)鍵詞：生姜；青枯??；貝萊斯芽孢桿菌；拮抗活性；正交試驗；發(fā)酵條件

中圖分類號：S435.67文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）02-0468-11

Screening，identification and optimization of fermentation con-ditions for Bacillus antagonistic against Ralstonia solanacearum

CUI Wen-yan'，ZHANG Jia-jia1，YU Ling-li1，ZHANG Gui-yun'，WANG Wen-jia1，PENG Ling'，LUO Xi-yan1，HE Peng-jie1，2（'Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou 550025，China;2Key Laboratory of Green "Pesticide and Agricultural Bioengineering，Ministry of Education，Guizhou University，Guiyang， Guizhou 550025，China）

Abstract：[Objective]This study aimed to identify Bacillzs strains that showed effective antagonistic activity against "the ginger bacterial wilt causative pathogen Ralstonia solanacearum，and to optimize the fermentationconditions of these "strains，thereby providing theoretical foundation for enriching the resources of biocontrol Bacillus strains and further de-veloping and applying biocontrol agents for ginger wilt disease.【Method】Gingerrhizosphere soil samples were research object，ginger R.solanacearum strains were targets，dilution coating method and antibacterial circle method wereem-ployed to screen strains exhibitingpotent antagonistic effects against R.solanacearum.Antagonistic strains were then clas-sified based on morphological observations，physiological and biochemical testing，as well as molecular biological identi-fication.The antibacterial activity of the selected strains against R.solanacearum was quantified using the Oxford cup method.Subsequently，both single-factor and orthogonal experiments were conducted to refine their fermentation condi tions.[Result]Strain HC-5，isolated from the ginger rhizosphere soil and exhibiting strong antagonistic properties against R.solanacearum formed an inhibition zone of 0.71 cm in diameter.Integratingmorphological features，physiological and biochemical characteristics and molecular identification results，HC-5 was classified as Bacillus velezensis.The results of single factor and orthogonal experiments showed that，optimal growth medium for strain HC-5 was established to contain glutinous rice four（5.0 g/L），yeast extract（7.0 g/L），and zinc sulfate（11.0 g/L）.The best fermentation conditions were determined as temperature of 35℃，fermentation duration of 36 h，inoculation amount of 1.0%，rotation speed of 180 r/min，initial pH of 5.5 and liquid volume of 100 mL.The diameter of theantibacterial zone of the sterile supernatant of the optimized strain HC-5 against R.solanacearum increased to 3.03 cm，which was 76.2%and 62.9%larger than under LB and fermentation medium conditions，respectively.【Conclusion】Strain HC-5 demonstrates asubstantial antagonistic effect against R.solanacearum.The enhanced antibacterial activity of its sterile supernatant following fermentation condi-tion optimization suggestsits potential asa biocontrol agent incombatingginger bacterial wilt.

Keywords：ginger;bacterial wilt;Bacillus velezensis;antagonistic activity;orthogonal test;fermentation condition

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32160671）;GuizhouBasic Research Plan Project（QKHJC-ZK〔2021〕Yiban 147）;Guizhou Science and Technology Support Project（QKHZC[2020]4Y109）;Doctoral Startup Foundation of Guizhou Universityof TraditionalChinese Medicine（GZYBSQD〔2020〕20）

0引言

【研究意義】生姜（Zingiber officinale Roscoe）為姜科姜屬多年生草本植物，在我國栽培歷史悠久，是我國最重要的藥食兩用作物之一（汪茜等，2023），主產(chǎn)于貴州、湖北和四川等地。生姜既是一種重要的香辛調(diào)味品，也是一種重要的中藥材，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和保健等領(lǐng)域。據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，生姜性辛溫、入中焦，能散寒溫中；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，生姜具有抗氧化、抗炎、抗菌和調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)等多種功效（Mao et al.，2019），對心臟、腎等器官有較好的保護(hù)作用，有助于緩解胃腸痙攣、降低血壓等（李錄久等，2009）。近年來，隨著國內(nèi)外市場對生姜需求的增長，生姜在我國的種植面積不斷擴(kuò)大。然而，由于其無性繁殖特性和重茬種植習(xí)慣，生姜在整個栽培過程中極易受到病蟲害的侵染，嚴(yán)重影響生姜的產(chǎn)量與品質(zhì)（周弦等，2022）。其中，由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacarum）引起的青枯病是生姜生產(chǎn)中最嚴(yán)重的一種土傳病害（Prameela and Suseela，2020），該病害破壞性極大，一旦發(fā)生，可造成植株莖、葉及根莖腐爛，嚴(yán)重時甚至整株死亡，導(dǎo)致產(chǎn)量減少30%～70%以上，甚至絕收（Jiang et al.，2017）。目前，生姜青枯病的防治主要依賴于化學(xué)防治，但多數(shù)化學(xué)藥劑不僅防效有限，且大范圍、長期施用后還可能引發(fā)病菌耐藥性、環(huán)境污染、藥物殘留和根際微生態(tài)破壞等問題（Jiang et al.，2017）。相比之下，以施用微生物菌劑為代表的生物防治不僅能有效防控病害，還具有選擇性強(qiáng)、綠色環(huán)保等優(yōu)點（Inoue et al.，2022）。因此，篩選適用于生姜青枯病的生防菌株并優(yōu)化其發(fā)酵條件，對生姜產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】芽孢桿菌（Bacillus spp.）是一類重要的生防細(xì)菌，具有良好的防病、促生功效，是目前應(yīng)用最廣泛的生防菌種資源之一（Chowdhury et al.，2015）。近年來，芽孢桿菌因其環(huán)境友好、安全無毒等優(yōu)點被大量應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，在防控植物病害等方面取得了良好效果。江歡歡等（2010）從辣椒根際土壤中分離篩選到1株對辣椒青枯病菌具有良好拮抗效果的生防菌株a 45，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。何朋杰等（2019）研究證實，枯草芽孢桿菌XF-1施用后能高效定殖入大白菜的根、莖、葉等組織內(nèi)，進(jìn)而抑制根腫病病原菌的侵染和病害發(fā)生。要雅倩等（2020）從江蘇泗洪桃園發(fā)病土壤中篩選出1株解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）T-6，該菌株不但能有效防控桃樹根腐病，還兼具有良好的溶磷、解鉀能力。劉博等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌LJ3-1發(fā)酵液對紫花苜蓿根腐病病原菌（Fusarium avenaceum）具有良好的拮抗效果。王飛等（2023）從健康丹參根際土壤中分離獲得1株貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）Bv 1-4，研究后證實其對丹參根腐病菌菌絲生長具有顯著的抑制作用。祝文慧等（2023）研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌LYK10和蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）QTK2等濃度混合浸種后對辣椒疫病的防效較任一單菌處理提高27.78%～42.45%。生防菌能否轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品并應(yīng)用常受到多種因素的影響，而發(fā)酵是一個重要的影響環(huán)節(jié)。在微生物發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件對其生長速度、菌體量及抑菌活性等均具有顯著影響。喬佳慧子等（2022）通過響應(yīng)面法對生防菌E20303發(fā)酵配方及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后其對馬鈴薯干腐病病原菌的抑菌率由51.15%提高至72.51%。劉芳等（2023）報道貝萊斯芽孢桿菌YC11菌株發(fā)酵液培養(yǎng)基優(yōu)化后對煙草黑脛病的防效可達(dá)到100%。近年來，有關(guān)芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化的報道較多，但不同菌株的最佳發(fā)酵條件存在較大差異。以pH和發(fā)酵時間為例，王沖等（2023）研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌Vel-HNGD-F2的最佳發(fā)酵條件為初始pH 7.14、培養(yǎng)時間72h;王書翰等（2023）報道解淀粉芽孢桿菌YB114的最佳發(fā)酵條件為初始pH 7.0、發(fā)酵時間24 h，優(yōu)化發(fā)酵條件后YB114對棒孢葉斑病的防效提升了22.4%;申云鑫等（2024）發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌SH-1471的最適發(fā)酵條件為pH 7.5、培養(yǎng)時間20～24 h。【本研究切入點】植物根際生境由于生態(tài)環(huán)境相對穩(wěn)定且營養(yǎng)物質(zhì)較豐富，使得芽孢桿菌等益生菌大量聚集，這些芽孢桿菌與青枯病菌在生態(tài)位上相近，存在競爭關(guān)系，從而為篩選出高效拮抗青枯病菌的生防菌株提供了有利條件。然而，目前關(guān)于利用生姜根際芽孢桿菌拮抗生姜青枯病菌的研究報道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以生姜根際土壤為研究對象，以生姜青枯病菌為靶標(biāo)，通過稀釋涂布法和抑菌圈法從中分離并篩選出能高效拮抗生姜青枯病菌的芽孢桿菌，對篩選出的菌株進(jìn)行分類鑒定并優(yōu)化其發(fā)酵條件，以提高其抑菌效果，旨在為豐富生姜青枯病的生防芽孢桿菌菌種資源及生防制劑的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1土壤樣品土壤樣品采自貴州省黔南布依苗族自治州惠水縣生姜青枯病綠色防控基地試驗地（26°02'N，106°64'E，海拔760 m）。采用5點取樣法，隨機(jī)選取5株健康生姜植株，拔起后采集其根際土壤，裝入自封套袋中帶回實驗室，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2供試病原細(xì)菌生姜青枯病病原菌青枯勞爾氏菌（以下簡稱青枯菌）由貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥材病害防控實驗室分離并保存。

1.1.3供試培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L、氯化鈉7.5 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、瓊脂18.0 g/L，pH自然，121℃滅菌30 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g/L、葡萄糖5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH 7.0，121℃高溫滅菌30 min

1.2拮抗芽孢桿菌的分離與篩選

1.2.1生姜根際芽孢桿菌分離采用稀釋涂布法分離芽孢桿菌。稱取5g生姜根際土壤放入預(yù)先裝有45 mL無菌水的組培瓶中，將組培瓶置于恒溫?fù)u床37℃下170 r/min振蕩10 min制得土壤懸浮液；將含有土壤懸浮液的組培瓶轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋，90℃下靜置10 min，用無菌水對土壤懸浮液進(jìn)行100和1000倍梯度稀釋，取稀釋液涂布在LB培養(yǎng)基上，并在37℃下倒置培養(yǎng)24 h。待LB培養(yǎng)基上長出細(xì)菌菌落后，將具有典型芽孢桿菌菌落特征的單菌落轉(zhuǎn)移至新的LB培養(yǎng)基上劃線純化（He et al.，2022）。挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中37℃下170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物與40%甘油按1：1的比例混合均勻，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2拮抗芽孢桿菌篩選采用抑菌圈法篩選拮抗菌株。將保存的芽孢桿菌活化后接種至液體LB 培養(yǎng)基中，37℃下170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，調(diào)節(jié)菌液ODo為1.0。將青枯菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，30℃下170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，調(diào)節(jié)菌液OD?為2.0。將固體LB培養(yǎng)基加熱至溶解狀態(tài)，待溫度降至約50℃時按1：200的比例加入青枯菌菌液，充分搖勻后倒板。待培養(yǎng)基凝固后，吸取2μL各芽孢桿菌菌液點接在培養(yǎng)基上，于28℃下靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察并測量抑菌圈的形成情況和直徑，選取抑菌效果最好的拮抗菌株用于后續(xù)試驗。

1.3拮抗菌株鑒定

1.3.1形態(tài)學(xué)觀察參照Cui等（2019）的方法，觀察拮抗菌株在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、大小和顏色；分別使用革蘭氏染色液試劑盒和芽孢染色液試劑盒對拮抗菌株進(jìn)行革蘭氏和芽孢染色，然后通過光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果，分析拮抗菌株的菌體和芽孢的形態(tài)與大小。

1.3.2生理生化測定參照He等（2022）的方法開展生理生化鑒定。主要開展V-P試驗、過氧化氫酶試驗、明膠水解、厭氧生長、尿素利用和不同碳源利用等試驗。

1.3.3分子生物學(xué)鑒定使用生工生物工程（上海）股份有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌株基因組DNA，以其基因組DNA為模板，以細(xì)菌16S rRNA基因通用引物對PO/P6（5'-GAAG AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，5'-CTACGGCTACC TTGTTACGA-3'）及rpoB基因引物對rpoB-F/R（5'-T GTAAAACGACGGCCAGTCC-3'，5'-AGCGGATAA CAATTTCACACAGG-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20.0μL：2×Tag DNA模板0.5μL，PCR Master-Mix 10.0 pL，上、下游引物各1.0μL，ddH?O 7.5pL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min 30s;94℃40 s，53℃45 s，72℃80 s，進(jìn)行30個循環(huán)；72℃延伸10 min。rpoB基因的PCR擴(kuò)增程序與16S rRNA基因相似，但退火溫度調(diào)整為60℃。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將電泳檢測合格的擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序得到的序列結(jié)果用DNAMAN軟件拼接后輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫中，應(yīng)用BLASTN程序與數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行同源性比對。根據(jù)比對結(jié)果，下載同源性相近代表性菌株序列，使用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（Kumar et al.，2016）。

1.4拮抗菌株無菌上清液制備及其抑菌活性測定

1.4.1拮抗菌株無菌上清液制備將活化好的拮抗菌株以0.5%的接種量接種于各供試培養(yǎng)基中，30℃下170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。取發(fā)酵液于4℃下10000 r/min離心5 min，取上清液通過0.22μm的濾膜過濾，即制得拮抗菌株無菌上清液。

1.4.2抑菌活性測定采用牛津杯法測定拮抗菌株無菌上清液對青枯菌的抑菌活性。在距離混有青枯菌的LB培養(yǎng)基中央的上下左右各2.5 cm處放置4個牛津杯，然后向每個牛津杯中加入200μL拮抗菌株無菌上清液，28℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h后觀察抑菌圈的形成情況，測量抑菌圈直徑。每處理3次重復(fù)。

1.5培養(yǎng)基組分優(yōu)化

1.5.1碳源優(yōu)化向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入5.0 g/L的蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、麥芽糖、可溶性淀粉、糯米粉和小麥淀粉替代原有碳源，其他組分保持不變。采用牛津杯法測定不同處理下拮抗菌株無菌上清液對青枯菌的拮抗活性，以確定最佳碳源。

1.5.2氮源優(yōu)化向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入5.0 g/L的蛋白胨、尿素、胰蛋白胨、甘氨酸、牛肉膏、氯化銨和硫酸銨替代原有氮源，其他組分保持不變。試驗方法同1.5.1。

1.5.3無機(jī)鹽優(yōu)化向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入10.0 g/L的碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、硫酸鋅、氯化鉀、氯化鎂和磷酸二氫鈉替代原有無機(jī)鹽，其他組分保持不變。試驗方法同1.5.1。

1.5.4碳源、氮源和無機(jī)鹽最佳濃度單因素試驗

根據(jù)最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽篩選結(jié)果，進(jìn)一步開展以上3種組分最佳濃度的單因素試驗。在保持另外2種組分不變的條件下，分別往發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0和15.0 g/L）的最佳碳源、氮源及無機(jī)鹽以替代原有的相應(yīng)組分。采用牛津杯法測定不同處理下拮抗菌株無菌上清液對青枯菌的拮抗活性，以初步確定最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽的最適濃度。

1.5.5培養(yǎng)基組分正交試驗選擇最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽作為培養(yǎng)基組分，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計3因素3水平正交試驗，以確定培養(yǎng)基組分的最佳配比。

1.6發(fā)酵條件優(yōu)化

1.6.1培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時間和接種量單因素試驗采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，對培養(yǎng)溫度（20、25、30、35和40℃）、接種量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%）及發(fā)酵時間（12、24、36、48、60和72 h）進(jìn)行單因素試驗。采用牛津杯法測定不同條件下拮抗菌株無菌上清液對青枯菌的拮抗活性，以初步確定最適培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時間和接種量。

1.6.2培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時間及接種量正交試驗根據(jù)培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時間和接種量的單因素試驗結(jié)果，設(shè)計3因素3水平正交試驗，以確定3個因素的最優(yōu)組合。

1.6.3搖床轉(zhuǎn)速、初始pH和裝液量單因素試驗

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，并結(jié)合最佳培養(yǎng)溫度、接種量和發(fā)酵時間條件，進(jìn)一步對搖床轉(zhuǎn)速（120、150、180、210和240 r/min）、初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5）和裝液量（300 mL錐形瓶中裝液量，下同）（60、80、100、120、140和160 mL）進(jìn)行單因素試驗。采用牛津杯法測定不同條件下拮抗菌株無菌上清液對青枯菌的拮抗活性，以初步確定最適搖床轉(zhuǎn)速、初始pH及裝液量。

1.6.4搖床轉(zhuǎn)速、裝液量及初始pH正交試驗根據(jù)搖床轉(zhuǎn)速、初始pH及裝液量的單因素試驗結(jié)果，設(shè)計3因素3水平正交試驗，以確定3個因素的最優(yōu)組合。

1.7平板抑菌活性驗證

按照1.4.1的方法，以0.5%比例將拮抗菌株分別接種至LB和發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃下170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h;或以1.0%比例將拮抗菌株接種至本研究優(yōu)化后的培養(yǎng)基中于優(yōu)化后的發(fā)酵條件下振蕩培養(yǎng)36 h;培養(yǎng)結(jié)束后，制備相應(yīng)的無菌上清液。采用牛津杯法檢測各無菌上清液對青枯菌的抑菌活性。

1.8統(tǒng)計分析

采用Excel 2019對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過DPS 7.05進(jìn)行正交試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1拮抗芽孢桿菌的分離與篩選結(jié)果

通過梯度稀釋涂布法從生姜根際土壤中分離得到307株芽孢桿菌。利用抑菌圈法評估307株芽孢桿菌對青枯菌的拮抗效果，發(fā)現(xiàn)菌株HC-5的抑菌效果最佳，其抑菌圈直徑達(dá)0.71±0.01 cm（圖1），因此，選取菌株HC-5進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2菌株HC-5鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)特征在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌株HC-5單菌落呈乳白色，邊緣不規(guī)則，有黏性，不透明，表面粗糙，有皺褶（圖2-A）。菌株HC-5革蘭氏染色結(jié)果呈陽性，其菌體呈桿狀，大小為1.1～3.1μm×0.5～0.8μm（圖2-B）;經(jīng)芽孢染色后，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到橢圓形綠色芽孢，大小為0.9～1.6μm×0.3～1.0μm（圖2-C）。

2.2.2生理生化特性生理生化試驗結(jié)果（表1）顯示，菌株HC-5為兼性需氧菌，硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、過氧化氫試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、產(chǎn)吲哚乙酸試驗等均為陽性，尿素利用試驗呈陰性，能水解淀粉、明膠，可耐受10%NaCl，在5℃環(huán)境無法生長，可利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖等多種碳源，與貝萊斯芽孢桿菌相似。

2.2.3分子生物學(xué)鑒定將菌株HC-5測序結(jié)果輸入到DNAMAN中進(jìn)行拼接，結(jié)果顯示，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的菌株HC-5的16S rRNA和rpoB基因片段長度分別為1420和1089 bp。將拼接結(jié)果分別輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTN比對，結(jié)果顯示與貝萊斯芽孢桿菌的同源性均達(dá)99%。根據(jù)比對結(jié)果，選取并下載同源性較高的菌株序列，按照16S rRNA-rpoB的順序拼接，通過MEGA 7.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖3）顯示，菌株HC-5與貝萊斯芽孢桿菌HC-8的遺傳距離最近，聚為一類。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定菌株HC-5為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）。

2.3菌株HC-5培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.3.1碳源、氮源和無機(jī)鹽對菌株HC-5拮抗效果的影響在不同碳源、氮源和無機(jī)鹽條件下菌株HC-5的無菌上清液對青枯菌的拮抗活性存在顯著差異。其中，以糯米粉作為碳源時菌株HC-5的無菌上清液對青枯菌的抑菌圈直徑為2.17 cm，顯著大于其他7種碳源處理（Plt;0.05，下同）（圖4）;以酵母浸粉為氮源時菌株HC-5的無菌上清液對青枯菌的抑菌圈直徑為1.94 cm，顯著大于其他7種氮源處理（圖5）;以硫酸鋅為無機(jī)鹽時菌株HC-5的無菌上清液對青枯菌的抑菌圈直徑為2.70 cm，顯著大于其他7種無機(jī)鹽處理（圖6）。因此，選擇糯米粉為最佳碳源、酵母浸粉為最佳氮源、硫酸鋅為最佳無機(jī)鹽。

2.3.2碳源、氮源和無機(jī)鹽單因素試驗結(jié)果單因素試驗結(jié)果（圖7）顯示，以糯米粉、酵母浸粉和硫酸鋅作為培養(yǎng)基組分時，任意單一組分濃度的變化均顯著影響菌株HC-5無菌上清液對青枯菌的拮抗效果，隨著糯米粉、酵母浸粉和硫酸鋅濃度的升高，菌株HC-5無菌上清液對青枯菌的拮抗活性均呈先升高后降低的變化趨勢，其中，當(dāng)糯米粉、酵母浸粉和硫酸鋅濃度分別為7.0、7.0和13.0 g/L時，菌株HC-5無菌上清液對青枯菌的拮抗圈直徑分別為2.19、2.36和2.81 cm，顯著高于其他濃度下的拮抗活性。因此，在后續(xù)的3因素3水平正交試驗中，糯米粉采用5.0、7.0和9.0 g/L3個水平，酵母浸粉采用5.0、7.0和9.0 g/L3個水平，硫酸鋅采用11.0、13.0和15.0 g/L 3個水平較合理。

2.3.3碳源、氮源及無機(jī)鹽正交試驗結(jié)果根據(jù)正交試驗結(jié)果（表2），比較3種因素的R值可知Rgt;Rggt;Rc，表明糯米粉的濃度變化對菌株HC-5拮抗活性的影響最大，其次為酵母浸粉，再次為硫酸鋅，最優(yōu)組合為A?B?C?，得到最優(yōu)培養(yǎng)基組分組合為糯米粉5.0 g/L、酵母浸粉7.0 g/L和硫酸鋅11.0 g/L。

2.4菌株HC-5發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和接種量單因素試驗結(jié)果在不同的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和接種量下，菌株HC-5無菌上清液對青枯菌的拮抗活性存在顯著差異（圖8），隨著培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和接種量的增加，菌株HC-5的拮抗活性均呈逐漸上升后下降的變化趨勢。在培養(yǎng)溫度為30～40℃、培養(yǎng)時間為24～48 h及接種量為0.5%～2.0%時，菌株HC-5的拮抗活性較

好，其中，當(dāng)培養(yǎng)溫度為35℃、培養(yǎng)時間為36 h及接種量為1.0%時，菌株HC-5無菌上清液對青枯菌的抑菌圈直徑均達(dá)最大值，分別為2.81、3.15和2.32 cm，因此，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和接種量正交試驗的3個水平分別選擇30、35、40℃和24、36、48 h及0.5%、1.0%、2.0%較合理。

2.4.2培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間和接種量正交試驗根據(jù)正交試驗結(jié)果（表3），比較3種因素的R值可知RAgt;Rgt;Rc，表明培養(yǎng)溫度對菌株HC-5的拮抗活性影響最大，其次為發(fā)酵時間，再次為接種量，最優(yōu)組合為A?B?C?，因此，最優(yōu)培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時間和接種量分別為35℃、36h和1.0%。

2.4.3轉(zhuǎn)速、裝液量和初始pH單因素試驗結(jié)果

在不同的轉(zhuǎn)速、裝液量和初始pH下，菌株HC-5無菌上清液對青枯菌的拮抗活性存在顯著差異（圖9），隨著初始裝液量和初始pH的增加，菌株HC-5的拮抗活性呈逐漸上升后下降的趨勢，而隨轉(zhuǎn)速的增加其拮抗活性呈先下降后上升再下降的變化趨勢。在轉(zhuǎn)速為120～210 r/min、裝液量為60～140 mL及初始pH為5.0～7.0時，菌株HC-5的拮抗活性較好，其中，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min、裝液量為80 mL及初始pH為5.5時，菌株HC-5無菌上清液對青枯菌的抑菌圈直徑最大，分別為2.22、2.92和2.98 cm，因此，轉(zhuǎn)速、裝液量和初始pH正交試驗的3個水平分別選擇150、180、210 r/min和60、80、100 mL及5.0、5.5、6.0較合理。

2.4.4轉(zhuǎn)速、裝液量及初始pH根據(jù)正交試驗結(jié)果（表4），比較3種因素的R值可知RAgt;R?gt;Rc，表明轉(zhuǎn)速變化對菌株HC-5的拮抗活性影響最大，其次為初始pH，再次為裝液量，最優(yōu)組合為A?B?C?，即當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min、pH為5.5和裝液量為100 mL時拮抗活性最好。

2.5平板抑菌活性驗證結(jié)果

將菌株HC-5按照常規(guī)條件接種至LB和發(fā)酵培養(yǎng)基中，并進(jìn)行搖床培養(yǎng)，菌株HC-5無菌上清液對青枯菌的抑菌圈直徑分別為1.72和1.86 cm。相比之下，在優(yōu)化后的條件下菌株HC-5無菌上清液對青枯菌的抑菌效果明顯提高，抑菌圈直徑增大至3.03 cm（圖10），與LB和發(fā)酵培養(yǎng)基中常規(guī)發(fā)酵條件相比，抑菌圈直徑分別增大76.2%和62.9%，說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基更有利于菌株HC-5活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

3討論

隨著生姜種植面積的日益擴(kuò)大，青枯病對其造成的威脅也日益加劇。目前，國內(nèi)對生姜青枯病的防治主要依靠傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)和化學(xué)方法，但這些方法的效果并不盡如人意（Jiang et al.，2017）。此外，考慮到生姜作為藥食兩用作物的特性，以及環(huán)境保護(hù)和食品安全的重要性，化學(xué)農(nóng)藥的使用正面臨越來越嚴(yán)格的限制。芽孢桿菌是一類在自然界中廣泛分布、具有強(qiáng)抗逆性的細(xì)菌，被證實能有效抵抗高溫、高壓等惡劣環(huán)境（張紅艷等，2018;尉婧等，2022;李青等，2023）。貝萊斯芽孢桿菌是當(dāng)前被研究和開發(fā)最廣的生防芽孢桿菌之一，有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌對多種作物上的青枯病菌具有良好的抑制作用。馮印印等（2021）采用牛津杯法分離到1株對煙草青枯病菌具有較好拮抗效果的貝萊斯芽孢菌FY-C，其無菌濾液對青枯病菌產(chǎn)生的抑菌活性表現(xiàn)出較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性。王世偉和王卿惠（2022）報道貝萊斯芽孢桿菌菌株HNU24及其發(fā)酵液不但能有效抑制番茄青枯病菌的生長，還能有效促進(jìn)番茄植株生長。本研究從生姜根際土壤中分離出307株芽孢桿菌，通過抑菌圈法篩選出1株對生姜青枯病菌具有較強(qiáng)抑制作用的菌株HC-5，其抑菌圈直徑達(dá)0.71 cm。通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法綜合鑒定，確定其為貝菜斯芽孢桿菌。

研究表明，貝萊斯芽孢桿菌在其生長和繁殖過程中能產(chǎn)生多種具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物，包括桿菌溶素、地非西丁、伊枯草菌素和表面活性素等（Chowdhury et al.，2015）。通過發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化，可顯著提高這些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。紀(jì)帥奇等（2023）對貝萊斯芽孢桿菌SN-20的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，菌株SN-20的最佳發(fā)酵條件為接種量3%、裝液量20%、發(fā)酵時間36 h、發(fā)酵溫度32℃;優(yōu)化后的發(fā)酵條件使菌株SN-20產(chǎn)生的抗菌脂肽產(chǎn)量提高了21.85%。本研究以菌株HC-5無菌上清液對青枯病菌的抑菌活性為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗對其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在最佳發(fā)酵條件下菌株HC-5無菌上清液對青枯菌的抑菌圈直徑為3.03 cm，相比于LB和發(fā)酵培養(yǎng)基條件下分別增大76.2%和62.9%，表明通過發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化可有效提升菌株HC-5的拮抗活性。然而，不同菌株對發(fā)酵培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的偏好可能不同，相同發(fā)酵條件下不同菌株的抑菌活性和代謝物質(zhì)產(chǎn)量可能存在差異（王玲等，2014）。因此，進(jìn)一步的研究應(yīng)當(dāng)適當(dāng)考慮不同菌株的特性，并在發(fā)酵罐等更加接近實際生產(chǎn)條件的環(huán)境中進(jìn)行驗證。此外，在后續(xù)的研究中，還應(yīng)對菌株HC-5在生姜植株內(nèi)的定殖能力、生防機(jī)制，以及生防制劑的研發(fā)等作進(jìn)一步探索，從而為菌株HC-5的實際田間應(yīng)用和生防策略的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

4結(jié)論

從生姜根際土壤中分離獲得1株對生姜青枯病菌具有良好拮抗效果的貝萊斯芽孢桿菌HC-5，該菌的最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分為糯米粉5.0 g/L、酵母浸粉7.0 g/L、硫酸鋅11.0 g/L，最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度35℃、培養(yǎng)時間36h、接種量1.0%、轉(zhuǎn)速180r/min、初始pH 5.5、裝液量100mL。優(yōu)化后的方案顯著提高了菌株HC-5無菌上清液對生姜青枯病菌的抑菌效果。菌株HC-5具有開發(fā)成生姜青枯病生防菌劑的潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）