摘要 為提高硼親和吸附劑的結(jié)合力和吸附容量，以丙烯酰胺為單體，通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應在聚多巴胺磁性微球（Fe3O4@pDA）表面接枝富含氨基的聚合物刷，然后鍵合二齒硼酸配體，獲得聚合物刷型二齒硼酸配體吸附劑（Fe3O4@pDA@p-DBA）。利用紅外光譜和X-射線光電子能譜對材料進行表征，并研究了材料的吸附性能。結(jié)果表明，吸附劑對順式二羥基化合物具有較高的選擇性，并且二齒硼酸配體吸附劑較單齒硼酸配體吸附劑（Fe3O4@pDA@p-BA）具有更高的親和力和吸附容量，說明二齒硼酸配體對材料的親和力和吸附容量有促進作用。靜態(tài)等溫吸附和動態(tài)吸附研究結(jié)果表明，此材料對核苷的吸附符合Freundlich 擬合及準二級動力學方程，為多層吸附，其中化學吸附起主導作用。在中性至弱酸性條件下，此材料對順式二羥基分子仍具有良好的吸附性，有利于生物樣品的直接分離富集。當緩沖液pH=6.5 時，對于濃度為1.0 μg/mL 的腺苷、鳥苷、胞苷和尿苷4 種核苷混合溶液，最佳吸附劑質(zhì)量為30.0 mg。最佳洗脫條件為0.5 mL 0.1 mol/L 甲酸-甲醇（1∶1， V/V）混合溶液洗脫2 次，每次洗脫5 min。將此吸附劑用于尿液中核苷的分離富集，利用高效液相色譜進行檢測，檢測出尿液中腺苷、鳥苷、胞苷和尿苷的含量分別為8.0、50.4、29.3 和35.2 ng/mL，加標回收率為87.6%～107.3%，相對標準偏差為2.8%～9.2%，說明本方法的準確度較高，結(jié)果可靠。

關(guān)鍵詞 二齒硼酸配體；線性聚合物刷；親和力；分離富集；核苷

核苷是DNA 和RNA 的基本組成單位，是生命體內(nèi)最重要的生物分子之一。核苷及其代謝物在能量轉(zhuǎn)化、細胞生長、代謝和生理調(diào)節(jié)等生物學功能中發(fā)揮了重要作用[1-3]。生物體液中核苷及其代謝物含量反映了機體的健康水平，對其含量的檢測可以了解機體的健康狀況。目前，檢測核苷的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[5]、毛細管電泳法（CE）[6]和熒光法（FL）[7]等。HPLC 法簡單、準確、靈敏，是檢測核苷最常用的方法。但是，生物體液中核苷的含量極低且基質(zhì)復雜，因此，在HPLC 分析之前必須對生物樣品進行前處理[8]。

近年來，硼親和固相萃取被廣泛應用于核苷的分離富集[9-11]。傳統(tǒng)的硼親和吸附劑主要以苯硼酸為配體，通過小分子間隔臂將配體直接鍵合在基質(zhì)表面，其親和力較弱、富集效率低，并且在較高pH 值條件下才能與順式二羥基結(jié)合，不適合生物樣品（pH 值接近中性）的直接預富集[12-13]。超支化聚合物修飾法通過提高硼酸配體的鍵合密度，利用“多位點”協(xié)同吸附提高親和力[14-15]。由于空間位阻作用，超支化大分子的接枝密度有限。同時，超支化大分子的支鏈呈分散狀排布，并且氨基利用率有限，采用傳統(tǒng)的單齒硼酸配體時，硼親和位點的密度較低。與超支化聚合物不同，線性聚合物排列有序，可在材料表面形成高密度的聚合物刷[16]。目前，制備硼親和吸附劑主要是以3-丙烯酰胺基苯硼酸或4-乙烯基苯硼酸為單體，采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）法向基質(zhì)表面接枝側(cè)鏈為苯硼酸的線性聚合物[17-19]。ATRP 法首先將引發(fā)劑鍵合在材料表面，然后引發(fā)單體原位聚合，通過控制引發(fā)劑的密度和聚合時間可有效調(diào)控聚合物刷的接枝密度和鏈長；同時，聚合物刷的碳-碳骨架靈活，自由度較高。因此，線性聚合物修飾法能更有效地提高硼酸配體的鍵合密度[20]，提高吸附容量。

本研究組前期研究表明，分子內(nèi)含有2 個硼酸基的二齒硼酸配體（Diboronic acid， DBA）有助于提高材料的親和力和吸附容量[21-22]。本研究將DBA 修飾在線性聚合物鏈的側(cè)鏈上，最終在材料表面形成二齒硼酸配體線性聚合物刷。線性聚合物刷與DBA 結(jié)合，不僅能增大硼酸配體的密度，而且其線狀分子刷構(gòu)型更有利于硼酸配體與目標分子結(jié)合，有利于提高親和力和吸附容量。最后，將此材料用于尿液中核苷的分離富集，顯示了優(yōu)良的選擇性，回收率高。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1260 Infinity 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；K-AlphaxＸ射線光電子能譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；Tensor 27 紅外光譜儀（德國布魯克公司）；智能型電熱恒溫鼓風干燥箱（上?，樮帉嶒炘O備有限公司）；空氣浴搖床（上海島析實業(yè)有限公司）。

Fe3O4·6H2O（98%）和N，N-二異丙基乙胺（99%）購自上海麥克林生化有限公司；鹽酸多巴胺（DA，98%）、2-溴異丁酰溴（2-BIB， 98%）、丙烯酰胺（AM， 99%）、2，2-二吡啶（Bpy， 99%）、4-甲酰苯硼酸（4-FBA， 97%）、氰基硼氫鈉（95%）、三聚氯氰（99%）和3-氨基苯硼酸（分析純）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胞苷（98%）、腺苷（99%）、鳥苷（98%）和尿苷（99%）購自上海藍季生物試劑有限公司；對苯二酚（分析純）購自天津市科密歐化學試劑有限公司；鄰苯二酚（分析純）購自上海三愛思試劑有限公司。其它試劑均為分析純。

1.2 聚合物刷型二齒硼酸配體吸附劑的制備

1.2.1 DBA的制備

參照文獻[22]的方法合成DBA。將1.39 g 3-氨基苯硼酸和0.92 g 無水乙酸鈉溶于10 mL 50%乙酸溶液中，另將0.84 g 三聚氯氰溶于20 mL 冰乙酸中。將兩種溶液混合，室溫下攪拌反應3 h，得到乳白色懸浮液，抽濾，棄去濾液，產(chǎn)物用乙酸和水依次洗滌3 次， 40 ℃真空干燥，得到白色粉末。

1.2.2 ATRP法鍵合聚丙烯酰胺

參照文獻[22]的方法制備聚多巴胺磁性微球（Fe3O4@pDA），以其為基質(zhì)制備固體引發(fā)劑。稱取0.6 gFe3O4@pDA 分散于50 mL 四氫呋喃中，冰浴超聲20 min 后，加入0.6 mL 三乙胺和0.5 mL 2-BIB， 4 ℃反應3 h 后，升溫至35 ℃反應12 h，即得到固體引發(fā)劑2-BIB 修飾的Fe3O4@pDA（Fe3O4@pDA-Br）。用水和甲醇依次洗滌，干燥備用。

以AM 為單體進行ATRP 反應。將0.5 g Fe3O4@pDA-Br 和0.5 g AM 分散于50 mL DMF 中，超聲20 min，再抽真空-充氮氣3 次；將20 mg Bpy 和20 mg 溴化亞銅溶于1 mL DMF 中并注入上述分散液，于60 ℃攪拌16 h，得到聚丙烯酰胺修飾的磁性微球（Fe3O4@pDA@pAM），用甲醇洗滌，干燥備用。

1.2.3 聚合物刷型二齒硼酸配體吸附劑的制備

采用聚合后修飾的方法在聚合物刷的側(cè)鏈上鍵合DBA。向50 mL DMF中加入0.5 g Fe3O4@pDA@pAM、0.6 g DBA 和0.2 mL N，N-二異丙基乙胺， 120 ℃反應24 h，得到聚合物刷型二齒硼酸配體吸附劑（Fe3O4@pDA@p-DBA），用甲醇洗滌，干燥備用。

1.3 對照材料聚合物刷型單齒硼酸配體吸附劑的制備

向50 mL 無水甲醇中加入0.5 g Fe3O4@pDA@pAM、0.25 g 4-FBA 和0.3 g 氰基硼氫鈉， 25 ℃反應24 h，即得到聚合物刷型單齒硼酸配體吸附劑（Fe3O4@pDA@p-BA），用甲醇洗滌，干燥備用。

1.4 吸附性能研究

1.4.1 選擇性考察

稱取Fe3O4@pDA@p-DBA 或Fe3O4@pDA@p-BA 約10 mg 分散于5.00 mL 鄰苯二酚與對苯二酚的混合標準溶液（16.0 μg/mL， pH 8.5）中，置于恒溫（25 ℃）振蕩器中，以150 r/min 的轉(zhuǎn)速振蕩吸附40 min， 用磁鐵進行液固分離，棄去上清液；用1.0 mL NH3-NH4Cl 緩沖液（10 mmol/L， pH 8.5）和1.0 mL 水依次洗滌粒子各2 min，再用1.0 mL 0.2%醋酸洗脫20 min， 用磁鐵進行液固分離， 洗脫液進行HPLC 分析。

1.4.2 靜態(tài)等溫吸附實驗

分別配制濃度為10～200 μg/mL（pH 8.5）的鄰苯二酚、腺苷或鳥苷標準溶液，稱取Fe3O4@pDA@p-DBA或Fe3O4@pDA@p-BA 約10 mg 分散于5.00 mL 上述標準溶液中，再置于恒溫（25 ℃）振蕩器中，以150 r/min 的轉(zhuǎn)速振蕩吸附40 min，用磁鐵進行液固分離，上層清液進行HPLC 分析，按公式（1）計算吸附量，并繪制靜態(tài)等溫吸附線。

1.4.3 吸附動力學研究

稱取約10 mg Fe3O4@pDA@p-DBA 分散于5.00 mL 鳥苷和腺苷的混合標準溶液（20 μg/mL， pH 8.5）中，設置吸附時間為10、20、30、40 和60 min， 按照1.4.2 節(jié)方法測定吸附不同時間后的吸附量。

1.4.4 pH值的影響

稱取約10 mg Fe3O4@pDA@p-DBA 分散于5.00 mL 鳥苷和腺苷的混合溶液（20 μg/mL， pH 4.5～9.0）中，按照1.4.2 節(jié)方法測定不同pH 值時的吸附量，考察pH 值的影響。

1.5 實際樣品分析

取健康志愿者的新鮮尿液， 4 ℃離心，取上清液備用。向1.8 mL 尿液中加入0.2 mL 核苷混合標準溶液，加標濃度分別為0、10、20、30、50、100、300、500、700 和1000 ng/mL。將30.0 mgFe3O4@pDA@p-DBA 加入到上述加標尿液中，按照1.4.1 節(jié)的方法進行前處理，最后用0.5 mL 0.1 mol/L 甲酸-甲醇（1∶1， V/V）混合溶液洗脫2 次，每次洗脫5 min，收集洗脫液進行HPLC 檢測。以洗脫液中各物質(zhì)的峰面積為縱坐標、各物質(zhì)加標濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算尿液中核苷的濃度。

1.6 HPLC條件

Agilent HC-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL，流速為0.8 mL/min。對苯二酚和鄰苯二酚分析的流動相為水（A）-甲醇（B）（80∶20， V/V），檢測波長為280 nm；核苷分析的流動相為水（A）-甲醇（B）（85∶15， V/V），檢測波長為260 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@pDA@p-DBA的制備與表征

為提高硼酸配體的鍵合密度，以Fe3O4@pDA-Br 為固體引發(fā)劑、AM 為單體，通過ATRP 反應在Fe3O4@pDA 表面接枝富含氨基的聚合物刷，然后鍵合DBA，從而產(chǎn)生高密度的硼親和位點，以提高吸附容量和萃取效率。同時，以單齒硼酸配體4-FBA 代替DBA，制備單齒硼酸配體吸附劑作為對照材料，研究DBA 對吸附性能的影響（圖1）。

采用紅外吸收光譜（IR）和X-射線光電子能譜（XPS）對微球表面的化學結(jié)構(gòu)以及元素組成和含量進行表征，結(jié)果見圖2。在Fe3O4@pDA 的紅外光譜中， 1650～1450 cm?1 處的峰為苯環(huán)的特征吸收峰， 1260 cm?1處的峰為C—N 鍵的伸縮振動峰， 3432 cm?1 處的峰為為N—H 鍵的伸縮振動峰；在XPS 圖譜中， 284.7、399.4和531.9 eV處的能譜分別歸屬于C 1s、N 1s和O 1s，并且N的相對含量為7.23%，與多巴胺分子中的N 含量相近。上述結(jié)果表明，在Fe3O4 表面成功包覆了聚多巴胺。在Fe3O4@pDA-Br 的紅外光譜中，595 cm?1 處的峰為C—Br 鍵的特征吸收峰；在XPS圖譜中， 70.3 eV 處的能譜歸屬于Br 3d， Br 的相對含量為0.67%。以上結(jié)果說明在Fe3O4@pDA 表面成功鍵合了2-BIB。在Fe3O4@pDA@pAM 的紅外光譜中，3432 和3300 cm?1 左右的峰為伯酰胺N—H 鍵的伸縮振動峰， 1630 cm?1 左右的吸收峰明顯增強，為C=O的伸縮振動峰， 1400 cm?1 處的峰為酰胺C—N 鍵的伸縮振動峰；在XPS 圖譜中，出現(xiàn)C 1s、N 1s 和O 1s的譜峰，元素組成和含量沒有明顯變化。以上結(jié)果說明通過ATRP 反應在Fe3O4@pDA 表面接枝了聚丙烯酰胺鏈。在Fe3O4@pDA@p-DBA的紅外光譜中， 1380 cm?1 處的峰為B—O的特征吸收峰；在XPS圖譜中，190.3 eV處的峰歸屬于B 1s的電子躍遷， B 的相對含量為1.95%，說明DBA被成功鍵合在材料表面。

2.2 材料的吸附性能和吸附機理探討

2.2.1 吸附選擇性

采用Fe3O4@pDA@p-DBA 和Fe3O4@pDA@p-BA 對鄰苯二酚和對苯二酚的混合液進行固相萃取，考察兩種材料的選擇性及吸附能力（圖3）。經(jīng)固相萃取后，洗脫液中幾乎檢測不到對苯二酚，而鄰苯二酚的信號顯著增強，說明兩種材料對鄰苯二酚都有良好的吸附選擇性。圖3c 中鄰苯二酚的信號強度明顯高于圖3b，說明Fe3O4@pDA@p-DBA 對鄰苯二酚的吸附量高于Fe3O4@pDA@p-BA，表明二齒硼酸配體相較于單齒硼酸配體具有更高的親和吸附能力。

2.2.2 靜態(tài)等溫吸附線

以鄰苯二酚、腺苷和鳥苷為目標物，測定Fe3O4@pDA@p-DBA 和Fe3O4@pDA@p-BA 的靜態(tài)等溫吸附線。由圖4A～4C 可知，隨著溶液濃度增加，吸附量增加的速率先快后慢，最后趨于平緩。分別利用Langmuir 模型（公式（2））和Freundlich 模型（公式（3））對等溫吸附線進行擬合。

材料的結(jié)合能力可以采用Scatchard 模型進行評價：

為了進一步考察二齒配體對親和力的影響，對靜態(tài)等溫吸附線進行了Scatchard 擬合。由表1 可知，F(xiàn)e3O4@pDA@p-DBA 的等溫吸附線擬合后的相關(guān)系數(shù)（R2）比Fe3O4@pDA@p-BA 高，并且Kd值均低于Fe3O4@pDA@p-BA，說明Fe3O4@pDA@p-DBA 對順式二羥基分子有更高的親和力[ 25]。經(jīng)擬合，F(xiàn)e3O4@pDA@p-DBA 對鄰苯二酚、腺苷和鳥苷的吸附容量分別為105.3、36.8 和17.4 μmol/g，均高于Fe3O4@pDA@p-BA。同時， Fe3O4@pDA@p-DBA 的吸附量也高于部分文獻報道值[11，26]。上述結(jié)果表明，DBA 不僅提高了材料的親和力，也提高了吸附容量。

2.2.3 吸附動力學

以鳥苷和腺苷為例，考察了吸附時間對Fe3O4@pDA@p-DBA 吸附量的影響（圖5A）。在0～40 min， 吸附量逐漸增大， 40 min 后吸附量隨時間變化緩慢，說明Fe3O4@pDA@p-DBA 在40 min 內(nèi)基本達到了吸附平衡。吸附行為通常用準一級動力學方程（公式（5））和準二級動力學方程（公式（6））描述。

動力學擬合曲線如圖5B 所示，準二級動力學擬合的R2 分別為0.9762 和0.9985，高于準一級動力學擬合。因此，準二級動力學方程更適合描述Fe3O4@pDA@p-DBA 對核苷的吸附，整個過程以化學吸附為主。在吸附過程中，化學吸附較緩慢（圖5A），因其需要克服活化能[23]，吸附過程表現(xiàn)在動力學曲線上會出現(xiàn)驟然上升與緩慢上升兩個階段。

2.2.4 pH值對吸附量的影響

根據(jù)硼親和原理，大多數(shù)硼親和固相萃取需在堿性條件（pH gt; 8.5）下進行，因此對實際應用有一定限制。在堿性條件下，酚羥基易氧化，導致樣品的穩(wěn)定性較差；而大部分生物樣品呈弱酸性至中性，需先調(diào)節(jié)其pH 值至堿性再進行固相萃取。因此，降低硼親和固相萃取的工作pH 值，有利于保證樣品的穩(wěn)定性，簡化操作[13]?？疾炝司彌_溶液pH 值對吸附量的影響，結(jié)果表明，當pH=9.0 時，腺苷和鳥苷的吸附量最大，當pH 值由9.0 逐漸降至4.5 時，吸附量僅降低了約10%～20%（圖6A），說明Fe3O4@pDA@p-DBA 在中性至弱酸性條件下仍能與核苷分子結(jié)合。因此，將此材料用于分離富集尿液時，無需將尿液的pH 值調(diào)至堿性。

2.2.5 材料合成的重現(xiàn)性

為了考察材料合成的重現(xiàn)性，測定了同批次Fe3O4@pDA@p-DBA 對鄰苯二酚的吸附量，其相對標準偏差（RSD， n=3）為1.8%；3 個不同批次的Fe3O4@pDA@p-DBA 對鄰苯二酚吸附量的RSD 為4.2%。以上結(jié)果說明，此材料具有良好的合成重現(xiàn)性。

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

為獲得最佳的萃取效率和回收率，對Fe3O4@pDA@p-DBA 的用量、洗脫劑種類及洗脫時間進行了優(yōu)化（圖6B～6D）。當緩沖液pH=6.5 時，對于2.00 mL 濃度為1.0 μg/mL 的4 種核苷混合溶液，最佳吸附劑質(zhì)量為30.0 mg；最佳洗脫條件為0.5 mL 0.1 mol/L 甲酸-甲醇（1∶1， V/V）混合溶液洗脫2 次，每次5 min。

2.4 尿液中核苷的固相萃取

尿液中核苷含量低，并且基質(zhì)復雜，本研究考察了Fe3O4@pDA@p-DBA 對尿液中核苷固相萃取的選擇性（圖7）。尿液直接進樣時，色譜圖中出現(xiàn)大量干擾峰，僅有少量鳥苷被檢出（圖7b）；向尿液中加入1.0 μg/mL 核苷標準溶液后，直接進行HPLC 分析，腺苷、鳥苷、胞苷和尿苷均可被檢出，但由于基質(zhì)干擾嚴重，未經(jīng)固相萃取的加標尿液產(chǎn)生較強的背景吸收和干擾峰，色譜峰分離度較差，影響定量結(jié)果的準確度（圖7c）；加標尿液經(jīng)過Fe3O4@pDA@p-DBA 固相萃取后，干擾峰基本消除，洗脫液中4 種核苷均出現(xiàn)明顯的色譜峰（圖7d），說明Fe3O4@pDA@p-DBA 能夠有效消除基質(zhì)干擾，對核苷具有較高的吸附選擇性，因此有助于提高分析靈敏度和準確度，為尿液中核苷的固相萃取-HPLC 檢測提供了新方法。

2.5 方法學考察

采用標準加入法繪制標準曲線。向新鮮尿液中加入腺苷、鳥苷、胞苷和尿苷系列標準溶液，按照最佳條件進行固相萃取后，采用HPLC 檢測，以洗脫液的峰面積對加標濃度作圖，擬合得到標準曲線（表2）。腺苷和鳥苷的線性范圍為10～1000 ng/mL（R2gt;0.99），胞苷和尿苷的線性范圍為20～1000 ng/mL（R2gt;0.98）。根據(jù)空白樣品響應信號的3 倍標準偏差對應的濃度（S/N=3）確定檢出限（LOD），結(jié)果見表2。

2.6 尿液中核苷的含量測定和回收率

根據(jù)標準加入法的線性方程，采用外推法計算尿液中內(nèi)源性核苷的含量。結(jié)果表明，內(nèi)源性腺苷、鳥苷、胞苷和尿苷的含量分別為8.0、50.4、29.3 和35.2 ng/mL。進行了尿液加標回收實驗，結(jié)果見表3。在3 個加標水平（50、400 和800 ng/mL）下，尿液中4 種核苷的回收率為87.6%～107.3%， RSD 為2.8%～9.2%。與文獻[26-27]報道的方法相比，本方法具有更好的靈敏度、精密度和回收率。

3 結(jié)論

本研究制備了一種聚合物刷型二齒硼酸配體吸附劑，此吸附劑比單齒配體吸附劑有更高的親和力和吸附容量，表明線性聚合物刷與DBA 聯(lián)合促進了硼親和位點與順式二羥基的結(jié)合。將此吸附劑應用于尿液中核苷的固相萃取，并采用HPLC 檢測，顯示了較高的選擇性、回收率和準確度。

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