摘要 酶改性淀粉在可生物降解止血材料的應用中表現(xiàn)出巨大潛力。本研究利用α-淀粉酶和糖化酶的水解作用得到木薯多孔淀粉（ECS），并通過負載鈣離子和單寧酸制備木薯多孔淀粉基止血粉（ECS-Ca-T）。利用掃描電子顯微鏡（SEM）、紅外（FTIR）光譜、X 射線衍射（XRD）和比表面積分析儀（BET）對ECS 及其止血粉的微觀結構、孔徑分布、結晶結構和成分進行了詳細分析。通過溶血實驗和創(chuàng)傷愈合實驗探究了ECSCa-T 的生物相容性，通過體外凝血測試、大鼠創(chuàng)傷止血實驗探究ECS-Ca-T 的止血性能，并考察了ECS-Ca-T的生物降解性。結果表明， ECS-Ca-T 具有較好的止血效果、生物相容性和可降解性。與市售顆粒止血粉相比， ECS-Ca-T 在大鼠斷尾持續(xù)性出血和肝臟損傷止血方面具有優(yōu)勢，止血時間分別縮短了4.86 min 和8.6 s，并能夠在5 s 內實現(xiàn)大鼠背部肌肉組織的快速止血；同時，在傷口愈合過程中， ECS-Ca-T 不會對機體造成不良影響，在第7 天降解達到94.5%。

關鍵詞 木薯多孔淀粉；鈣離子；單寧酸；止血；生物相容性

控制出血在醫(yī)療保健中具有重要意義。輕微傷口引起的出血通常通過先天止血機制即可控制，但較大的創(chuàng)面造成的持續(xù)性出血或者難以壓迫的傷口需要借助其它止血方法或材料緩解[1]。因此，復雜出血情況處置的需求推動了止血材料的發(fā)展。

具有止血特性的新型材料的研發(fā)一直備受關注，以降低與出血相關的死亡率。淀粉是一種來源于植物的多糖，因其具有優(yōu)異的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性[2]，成為止血材料的理想原料。迄今為止，研究人員已開發(fā)出多種形式的淀粉基止血材料，包括淀粉基海綿[3]、水凝膠[4]和顆粒。淀粉基止血凝膠具有明顯的膨脹性和粘附性，能迅速止血并保持傷口濕潤。然而，水凝膠制備條件復雜，在反應中需添加較多化學試劑，因此具有潛在毒性。Yang 等[5]制備了具有大孔結構和良好機械性能的雙功能凝血海綿，以控制大量和不可壓縮的出血。當壓縮的海綿接觸血液時，通過填塞效應膨脹以控制出血，但膨脹的海綿也會對傷口產(chǎn)生額外的壓力損傷[1]。止血顆粒和粉末可用于多種類型的創(chuàng)傷，包括深度不同和形狀不規(guī)則的傷口[1]。多孔淀粉（Porous starch， PS）具有穩(wěn)定的結構、高孔隙率和較快的吸水速率[6]，已被廣泛用作吸附劑、催化劑和其它分子的有效載體。利用PS 優(yōu)異的分子篩效應，可通過濃縮凝血因子快速實現(xiàn)止血[7]；此外， PS 具有高度的生物可降解性，可被人體組織酶促分解為麥芽糖和葡萄糖低聚糖。PS 固有的生物安全性、制備簡單和可長保存期的特性，使其成為最有吸引力的止血材料之一。

目前，研究人員主要對玉米多孔淀粉基止血材料進行了廣泛研究，以玉米多孔淀粉為載體，負載陽離子、親水基團和多種促凝物質如氨甲環(huán)酸[8]、鈣離子[9]和凝血酶[10]等。玉米多孔淀粉主要通過α-淀粉酶和糖化酶對玉米淀粉的水解作用獲得。木薯淀粉與玉米淀粉同為A 型淀粉[11]，對淀粉酶表現(xiàn)出較高的敏感性，但關于酶水解對木薯淀粉的影響方面的研究較少，也缺乏對木薯多孔淀粉在止血材料中的應用研究。因此，探究木薯淀粉在醫(yī)用止血方面的應用，可充分發(fā)發(fā)揮木薯淀粉的應用價值。預實驗結果顯示，木薯淀粉顆粒經(jīng)淀粉酶水解后能顯著縮短凝血時間?；诖?，本研究通過α-淀粉酶和糖化酶水解得到木薯多孔淀粉（酶解木薯淀粉， enzymatic porous cassava starch， ECS），并以ECS 為載體，負載鈣離子和單寧酸制備止血材料，通過體內外實驗探究ECS 基止血材料的止血性能、生物相容性和可降解性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SU8100 冷場發(fā)射掃描電鏡（SEM，日本Hitachi 公司）；IS10 傅里葉紅外光譜儀（FTIR，美國Nicolet 公司）；ASAP2460 全自動比表面積及孔隙度分析儀（BET，美國Micromeritics 公司）；D2 PHASER X 射線衍射儀（XRD，德國Bruker-AXS 公司）；T-6V 紫外-可見分光光度計（南京菲勒儀器有限公司）。

木薯原淀粉購于廣西紅楓淀粉有限公司；豬抗凝全血、大鼠富血小板血漿（PRP）購于廣州鴻泉生物技術有限公司；α-淀粉酶（來源于Bacillus subtilis， 4000 U/g）和糖化酶（來源于Aspergillus niger，100000 U/mL）購于上海源葉生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒和磷酸緩沖液（PBS，pH = 7.4）購于上海碧云天生物科技有限公司；TegadermTM 膜購于明尼蘇達礦業(yè)制造（上海）國際貿易有限公司；市售云南白藥（YunNan）顆粒止血粉（云南白藥集團股份有限公司）；單寧酸、CaCl2、十二水合磷酸氫二鈉和一水合檸檬酸購于國藥集團化學試劑有限公司；雄性SD 大鼠（SPF 級，體重200～250 g）購于北京維通利華實驗動物技術有限公司（合格證號：SYXK（蘇）2021-0056）。實驗用水為去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 木薯多孔淀粉基止血粉顆粒的制備

稱取39.9 g 十二水合磷酸氫二鈉和8.8 g 一水合檸檬酸，用去離子水溶解并定容至1 L， 配制成磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH = 5.4）。參考文獻[12]的方法，將18 g 木薯原淀粉分散在60 mL 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH = 5.4）中并振蕩。混合物在60 ℃下預熱30 min， 然后加入100 U/g （干基淀粉）α-淀粉酶和200 U/g （干基淀粉）糖化酶反應16 h， 結束后，離心收集沉淀，洗滌并在?80 ℃下冷凍8 h， 然后冷凍干燥得到ECS。參考文獻[13]的方法，將10 g ECS 分散在40 mL 10% （m/V） CaCl2 溶液中攪拌4 h， 使ECS 負載Ca2+，離心收集沉淀，洗滌，并在?80 ℃下冷凍8 h， 干燥，得到負鈣ECS（ECS-Ca）。參考文獻[14]的方法，將10 g ECS-Ca 分散在40 mL 5% （m/V） 單寧酸溶液中攪拌4 h， 使ECS-Ca 負載單寧酸分子，離心收集沉淀，洗滌并在?80 ℃下冷凍8 h， 干燥后再經(jīng)60Co 滅菌，得到ECS 基止血粉（ECS-Ca-T）。

1.2.2 結構表征

利用SEM 觀察顆粒的表面形態(tài)，并通過Nano Measure 1.2 軟件分析顆粒的微米級孔徑分布。利用FTIR 分析每個樣品的官能團。利用BET 在–196 ℃下吸附氮氣，測定樣品的比表面積和孔徑分布，根據(jù)BET （Brunauer-Emmett-Teller）方程計算比表面積，并使用BJH （Barrett-Joyner-Halenda）法分析納米級孔體積和孔徑分布。利用XRD 測試樣品的晶體結構，采用MDI Jade 5.0 軟件分析結果。

1.2.3 體外凝血性能

（1） 血液凝固時間（BCT）的測定參考文獻[15-16]的方法，稱取10 mg 止血粉樣品于5 mL 離心管中，于37 ℃水浴中預熱5 min。加入1 mL 豬抗凝全血， 37 ℃保溫3 min， 然后加入100 μL 0.2 mol/LCaCl2 溶液，并立即計時。為了判斷血漿是否凝固，每隔10 s 傾斜一次試管，以血漿完全失去流動性的時間為凝固時間。未作任何處理的抗凝全血為空白對照組。每個樣品測試3 次。

（2） 血液凝固指數(shù)（BCI）的測定依據(jù)文獻[16]的方法，稱取5 mg 止血粉樣品置于離心管中，向5 mL 抗凝血中添加500 μL 0.2 mol/L CaCl2 溶液以引發(fā)抗凝全血的活化，立即向離心管中加入100 μL 活化的血液，將離心管置于37 ℃水浴中孵育。分別在0.5、1、2、3、5、7 和9 min 共7 個時間點向管中加入8 mL 去離子水，孵育5 min， 然后分別取200 μL 稀釋的血紅蛋白，通過紫外-可見分光光度計記錄樣品在540 nm 處的吸收值。BCI 按照公式（1）計算：

1.2.4 體內止血性能

通過異氟烷維持大鼠麻醉，異氟烷濃度為2%～2.5%，流量為500～700 mL/min。麻醉成功后，將大鼠平放在實驗臺上，取橡皮筋固定四肢，每只大鼠均進行以下3 項實驗。（1）大鼠斷尾止血將大鼠尾巴用碘伏和酒精消毒，然后在大鼠尾部距末端2 cm 處，用剪刀一次性剪斷大鼠尾部，切口自出血3 s 后擦去血液，立即將尾部創(chuàng)口插入裝有止血粉的離心管中，并啟動秒表計時，每隔30 s 觀察創(chuàng)口是否止血，用濾紙輕輕接觸創(chuàng)口，若濾紙上未留下血跡，說明止血成功，從啟動計時到止血成功所用的時間為止血時間[17]?？瞻讓φ战M為斷尾后不做任何處理的大鼠。（2）大鼠背部皮膚切除并止血取電動剪毛器剔除大鼠背部毛發(fā)備皮（以脊柱為中線，兩側備皮面積分別為4 cm×5 cm）， 然后用碘伏和酒精消毒，待皮膚稍干后利用活檢打孔器切除大鼠脊柱兩側直徑約為1 cm 圓形區(qū)域皮膚，并用組織鑷將圓孔內皮膚提起，利用組織剪尖頭刺一孔洞，深至筋膜層，并沿孔洞將圓形區(qū)域內皮膚切除制造創(chuàng)口，然后用止血粉止血，記錄止血時間[18]。空白對照組為皮膚切除后不作任何處理的大鼠。（3）肝臟損傷實驗用碘伏和酒精對大鼠腹部消毒，然后在腹部正中切一長約2 cm 的縱行切口，用無菌紗布制作一次性洞巾鋪在創(chuàng)口上，輕輕擠壓腹部暴露肝臟，肝左（右）葉先后從切口被擠出，用生理鹽水無菌紗布拖住并固定肝左（右）葉，在肝葉表面用刀片制造線型創(chuàng)面，長1 cm、深5 mm， 切口自由出血3 s 后立即擦去血液，平鋪適量止血粉，加蓋2 張2 cm×2 cm 濾紙，并按壓，啟動秒表計時。每隔30 s 揭開一張濾紙觀察止血情況，直至出血停止，以不加壓3 min 內無鮮紅血液滲出為完全止血標準，記錄完全止血時間[17]。空白對照組為肝臟損傷后不作任何處理的大鼠。

1.2.5 溶血率（HI）測試

將8 mL 抗凝血加入到含10 mL 生理鹽水的試管中獲得血液稀釋液。將100 mg 止血粉樣品浸入45 mL 生理鹽水中，于37 ℃孵育24 h， 獲得樣品浸提液。

參考國家標準方法[19]，將浸提液混勻，取10 mL 浸提液至新的試管中，陽性對照組為10 mL 生理鹽水，陰性對照組為10 mL 去離子水。將全部試管放入37 ℃水浴中預熱30 min， 然后每管添加200 μL 稀釋血液，混勻，繼續(xù)于37 ℃保溫孵育1 h， 每30 min 顛倒試管2 次。800 r/min 離心5 min， 取上清液測定545 nm 處吸收值。HI 按照公式（2）計算：

1.2.6 血小板和紅細胞粘附實驗

參考文獻[14]并稍作修改進行以下實驗。（1）血小板粘附能力將新鮮大鼠富血小板血漿（PRP）稀釋至2×108 cell/mL，取100 μL 稀釋的PRP 懸液加入到5 mg 止血粉樣品中，于37 ℃孵育30 min， 棄去上清液，并使用PBS 將未粘附的血小板去除，將混合物轉移到一個新的離心管中，按照LDH 檢測試劑盒提供的測試方法測定粘附的血小板數(shù)量。（2）血小板粘附狀態(tài)將PRP 用等體積的PBS 稀釋，取500 μL稀釋的PRP 懸液加入10 mg 止血粉樣品，在37 ℃下孵育30 min 后，用PBS 輕輕地清洗未被粘附的血小板；將粘附血小板的樣品放在PBS 中超聲振蕩清洗10 min， 用2.5%戊二醛-PBS 溶液固定樣品，并通過梯度乙醇脫水后，用SEM 觀察樣品粘附血小板的情況。（3）紅細胞粘附能力10 mg 止血粉樣品與500 μL 紅細胞懸液孵育30 min， 用PBS 清洗未粘附的紅細胞，然后將樣品放置于5 mL 去離子水中超聲清洗5 min， 并使用酶標儀測量清洗液在540 nm 處的吸收值。（4）紅細胞粘附狀態(tài)10 mg 止血粉樣品與500 μL 紅細胞懸液孵育作用30 min， 用PBS 清洗未粘附的紅細胞，用2.5%戊二醛-PBS 溶液固定樣品，并通過梯度乙醇脫水后，用SEM 觀察ECS 止血粉粘附紅細胞的情況。

1.2.7 全層皮膚缺損模型的創(chuàng)面愈合實驗

用電動剪毛器剔除大鼠背部毛發(fā)備皮，然后用碘伏和酒精消毒，待皮膚稍干后利用活檢打孔器切除大鼠脊柱一側直徑約為1 cm 圓形區(qū)域皮膚，撒上ECS-Ca-T 并在創(chuàng)面貼上1 片市售的TegadermTM 膜，以防止掉落，空白對照組的創(chuàng)面僅貼TegadermTM 膜。在不同時間點（0、1、4、7、11 和14 d）觀察創(chuàng)面愈合情況并拍照[20]。切下與止血粉接觸的皮膚和筋膜組織，用4%多聚甲醛固定液進行固定處理，隨后用梯度乙醇進行脫水，并包埋于石蠟中。石蠟塊以5 μm 厚為單位連續(xù)切片，直到組織被發(fā)現(xiàn)。組織切片置于載玻片上，用二甲苯脫蠟，采用蘇木精和伊紅染色，通過電子顯微鏡觀察組織形態(tài)。

1.2.8 體外降解實驗

ECS 基止血粉的體外降解實驗是通過測定其浸沒在包含α-淀粉酶的磷酸鹽緩沖液（PBS， pH=7.4）模擬體液（1 mL 300 U/mL α-淀粉酶分散在1 L PBS）中的質量變化進行評估[3]。在浸沒前，稱取干燥ECS 樣品重量并記錄為M0。隨后浸沒在溶液介質中，在37 ℃水浴搖床中振蕩，并且每天更換浸泡溶液。在特定的時間（1、2、3、4、5、6 和7 d）， 用去離子水沖洗樣品并冷凍干燥。測量每個樣品的最終重量，記為Mt。根據(jù)公式（3）計算樣品的失重率（D）：

2 結果與討論

2.1 ECS及其止血粉的結構表征

ECS 是木薯原淀粉顆粒在低于糊化溫度下由α-淀粉酶和糖化酶共同作用下制得，其顆粒微觀形態(tài)如圖1A 和1B 所示。ECS 具有明顯的微孔和大孔結構，并且較多顆粒存在一端有大孔的情況。ECS 表面存在均勻的凹坑，能夠降低流體的阻力，同時大孔的存在有利于快速地將液體引導到微孔中[21]。ECS-Ca（圖1C 和1D）和ECS-Ca-T（圖1E 和1F）的微觀結構與ECS 基本相同，說明負載Ca2+和單寧酸未對ESC 的顆粒結構產(chǎn)生影響。此外，酶處理產(chǎn)生的孔隙使ECS 的比表面積增加，同時伴隨著吸附性增強， ECS 能夠快速吸附血液中的液體，并達到富集凝血因子的目的[13]。

利用氮吸附比表面積分析儀測定得到ECS 的比表面積為9.72 m2/g， 孔徑主要分布在3～5 nm 以及10～55 nm（圖2A）。此外，通過Nano Measure 得到ECS 微米級孔徑主要分布在約2 μm 左右（圖2B）。利用XRD 檢測ECS 及其止血粉的結晶結構（圖2C），觀察到ECS、ECS-Ca 和ECS-Ca-T 在15°、17°、18°和23°處都存在衍射峰，表明負載Ca2+和單寧酸后ECS 的結晶結構保持不變，仍呈現(xiàn)典型的A 型結晶結構。采用紅外光譜檢測樣品官能團變化（圖2D）， ECS 的紅外譜圖在3286 cm–1 存在吸收峰，在ECS-Ca 和ECS-Ca-T 中該吸收峰分別位移到3266 和3291 cm–1， 這是由于Ca2+與淀粉分子的—OH 基團的相互作用所導致[9]。此外，在ECS-Ca-T 中觀察到位于1500～1600 cm–1 處的單寧酸苯部分的環(huán)拉伸峰[22]，說明單寧酸成功負載于ECS 上。

2.2 ECS基止血粉的體外凝血性能評價

通過測試全血凝固時間和全血凝固指數(shù)，探究ECS 及以其為載體所制備的止血粉的體外凝血效果。本實驗使用豬抗凝全血，在血液中添加適量Ca2+以引發(fā)豬抗凝全血的凝血作用[23]。不同樣品的全血凝固時間如圖3A 所示，與空白組（（20.17±1.02） min）相比，測試的4 種樣品的BCT 值均顯著降低（plt;0.0001）。其中， ECS-Ca-T 的BCT 值最小，與空白組相比， ECS-Ca-T 的BCT 值下降了16.93 min， 因其負載了Ca2+和單寧酸， Ca2+作為重要的凝血因子，接觸血液即直接參與凝血途徑；單寧酸具有大量的酚羥基，對多種蛋白具有親和力[22]，可能與血小板等凝血因子具有相互作用。

BCI 是以數(shù)據(jù)的形式表示不同時間點的血液凝固情況，隨著凝血途徑被激活，血液凝固的部分增加，未凝固的血液在添加去離子水后由于滲透壓的變化導致紅細胞破裂，從而溶出血紅蛋白[24]。因此， BCI值越小的樣品，促凝血效果越好。由圖3B 可知， ECS-Ca-T 在1、2、3 和5 min 時，相對于ECS、ECS-Ca和云南白藥而言都具有較高的凝血速率。在保溫3 min 后， 4 種樣品的BCI 均快速下降，其中， ECS-Ca-T的下降速率最快，添加了ECS-Ca-T 的血液凝固的部分最多，說明在相同的保溫時間內， ECS-Ca-T 具有較好的促凝血效果。

2.3 生物相容性分析

HI 是用于評估植入式材料的血液相容性的簡單且可靠的指標。根據(jù)國際標準，只有HI 低于5%的產(chǎn)品才能滿足臨床應用中的血液安全要求[21]。ECS 及以其為載體的止血粉的HI 如圖4A 所示。經(jīng)ECS、ECS-Ca 和ECS-Ca-T 提取物處理后，離心后得到的上清液為無色澄清的溶液。本實驗未發(fā)現(xiàn)樣品溶血。定量分析結果表明， ECS、ECS-Ca 和的ECS-Ca-T 的溶血率分別為1.6%、2.5%和1.5%，說明ECS及以其為載體的止血粉具有較好的生物相容性。

觀察ECS-Ca-T 作用于大鼠背部創(chuàng)面后傷口的愈合情況，以探究ECS-Ca-T 的殘留是否會對大鼠機體造成不良影響。創(chuàng)面愈合狀況如圖4C 所示， 14 d 內均未出現(xiàn)紅腫、流膿和發(fā)炎等情況，創(chuàng)口敷止血粉后顏色變深，可能是粉末吸液后粘附于傷口并開始降解所導致[25]。隨著時間增加，對照組和ECS-Ca-T大鼠背部創(chuàng)口均結痂愈合，創(chuàng)面逐漸縮小。取愈合14 d 大鼠創(chuàng)口附近組織，并通過HE 染色觀察創(chuàng)面愈合情況。如圖4B 所示，空白和樣品組的皮膚組織均未見炎癥細胞，并且樣品組的上層皮膚組織較厚，說明大鼠皮膚愈合狀況良好， ECS-Ca-T 敷于創(chuàng)口后不會對組織造成不良影響。

2.4 ECS基止血粉作用于大鼠斷尾、肝損傷和背部損傷的止血實驗

通過大鼠斷尾實驗中的止血時間評估ECS 和ECS-Ca-T 的止血效果。實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠斷尾后創(chuàng)面會持續(xù)出血，若不及時處理，易導致大鼠失血過多。如圖5A 所示，與損傷后不做任何處理的尾部傷口相比， ECS 和ECS-Ca-T 的止血時間從11.37 min 分別減至2.83 和1.87 min， 分別縮短了75.1%和83.6%；與云南白藥（6.73 min）相比， ECS-Ca-T 的止血時間縮短了4.86 min。與市售止血粉相比， ECS-Ca-T 在治療緩慢且持續(xù)性出血的創(chuàng)口方面具有明顯優(yōu)勢。

為了進一步探究ECS 基止血粉對臟器損傷的止血效果，采用大鼠肝臟出血模型進行實驗。肝臟是含有豐富血管的重要器官，肝臟破裂可以造成大出血，若不及時處理，可引起失血性休克[26]。如圖5B 所示，與空白組相比，用ECS-Ca-T 處理肝臟傷口后，止血時間從96.75 s 減至27.20 s， 縮短了71.9%。與市售止血粉（35.80 s）相比，止血時間縮短了8.60 s， 說明ECS-Ca-T能夠有效地治療大鼠肝臟出血。

通過在大鼠背部打孔，觀察ECS 和ECS-Ca-T 對背部滲血肌肉組織的止血效果。如圖5C 所示，與損傷后不做任何處理的背部創(chuàng)口相比， ECS-Ca-T 能在5 s 內達到止血效果；但是， ECS 和ECS-Ca-T 的止血時間與云南白藥相比無顯著性差異。這可能是由于大鼠背部的出血來源為肌肉組織，雖然在短時間內不處理創(chuàng)面會持續(xù)滲血，但出血量有限，不同的止血粉都能對傷口達到密封止血的效果。

2.5 ECS基止血粉的體外降解

血清或血漿中α-淀粉酶催化淀粉分子中的α-1，4 葡萄糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖及含有α-1，6糖苷鍵支鏈的糊精。胰α-淀粉酶是最重要的淀粉水解酶，分子量為40～50 kDa，與唾液淀粉酶相同，以活性狀態(tài)分泌進入消化道[27]。除了胰腺和唾液腺之外，身體的很多組織比如腹腔中其他臟器、輸卵管、乳腺以及卵巢等都能夠產(chǎn)生淀粉酶，并且分泌進入全身循環(huán)系統(tǒng)[28]。因此ECS 基止血粉作用于機體傷口后，遺留的部分可能被體內淀粉酶降解。通過在模擬體液中添加適量的淀粉酶研究ECS 和ECS-Ca-T的降解性。ECS 和ECS-Ca-T 在模擬體液中的失重率見表1，在第4 天， ECS 已被完全降解；而ECS-Ca-T的降解速度相對較慢，在2 d 內的失重率僅為31.8%，第7 天時失重率升高至94.5%。這可能是由于ECS負載Ca2+和單寧酸后，兩種物質大量附著在ECS 顆粒的孔隙、裂縫和凹坑處，導致淀粉酶與顆粒的反應位點減少。在降解初期， Ca2+和單寧酸附著量較大，隨著時間延長，兩者逐漸釋放至模擬體液中，在降解3 d 后，失重率顯著提高。

2.6 止血機理

圖6 展示了不同樣本對紅細胞和血小板的吸附能力。當負載Ca2+后， ECS 對血小板和紅細胞的吸附能力顯著增強（圖6E 和6F），這可能是因為Ca2+有助于血漿凝固，進而包圍更多的血細胞。在對Ca2+進行負載的基礎上，進一步添加單寧酸， ECS 對血細胞的吸附能力明顯增強（plt;0.0001）。主要是因為單寧酸中的酚羥基可與血細胞內的蛋白質相互作用，形成氫鍵，顯著提高ECS 的吸附效率。有報道指出，紅細胞聚集可有效地封閉傷口表面，阻止出血[29]。如圖6F 所示， ECS-Ca-T 具有出色的與紅細胞結合的能力。采用SEM 研究ECS-Ca-T 顆粒對血細胞的吸附狀況。結果顯示，大量紅細胞被緊密地粘附在一起，并在ECS-Ca-T 區(qū)域的表面聚集（圖6C 和6D）。更為關鍵的是，在ECS-Ca-T 表面觀察到血小板發(fā)生了變形，并產(chǎn)生了大量偽足（圖6A 和圖6B），這表明血小板被激活，并在止血過程中發(fā)揮作用。大孔在幫助血液迅速進入微孔方面起到了關鍵作用，當血液從大孔流向微孔時，孔洞的尺寸逐步縮小，從而使血液的凝固因子能夠快速聚集。因此，當ECS-Ca-T 與傷口的表面發(fā)生接觸時，能夠迅速地從流出的血液中吸取液體，從而聚集血小板、紅細胞及其它凝血因子，加快凝血過程。

3 結論

將Ca2+和單寧酸負載于ECS 得到ECS-Ca-T 止血粉。與市售顆粒止血粉相比， ECS-Ca-T 在緩慢持續(xù)性的斷尾出血的止血過程中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，能快速阻止大鼠肝臟大出血， ECS-Ca-T 既能通過本身的多孔結構聚集血小板和紅細胞等凝血因子，又能通過Ca2+加速凝血過程，以及通過單寧酸對蛋白的相互作用吸引更多凝血因子，從而達到促進生理性止血的目的。本研究對探究ECS 在止血材料中的應用具有重要的參考意義。通過采用其它的改良方法或加入其它的凝血和抗炎因子，可以實現(xiàn)ECS 更廣泛的應用。

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