摘要 重組人生長激素（Recombinant human growth hormone， rhGH）是一種采用基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達的蛋白質(zhì)藥物，廣泛用于治療兒童及成人生長激素缺乏癥等多種疾病。在rhGH 藥物工藝開發(fā)與生產(chǎn)過程中，可能產(chǎn)生多種產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)，對藥物質(zhì)量構(gòu)成潛在影響。因此，對rhGH 主成分及產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)進行深入的結(jié)構(gòu)表征和合理的質(zhì)量控制對保障藥品質(zhì)量具有重要意義。《歐洲藥典》收錄了用于rhGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)質(zhì)量控制的反相高效液相色譜方法，以及高豐度色譜峰的結(jié)構(gòu)鑒定信息，但對于低豐度產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析并沒有詳細記載。本研究采用反相高效色譜與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，成功分離并鑒定了rhGH 產(chǎn)品中的3 種低豐度產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)。研究結(jié)果表明， rhGH 低豐度產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)普遍含有多種修飾或罕見修飾，包括N99 和N149 雙位點脫酰胺、N 端缺失兩個氨基酸同時N149 脫酰胺、Q122 脫酰胺、N 端氨基甲?；蚇 端丁二酰化，其中首次在rhGH 中發(fā)現(xiàn)N 端丁二酰化修飾。本研究對rhGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)進行了深入表征，為rhGH 藥物的研發(fā)和工藝改進提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞 重組人生長激素；結(jié)構(gòu)表征；產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)；翻譯后修飾；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

生長激素（Growth hormone， GH）是一種由人腦垂體前葉分泌的蛋白質(zhì)激素，可與生長激素受體結(jié)合，誘導(dǎo)胰島素樣生長因子1（Insulin-like growth factor， IGF-1）分泌，從而促進人體骨骼的生長發(fā)育。1958 年， Raben 等[1]首次從人腦垂體中提取人生長激素（Human growth hormone， hGH），用于治療生長激素缺乏癥；1982 年，基因重組人生長激素（Recombinant human growth hormone， rhGH）獲批用于生長激素缺乏癥的臨床治療，主要適應(yīng)癥為內(nèi)源性生長激素缺乏引起的兒童矮小癥[2]。自此，研究者開始對rhGH進行了廣泛的研究和應(yīng)用探索。近年來， rhGH 在促進脂肪分解和肌肉再生[3]、神經(jīng)保護[4]、燒燙傷[5]、輔助生殖[6]和肝組織再生[3]等領(lǐng)域的作用也被逐步發(fā)掘。截至2023 年， rhGH 在全球范圍內(nèi)的臨床應(yīng)用歷史已超過40 年，獲批的適應(yīng)癥達十余種。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展和進步， rhGH 的表達系統(tǒng)和生產(chǎn)工藝也經(jīng)歷多次迭代改進[7]，天然GH 分子無糖基化修飾，因此，絕大部分生產(chǎn)商選擇原核表達系統(tǒng)對rhGH 進行規(guī)?；a(chǎn)。在原核表達系統(tǒng)中，分泌型大腸桿菌表達技術(shù)借助特殊設(shè)計的信號肽將目標蛋白引導(dǎo)至周質(zhì)腔，使其以可溶形式表達，有助于維持天然構(gòu)象并避免被胞內(nèi)蛋白酶降解。

人用藥品技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)理事會（The international council for harmonisation of technicalrequirements for pharmaceuticals for human Use， ICH） Q6b[8]指導(dǎo)原則中，將雜質(zhì)分為產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)（Product-related substances）、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)（Product-related impurities）以及工藝相關(guān)雜質(zhì)（Process-relatedimpurities），其中，產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)與藥物主成分的活性是可比的，但某些理化性質(zhì)與主成分存在差異。產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的形成主要來自生產(chǎn)、運輸和儲存等過程。翻譯后修飾作用[9-12]是產(chǎn)生產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的最常見原因，包括蛋白質(zhì)氧化[13]、脫酰胺[14]、氨基甲?；痆15]、聚合[16]和降解[17]等；此外，一級序列的改變，如信號肽的不完全（或過度）切除[18]和氨基酸突變[19]等也會導(dǎo)致產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的形成。產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的存在會影響藥物的分子量[20]和分子結(jié)構(gòu)[21]等性質(zhì)，從而影響藥物的安全性[22]和有效性[16，23-24]，因此，對其進行準確的表征和嚴格質(zhì)控十分必要。

《歐洲藥典》[25]中收錄了rhGH 的產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)檢測方法，但主要記錄了部分高豐度產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，對低豐度產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的研究尚顯不足。盡管如此，在生物藥的國際貿(mào)易中，《歐洲藥典》所收錄的方法仍是對rhGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)進行鑒定分析及實施質(zhì)量控制的關(guān)鍵依據(jù)。

本研究采用色譜和質(zhì)譜技術(shù)，對rhGH 原液中的產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)進行分離、富集和結(jié)構(gòu)鑒定[26-27]，旨在全面表征《歐洲藥典》所列產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)檢測圖譜中的低豐度組分。同時，制備了rhGH N 端丁二酰化修飾的樣品，可作為產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)監(jiān)控的參考物質(zhì)，在rhGH 的生產(chǎn)工藝改進、安全性與有效性評價及產(chǎn)品質(zhì)量提升等方面具有重要的參考意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Triple TOF 6600 型超高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；Micro 17R 高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）；DS-11 分光光度計（美國Denovix 公司）；E2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）。NUCLEOSIL1000-7 C18 分析柱（250 mm × 4.6 mm， 7 μm， 美國Fisher 公司）；Acquity UPLCBEH C4 分析柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美國Waters 公司）；Acquity UPLC BEH C18 分析柱（100 mm ×2.1 mm， 1.7 μm， 美國Waters 公司）；超濾離心管（截留分子量10 kDa，美國Millipore 公司）。

NaH2PO4、Na2HPO4、（NH4）2SO4、HClO4 和丁二酸酐（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；胰蛋白酶（Trypsin，美國Promega 公司）；三氟乙酸（質(zhì)譜級，日本W(wǎng)ako 公司）；HCl（中國北京化工廠）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，中國惠世試劑公司）；H3PO4 和異丙醇（色譜級，美國TEDIA 公司）；三（2-羧乙基）膦（TCEP，美國Sigma 公司）；乙腈（質(zhì)譜級， Fluka 公司）。rhGH 注射液由長春金賽藥業(yè)有限責任公司提供（標示含量為每瓶30 IU/10 mg/3 mL，批號：201706029）。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的富集與定位

采用《歐洲藥典》收錄的反相高效液相色譜（Reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）方法進行分析[25]。采用E2695型高效液相色譜儀，配備NUCLEOSIL1000-7 C18 分析柱（250 mm ×4.6 mm， 7 μm）。流動相A 為NaH2PO4-HClO4 溶液（稱取82.6 g Na2HPO4 和34.5 g NaH2PO4·2H2O，溶于2950 mL 色譜水中，加入25 mL HClO4 及2000 mL 乙腈，以超純水定容至5000 mL）。流動相B 為80%乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～60 min， 23%～28% B；60～61 min， 28%～23% B；61～72 min， 23% B。流速：1.0 mL/min， 柱溫：室溫；紫外檢測器波長：215 nm。根據(jù)色譜峰的分離情況，對各個組分進行收集，合并相同餾分后進行超濾濃縮，終濃度控制為1.0 mg/mL。對濃縮后的餾分采用色譜分離所述的反相色譜方法進行定位分析，色譜設(shè)備、條件、色譜柱、流動相組成及梯度洗脫程序與前述相同。

1.2.2 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)解析

采用聯(lián)用ExionLC 超高效液相色譜儀的Triple TOF 6600 高分辨質(zhì)譜儀進行完整分子量分析。色譜柱選擇Acquity UPLC BEH C4 柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）， 流動相A 為0.1%甲酸， B 相為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min， 5% B；1～3.5 min， 15%～60% B；3.5～4.5 min， 60%～90% B；4.5～6.0 min，90% B；6.0～6.5 min， 90%～15% B；6.5～9.0 min， 15% B。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：220 nm；用超純水將樣品稀釋至0.1 mg/mL， 進樣4 μL；自動進樣器溫度設(shè)置為2～8 ℃。質(zhì)譜主要參數(shù)如下：采用正離子模式分析，掃描范圍m/z 400～2500；氣簾氣流速35 psi （1 psi = 6.89 kPa）；輔助氣流速50 psi；離子源溫度550 ℃；離子源電壓5500 V；累加時間0.25 s；碰撞電壓20 V；去簇電壓120 V。取2 μL 待測樣品進行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid chromatography-mass spectrometry， LC-MS）分析。

質(zhì)量肽圖檢測設(shè)備與前述相同，色譜柱采用Acquity UPLC BEH C18 柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）。流動相A 為0.05%三氟乙酸，流動相B 為0.05%三氟乙酸-乙腈。梯度洗脫程序：0～3 min， 0～15% B；3～15 min， 15%～25% B；15～25 min， 25%～50% B；25～30 min， 50%～80% B；30～30.1 min， 80%～0% B；30.1～35 min， 0% B。流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：220 nm；進樣量：20 μL。質(zhì)譜分析采用正離子模式掃描，一級質(zhì)譜（MS1）的掃描范圍為m/z 100～1800。氣簾氣流速：35 psi；輔助氣流速：50 psi；霧化氣溫度：550 ℃；累加時間：0.25 s；離子源電壓：5500 V；碰撞電壓：10 V；去簇電壓：80 V。二級質(zhì)譜（MS2）的掃描范圍為m/z 50～1800，碰撞電壓設(shè)定為“Rolling CE”，其它參數(shù)與一級質(zhì)譜參數(shù)相同。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集采用Analyst 軟件（1.7.3 版本，美國AB Sciex 公司），數(shù)據(jù)分析采用BioPharma View 軟件（2.0 版本）和PeakView 軟件（2.2 版本）（美國AB Sciex 公司）。

1.2.3 rhGH N端丁二酰化樣品的制備

依據(jù)參考文獻[28]的方法制備N 端具有丁二?；揎椀膔hGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)。取rhGH 加入丁二酸酐溶液（44∶1， m/m），置于冰水浴中孵育2 h，即得丁二?；揎棶a(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)。將上述丁二?；s質(zhì)同樣采用《歐洲藥典》[25]中的RP-HPLC 方法進行分離，收集洗脫時間為42.8 min 的色譜峰，為rhGH 的N 端丁二?；揎椀漠a(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)。收集到的蛋白采用與其它收集的產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)相同的方法進行色譜峰時間定位，確認產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的洗脫時間一致。

2 結(jié)果與討論

本研究開發(fā)了一套基于《歐洲藥典》[25]方法的rhGH 低豐度產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的收集、鑒定與驗證工作流程（圖1）。首先，對rhGH 中的各產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)色譜峰進行收集，按照保留時間順序分別命名為EPV1至EP-V5、EP-M、EP-V6、EP-V7 和EP-V8。對收集的組分進行濃縮處理，并采用相同的方法進行色譜峰定位和純度分析（圖2），最終，通過LC-MS 對產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)進行了結(jié)構(gòu)鑒定分析。本研究首次在rhGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了N 端丁二酰化修飾組分，并采用化學(xué)方法制備了與此組分相同的N 端丁二酰化修飾rhGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)，通過色譜峰定位及質(zhì)譜檢測證實了此組分與制備的rhGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)組分一致。

2.1 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的色譜定位和純度分析

本研究采用的rhGH 的產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的總峰面積為8.36%（圖3），符合《歐洲藥典》[25]對總產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)峰面積不得超過10%的規(guī)定；同時，各個產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的相對保留比均在規(guī)定范圍內(nèi)（表1）。為確保各組分在處理過程中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，采用《歐洲藥典》[25]收錄的rhGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)反相色譜檢測方法進行了組分的富集與純化，并采用相同的方法進行色譜定位。如圖2 所示，收集的各產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)餾分的主要成分與目標色譜峰的保留時間一致。通過計算峰面積得出各餾分中目標峰的純度分別為：EP-V2 為92%， EP-V3 為85%， EP-V6 為100%，均滿足后續(xù)組分鑒定的需求。

2.2 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析

對8 個餾分樣品進行了完整分子量和質(zhì)量肽圖的檢測，并利用BioPharma View 軟件（2.0 版本）與PeakView 軟件（2.2 版本）對獲得的數(shù)據(jù)進行分析，以確認已知組分并對未知組分進行結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明， EP-V1、EP-V4、EP-V5、EP-V7 和EP-V8 的結(jié)構(gòu)與《歐洲藥典》[25]收錄的產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)成分一致（見電子版文后支持信息表S1）。對于EP-V2、EP-V3 和EP-V6 色譜峰的結(jié)構(gòu)，由于目前缺乏相關(guān)文獻報道，本研究將對其進行深入探討。

根據(jù)rhGH 的結(jié)構(gòu)序列信息，其理論完整分子量應(yīng)為22124.0 Da，經(jīng)LC-MS 檢測得到的EP-M 分子量為22123.8 Da（圖4），與理論分子量高度一致。EP-V2 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的分子量信號為22125.1 Da，比EP-M 略高1.3 Da，初步推測可能發(fā)生了脫酰胺修飾（+1.0 Da）。對于EP-V3產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)，測得的分子量有兩種，一種比EP-M 低242.5 Da，另一種比EP-M 高1 Da。推測前者可能是由于片段缺失，而后者可能是脫酰胺修飾（+1.0 Da）。EP-V6產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)可能含有3 種成分，分別比主峰高1.6、44.7和101.1 Da，初步推測這可能與脫酰胺（+1.0 Da）、氨基甲酰化（+43.0 Da）和丁二?；?100.0 Da）3 種翻譯后修飾有關(guān)[18]。

對上述樣品進行了基于胰蛋白酶的質(zhì)量肽圖差異分析（圖5）。通過對比差異色譜峰的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)（見電子版文后支持信息表S1），對各產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)進行進一步表征。

對EP-V2 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)進行了質(zhì)譜分析。通過對EP-M 和EP-V2 肽圖樣品的色譜峰進行對比發(fā)現(xiàn)，在保留時間6.42 和17.31 min 處有顯著差異（圖5），這些差異來源于T15 肽段（FDTNSHNDDALLK）和T10 肽段（SVFANSLVYGASDSNVYDLLK）的變異。進一步分析二級質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)， EP-V2 的T15 肽段在N149 位發(fā)生了脫酰胺修飾，這可由b5～b11 離子的+1.0 Da 的質(zhì)量偏移所證實（見電子版文后支持信息圖S1A）。同理， T10 肽段在N99 位也出現(xiàn)脫酰胺修飾（見電子版文后支持信息圖S1B）。分子量分析結(jié)果表明EP-V2 的N99 位和N149 位均發(fā)生了脫酰胺修飾。

比較EP-M 與EP-V3 的質(zhì)量肽圖（圖5）可見，在4.67 和6.42 min 處具有顯著差異，這些差異來源于T1 肽段（FPTIPLSR）和T15 肽段（FDTNSHNDDALLK）的變異。通過詳細比對T15 肽段的二級質(zhì)譜圖（見電子版文后支持信息圖S2）可確認EP-V3 中的N149 位發(fā)生了脫酰胺修飾。此外， EP-V3 的T1 肽段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示，其N 端缺失了苯丙氨酸（F）和脯氨酸（P）兩個氨基酸殘基，這與母離子質(zhì)量減少244.1 Da 和二級質(zhì)譜圖中y1～y6 離子的一致性相符。因此，可以確定EP-V3 的主要組分是N149 位脫酰胺修飾，同時伴有N 端F 和P 兩個氨基酸的缺失。

對EP-V6 的結(jié)構(gòu)進行了質(zhì)譜解析。EP-M 和EP-V6 的色譜峰（圖5）在保留時間15.68、13.07 和13.88 min 處存在差異，這些差異與T11 肽段（DLEEGIQTLMGR）和T1 肽段（FPTIPLSR）的變異相關(guān)。分析差異色譜峰的MS2 譜圖，推測T11 肽段的差異來源于Q122 位發(fā)生脫酰胺修飾（見電子版文后支持信息圖S3A）；T1 肽段的MS2 分析結(jié)果表明， EP-V6 的N 端氨基酸發(fā)生了氨基甲酰化和丁二?；揎棧ㄒ婋娮影嫖暮笾С中畔DS3B 和S3C）。特別地， N 端發(fā)生的丁二?；揎棡槭状伟l(fā)現(xiàn)的rhGH 的產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)，因此對該產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)進行了進一步的研究和驗證。

2.3 N端丁二?；揎梤hGH的制備與確證

為了進一步確認EP-V6 成分N 端丁二?；揎梤hGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)結(jié)果的準確性，同時為該產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的活性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，通過制備N 端具有丁二?；揎椀膔hGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)進行對比驗證。將rhGH 與丁二酸酐在低溫下進行孵育，采用與rhGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)相同的色譜方法進行分離、收集及質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示，制備的修飾蛋白的分子量為22223.9 Da（圖6A），與理論值相符。此外，RP-HPLC 檢測結(jié)果顯示，制備得到的N 端丁二酰化修飾rhGH 的色譜峰保留時間與EP-V6 完全吻合（圖6B）。綜上，本研究最終實現(xiàn)了對歐洲藥典中rhGH 相關(guān)蛋白的全部鑒定（表2），為未來產(chǎn)品質(zhì)量的提升奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

采用《歐洲藥典》中的RP-HPLC 結(jié)合LC-MS 方法，對rhGH 原液中的產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)進行了表征分析。除已報道的產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)EP-V1、EP-V4、EP-V5、EP-V7 和EP-V8 外，發(fā)現(xiàn)了未報道的低豐度產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)EP-V2、EP-V3 及EP-V6，并證實EP-V2 中包含rhGH 發(fā)生N99、N149 位脫酰胺修飾的產(chǎn)物，EP-V3 中含有rhGH 發(fā)生了N 端缺失FP 和N149 脫酰胺2 種修飾產(chǎn)物，而EP-V6 中含有rhGH 發(fā)生Q122 脫酰胺、N 端氨基甲?；蚇 端丁二?；? 種修飾產(chǎn)物。值得注意的是， N 端丁二酰化在rhGH 產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)中首次被發(fā)現(xiàn)。本研究實現(xiàn)了對《歐洲藥典》中RP-HPLC 方法分離的rhGH 藥物產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)的完全鑒定，加深了對rhGH 藥物的認識，同時也為相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量升級和安全性研究奠定了基礎(chǔ)。

References

[1] RABEN M S. J. Clin. Endocrinol. Metab. ， 1958， 18（8）： 901-903.

[2] LEVITSKY L L， EDIDIN D V， BENVENISTE R. Pediatr. Res. ， 1982， 15（12）： 1545.

[3] I′HORTET A C D， ZERRAD-SAADI A， PRIP-BUUS C， FAUVEAU V， HELMY N， ZIOL M， VONS C， BILLOT K， BAUDV， GILGENKRANTZ H， GUIDOTTI J E. Endocrinology， 2014， 155（7）： 2545-2554.

[4] ARCE V M， DEVESA P， DEVESA J. Neurosci. Res. ， 2013， 76（4）： 179-186.

[5] CHEN Heng-Xia. Jinagsu Med. J. ， 2005， 31（7）： 529.

陳衡霞. 江蘇醫(yī)藥， 2005， 31（7）： 529.

[6] CHANG C W， SUNG Y W， HSUEH Y W， CHEN Y Y， HO M， HSU H C， YANG T C， LIN W C， CHANG H M. Front.Endocrinol. ， 2022， 13： 1040503.

[7] WATERS M J， HOANG H N， FAIRLIE D P， PELEKANOS R A， BROWN R J. J. Mol. Endocrinol. ， 2006， 36（1）： 1-7.

[8] Q6B-1999. Specifications： Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use.

[9] LIU Jing-Hui， LIU Yu-Lin， LIU Chen， XU Xiao-Ming， YANG Hong-Yu， LI Li. Chin. J. Biol. ， 2015， 28（11）： 1153-1156.

劉景會， 劉玉林， 劉晨， 徐曉明， 楊紅育， 李利. 中國生物制品學(xué)雜志. 2015， 28（11）： 1153-1156.

[10] WALSH G. Drug Discovery Today， 2010， 15（17-18）： 773-780.

[11] MAO Y， KLEINBERG A， LI N. Anal. Chem. ， 2020， 92（14）： 9682-9690.

[12] YANG Jing-Bo， HE Cheng-Yan， LU Ri-Feng， LIU Ning. Chin. J. Anal. Chem. ， 2022， 50（10）： 1465-1472.

楊靜波， 何成彥， 盧日峰， 劉寧. 分析化學(xué)， 2022， 50（10）： 1465-1472.

[13] HEPNER F， CSASZAR E， ROITINGER E， POLLAK A， LUBEC G. Proteomics， 2006， 6（3）： 775-784.

[14] TESHIMA G， JOHN T. STULTSG， LING V， DAVIS E C. Am. J. Biochem. Mol. Biol. ， 1991， 266（21）： 13544-13547.

[15] NOWICKI C， SANTOMé J A. Int. J. Peptide Protein Res. ， 1981， 18（9）： 52-60.

[16] MEYER R M， ALESHKEVICH S， BERGER L， NERKAMP J， SCHELER S， FRIESS W. Int. J. Pharm. ， 2022， 621：121760.

[17] BATTERSBY J E， HANCOCK W S， CANOVA E， OESWEIN J， O′ONNOR B. Int. J. Peptide Protein Res. ， 1994， 44（3）：215-222.

[18] LIU H L， REN W C， ZONG L， ZHANG J L， WANG Y W. Anal. Biochem. ， 2019， 564： 1-12.

[19] HEPNER F， CSZASAR E， ROITINGER E， LUBEC G. Proteome Sci. ， 2005， 3（1）： 1.

[20] BECK A， CIANFéRANI S， DORSSELAER A V. Anal. Chem. ， 2012， 84（11）： 4637-4646.

[21] YAN Y， WE H， FU Y， JUSUF S， ZENG M， LUDWIG R， KRYSTEK S R， CHEN G D， TAO L， DAS T K. Anal. Chem. ，2016， 88（4）： 2041-2050.

[22] EON-DUVAL A， BROLY H， GLEIXNER R. Biotechnol. Prog. ， 2012， 28（3）： 608-622.

[23] KONTERMANN R E. Curr. Opin. Biotechnol. ， 2011， 22（6）： 868-876.

[24] ROOPENIAN D C， AKILESH S. Nat. Rev. Immunol. ， 2007， 7（9）： 715-725.

[25] Commission Medicines European Council for the Quality of. Ph. Eur.10.0. Somatropin solution for injection. ED.： European Medicines Quality Authority， 2020： 3621-3622.

[26] GELLERFORS P， PAVLU B， AXELSSON K， NYHLéN C， JOHANSSON S. Acta Paediatr. Scand. ， 1990， S370： 93-100.

[27] LU Jun-Jie， LI Jing， CHEN Ying， LI Yi， ZHANG Wei， ZHANG Hui， LYU Ping， QIN Xi-Yue， GAO Xiang-Dong， LIANG Cheng-Gang. Chin. J. Pharm. Anal. ， 2022， 42（1）： 41-50.

陸俊杰， 李晶， 陳瑩， 李懿， 張偉， 張慧， 呂萍， 秦希月， 高向東， 梁成罡. 藥物分析雜志， 2022， 42（1）： 41-50.

[28] ZHAO Y， MA C Y， YUEN S N， HILLIPS D L. J. Agric. Food Chem. ， 2004， 54（7）： 1815-1823.