關(guān)鍵詞：蘋果；間伐改形；花芽分化；轉(zhuǎn)錄組

蘋果（MaluspumilaMill.）是薔薇科蘋果屬落葉喬木，喜光、耐寒［1］。中國現(xiàn)存蘋果是從美國和日本引進(jìn)的西洋品種［2］。我國蘋果產(chǎn)區(qū)分布極廣，主要集中在環(huán)渤海、西北黃土高原、黃河故道和西南冷涼高地四大產(chǎn)區(qū)［3］?！L富2號’是1980年引入我國的著色系富士品種，經(jīng)過20多年發(fā)展，現(xiàn)在已成為我國蘋果主栽品種之一，果實(shí)綜合品質(zhì)優(yōu)良。

Askenaly于1867年研究了酸櫻桃的花芽分化時期，是果樹方面最早的花芽分化研究，其后許多學(xué)者從形態(tài)、解剖和生理生化等多方面對果樹的花芽分化進(jìn)行了研究，而蘋果花芽分化的研究也有100多年的歷史。蘋果花芽屬于混合芽，即展開后可以成為葉芽或花芽［4］?；ㄑ繑?shù)量、質(zhì)量是衡量蘋果樹體結(jié)果潛力的關(guān)鍵、核心指標(biāo)。果樹生長包括營養(yǎng)生長和生殖生長，兩者既相互促進(jìn)，又相互抑制。花芽分化是從營養(yǎng)生長到生殖生長的一個重要的變化過程，這個過程是營養(yǎng)生長結(jié)束和生殖生長開始的標(biāo)志。這種變化極大地影響了花期和花的數(shù)量［5］。花芽分化的實(shí)質(zhì)是植物經(jīng)一定時期的營養(yǎng)生長后，由于受到光照、溫度等外界因素的影響，產(chǎn)生某些與花芽分化相關(guān)的激素，在適宜的溫度、光照和營養(yǎng)條件下，莖生長錐不再向葉芽方向轉(zhuǎn)變形成葉原基和腋芽原基，而是發(fā)生花原基和花序原基，逐漸形成花芽［6］。果樹不同發(fā)育階段的成花能力不同，其枝條生長狀況、葉片質(zhì)量狀況都有所差異，這些差異的形成決定了其具有不同的成花能力［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，溫度、光照、水分、礦物質(zhì)含量等是影響花芽分化的關(guān)鍵因素［5］。

甘肅隴東黃土高原區(qū)是我國紅富士等晚熟蘋果栽培的最佳適宜區(qū)，蘋果產(chǎn)業(yè)已成為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展和鄉(xiāng)村振興的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。該產(chǎn)區(qū)20世紀(jì)90年代至21世紀(jì)初栽植的蘋果園大多數(shù)采用喬化密植栽培，雖然喬化密植栽培曾經(jīng)起到過促進(jìn)豐產(chǎn)的積極作用，但隨著樹齡的增長，果園郁閉程度的增加，出現(xiàn)枝量繁多、冠層光照條件惡化、病蟲害防治難度增大、結(jié)果部位外移，年際結(jié)果不均衡，產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)下降等諸多問題［8-10］。嚴(yán)重制約著蘋果產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。為此，喬化成齡密閉蘋果園的改造和樹體結(jié)構(gòu)的合理調(diào)整研究已成為當(dāng)?shù)靥O果栽培中的熱點(diǎn)課題。

果園間伐是喬化成齡密閉蘋果園改造的主要措施，能夠在較短時間內(nèi)改善果園通風(fēng)透光條件、優(yōu)化果園群體結(jié)構(gòu)、促進(jìn)花芽分化、改善果實(shí)內(nèi)外品質(zhì)［11-12］，但是隨著時間推移，果園密閉現(xiàn)象將再次顯現(xiàn)，既不能持久擁有良好的通風(fēng)條件，也不能持續(xù)具備合理的群體結(jié)構(gòu)［13-14］。縮小樹冠、疏除大枝、提高主干、落去主頭等改形措施，也可暫時緩解單個樹體密閉的問題，進(jìn)而提高果實(shí)內(nèi)外品質(zhì)，但也不能永久解決果園整體郁閉問題，不能持久具備優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的潛能［15］。目前有研究發(fā)現(xiàn)，對老果園進(jìn)行間伐改形后，花芽分化明顯，成花率顯著提高，第三年坐果率也大幅提高［16］，對密閉蘋果園進(jìn)行間伐改形后發(fā)現(xiàn)成花能力和花芽質(zhì)量明顯提高，冠層花芽和果實(shí)的分布空間也得到改善［17］。

植物激素是調(diào)節(jié)高等植物發(fā)育和環(huán)境信號應(yīng)答的重要分子，其在植物生長的各個階段發(fā)揮作用，花芽分化亦不例外［18］。研究發(fā)現(xiàn)生長素、脫落酸、多效唑、赤霉素等激素都能夠促進(jìn)花芽分化［19-20］。有研究表明，高水平含量的脫落酸有利于花器官形成發(fā)育；反式玉米素核苷含量升高對菠蘿花芽分化的整個過程都有促進(jìn)作用，與花原基形成的數(shù)量正相關(guān)；低濃度的生長素和赤霉素有利于藤本月季“安吉拉”的花芽分化［21］。本試驗(yàn)以隴東高原雨養(yǎng)區(qū)十五年生‘長富2號’紅富士密閉果園為對象，通過間伐與樹體改形相結(jié)合的改造試驗(yàn)，研究了不同處理對樹體花芽分化的影響，通過不同分化時期的生長類相關(guān)激素和轉(zhuǎn)錄組分析，在激素和分子生物學(xué)層面解析間伐改形對喬化成齡密閉蘋果園樹體成花的影響，為喬化成齡密閉紅富士蘋果園合理改造和富士蘋果品種的改良提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況和試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022年在國家蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系平?jīng)鎏O果綜合試驗(yàn)站的靜寧示范縣城川鎮(zhèn)試驗(yàn)園（35°24′16″Ｎ，105°47′15″Ｅ）進(jìn)行。試驗(yàn)園海拔1592m，年降雨量460mm，春季少雨較為干旱，秋季雨量豐沛且較集中，年無霜期160d，年日照時數(shù)2242h，平均氣溫7.21℃。土壤為黃綿土，粘性較弱，有機(jī)質(zhì)含量為9.23g·kg-1，pH為8.02。試驗(yàn)園面積為3620m2，供試品種為十五年生‘長富2號’紅富士蘋果樹，砧木為山定子（Malusbac?cata），行株距為4m×3m，密度為834株·hm-2，改良紡錘形樹形，樹冠交接率大于140%，樹高4.2～4.6m，主干高度60～75cm，主枝數(shù)6～9個，主枝角度70°～80°，授粉樹品種為秦冠和金冠，占比為10%。果園為雨養(yǎng)果園，無灌溉條件，地面自然生草，栽培管理水平中等偏上，果園管理一致，以單個樹體為單位進(jìn)行施肥，即各處理每株樹體施肥水平完全一致。

1.2 試驗(yàn)方法

參照牛軍強(qiáng)等［5］的方法，于2022年2月上中旬開始對試驗(yàn)園開展間伐改形改造試驗(yàn)，試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)設(shè)計(jì)的方法，只做2種處理，分別為試驗(yàn)T（間伐改形）和對照CK（不間伐不改形）。間伐改形采用隔株間伐，行株距由原來的4m×3m變?yōu)?m×6m，同時結(jié)合縮小樹冠、疏除大枝、提高主干、落去主頭等改形措施，使樹高變?yōu)?10～340cm，干高100～110cm，選留健康無病蟲害、大小合理、分布方位均衡、間距適度的枝條4～6個作為永久主枝，開張角度為90°～100°，其他修剪采用富士蘋果常用的手法進(jìn)行修剪，總體修剪量為30%左右。對照（CK）為不間伐改形（既不間伐也不改形），其它修剪手法和修剪量與間伐改形處理完全相同。

1.3 取樣時間與方法

每個處理區(qū)面積均為20m×25m=500m2，均有3個重復(fù)，每個重復(fù)選取樹勢中庸、無明顯病蟲害、有代表性的樹體5株作為供試樹體。于2022年6月22日花芽生理分化前期（CK1和T1）和2022年8月22日花芽生理分化后期（CK2和T2），分別取樣1次，取樣部位為樹體冠層中下部中短枝上的封頂芽體，要求芽體大小、飽滿程度一致，以最快速度采取芽體樣品，然后用錫箔紙將樣品包裹嚴(yán)實(shí)并標(biāo)記清楚，于液氮罐貯藏帶回實(shí)驗(yàn)室，?80℃超低溫冰箱保存，等待檢測分析。

1.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測定方法

用TRIzol（thermofisher，15596018），根據(jù)廠商提供的操作方案對總樣品的RNA進(jìn)行分離和純化。然后用NanoDropND-1000（NanoDrop，美國）對總RNA的量與純度進(jìn)行質(zhì)控并通過Bioana?lyzer2100（Agilent，美國）對RNA的完整性進(jìn)行檢測。使用oligo（dT）磁珠（DynabeadsOligo（dT），cat.25-61005，ThermoFisher，美國）通過2輪純化對其中的帶有PolyA（多聚腺苷酸）的mRNA進(jìn)行特異性捕獲。將捕獲到的mRNA在高溫條件下利用鎂離子打斷試劑盒（NEBNextMagnesiumRNAFragmentationModule，cat.E6150S，美國）進(jìn)行片段化，94℃保持5～7min。將片段化的RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶（InvitrogenSuperScript?IIReverseTran?scriptase，cat.1896649，美國）的作用下合成cDNA。然后使用E.coliDNApolymeraseI（NEB，cat.m0209，美國）與RNaseH（NEB，cat.m0297，美國）進(jìn)行二鏈合成，將這些DNA與RNA的復(fù)合雙鏈轉(zhuǎn)化成DNA雙鏈，同時在二鏈中摻入dUTPSolution（ThermoFisher，cat.R0133，美國），將雙鏈DNA的末端補(bǔ)齊為平末端。再在其兩端各加上1個A堿基，使其能與末端帶有T堿基的接頭進(jìn)行連接，并利用磁珠對其片段大小進(jìn)行篩選和純化。以UDG酶（NEB，cat.m0280，美國）消化二鏈，再通過PCR——預(yù)變性95℃保持3min，98℃變性總計(jì)8個循環(huán)、每次15s，退火到60℃保持15s，72℃下延伸30s，最后72℃保留5min，使其形成片段大小為300bp±50bp的文庫。最后，使用illuminaNovaseq?6000按照標(biāo)準(zhǔn)操作對其進(jìn)行雙端測序，測序模式為PE150。

1.5 激素含量測定

通過ELISA試劑盒測定赤霉素、生長素、脫落酸含量。

1.6 RNA提取和基因表達(dá)分析

根據(jù)制造商的說明，使用TRIzol（Vazyme，中國）方法從葉中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試盒（TransGen，中國）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用TransStart?TipGreenqPCRSuperMix（Ta?KaRa，中國）和引物進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)的總體積為20μL，其中cDNA為200ng，正向引物、反向引物和ROXReferenceDye均為0.4μL，TBGreenPremixExTaq（TliRnaseHPlus）（2×）qPCRsupermix為10μL，少于20μL的部分用雙蒸水補(bǔ)充。PCR循環(huán)條件設(shè)定如下：在94℃下進(jìn)行30s的預(yù)變性，接著94℃下5s、60℃下30s進(jìn)行40個循環(huán)，最后使用溶解階段檢測熒光信號以驗(yàn)證目標(biāo)產(chǎn)物是否是單一。qRT-PCR分析中使用的引物如表1所示，Actin為內(nèi)參。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，差異顯著性分析使用SPSS26統(tǒng)計(jì)分析軟件。

2結(jié)果與分析

2.1 激素含量測定

對T1、T2、CK1、CK2進(jìn)行赤霉素、吲哚乙酸、植物脫落酸含量測定，結(jié)果如圖1所示，T組的激素含量基本都高于CK組的激素含量。與CK1相比，T1的赤霉素含量、吲哚乙酸含量和脫落酸含量明顯增加，與CK2相比，T2赤霉素含量和脫落酸含量顯著增加，吲哚乙酸含量稍有下降。這說明，間伐改形能顯著提高樹體花芽赤霉素、吲哚乙酸和脫落酸等生長相關(guān)激素的含量，進(jìn)而說明間伐改形對花芽分化有一定促進(jìn)作用。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.2.1 相關(guān)性分析

為探索間伐改形對花芽分化的影響，對T1（間伐改形）和CK（不間伐改形）花芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。樣本之間的相關(guān)系數(shù)越大，樣本聚類越好。Pearson相關(guān)系數(shù)可直觀看出樣本之間的可重復(fù)性，并有助于發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)異常樣本。圖2可見，本研究中樣本相關(guān)性結(jié)果很好，足以支撐后續(xù)研究。

2.2.2 質(zhì)量評估

T1與CK1相比，總共檢測48個基因表達(dá)上調(diào)，54個基因表達(dá)下調(diào)，T2與CK2相比，總共檢測353個基因表達(dá)上調(diào)，227個基因表達(dá)下調(diào)，如圖3所示。為了解差異表達(dá)基因的整體分布情況，以log（fc）為橫坐標(biāo)，?log（qvalue）為縱坐標(biāo)，對差異表達(dá)分析中的所有基因繪制火山圖，如圖4所示。

2.2.3 DEGsGO富集分析

GO富集分析結(jié)果以氣泡圖的形式呈現(xiàn)。根據(jù)Unigene在GO數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果，選取每組樣品中差異表達(dá)量最高的20個基因進(jìn)行泡繪，如圖5所示。

2.2.4 生長發(fā)育相關(guān)基因的挑選

根據(jù)GO富集結(jié)果，從3diffExpression文件夾的各比較組中的文件-Genedifferentialexpression中找到如下57個生長發(fā)育相關(guān)基因（表2）。由表2可以看出，gene：MD10G1048600、gene：MD01G1090300、gene：MD09G1176100、gene：MD16G1218900、gene：MD15G1393600等基因在花芽分化前期和后期在生長素相關(guān)GO富集通路檢測到明顯變化；gene：MD10G1048600、gene：MD01G1090300、gene：MD06G1003800、gene：MD15G1012500、gene：MD02G1124900、gene：MD01G1016100等基因在花芽分化前期和后期在脫落酸相關(guān)GO富集通路檢測到明顯變化；gene：MD01G1090300、gene：MD07G1280300、gene：MD15G1012500、gene：MD15G1109300等基因在花芽分化前期和后期在赤霉素相關(guān)GO富集通路檢測到明顯變化。

綜合分析后挑選出表達(dá)量變化明顯的基因5個，分別是：gene：MD10G1048600（生長素、脫落酸相關(guān)基因）、gene：MD01G1090300（生長素、脫落酸、赤霉素相關(guān)基因）、gene：MD02G1124900（脫落酸相關(guān)基因）、gene：MD01G1016100（脫落酸相關(guān)基因）、gene：MD07G1280300（赤霉素相關(guān)基因）。

2.3 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可信度，將上述挑選出的5個基因：gene：MD10G1048600（NAC030）、gene：MD01G1090300（CCA1）、gene：MD02G1124900（PIP2-7）、gene：MD01G1016100（ABR1）、gene：MD07G1280300（WRKY27），進(jìn)行qRT-PCR分析。qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果趨勢基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可信度。與CK1相比，T1處理的MD02G1124900表達(dá)量上調(diào)，MD10G1048600、MD01G1090300、MD01G1016100、MD07G1280300這4個基因的表達(dá)量都下調(diào)；與CK2相比，T2處理的MD01G1090300表達(dá)量上調(diào)，MD10G1048600、MD02G1124900、MD01G1016100、MD07G1280300這4個基因表達(dá)量都下調(diào)；與T1相比，T2處理的MD02G1124900表達(dá)量下調(diào)，MD10G1048600、MD01G1090300、MD01G1016100、MD07G1280300這4個基因表達(dá)量都上調(diào)。其中MD02G1124900上調(diào)比較明顯。

3討論

很多蘋果果園目前都存在果園郁閉的問題，果園郁閉會影響通風(fēng)透光性、降低花芽質(zhì)量、加大營養(yǎng)消耗、導(dǎo)致大小年現(xiàn)象嚴(yán)重與樹勢衰弱等［22-23］。為了改變蘋果果園郁閉的現(xiàn)象，通常采用間伐的方式緩解。前人研究表明，間伐可以提高植株葉片的光合速率、促進(jìn)新梢生長和短枝的成枝、改善果樹的枝類組成比例、促進(jìn)果實(shí)著色，提高果面的光潔程度，提高單果重和可溶性固形物含量，可以解決果園郁閉的問題［24-25］。

植物激素的研究于20世紀(jì)30年代因生長素的發(fā)現(xiàn)而拉開序幕，目前已基本明確植物激素的生物合成途徑［26］。植物激素是調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育和抗逆性的重要物質(zhì)，其幾乎參與了植物生長發(fā)育所有的生理過程［27］。研究發(fā)現(xiàn)低水平生長素、赤霉素（GA3）、茉莉酸甲酯（MeJA）和高水平脫落酸（ABA）有利于花芽分化，且較高的mABA/mGA3和mABA/mMeJA比值有利于花芽分化；吲哚乙酸可以激活花原基發(fā)育，有利于花器官的形成；低水平含量的脫落酸有利于花原基形成，促進(jìn)菠蘿進(jìn)入花芽分化［28-29］。本試驗(yàn)中對蘋果園進(jìn)行間伐改形后，與對照相比花芽分化后期吲哚乙酸含量降低，花芽分化前期和后期的赤霉素和脫落酸含量及花芽分化前期吲哚乙酸含量均明顯提高，說明間伐改形能顯著提高生長相關(guān)激素的含量，這一結(jié)果與前人研究中生長素、赤霉素、脫落酸等激素有利于花芽分化的結(jié)果一致，進(jìn)而說明間伐改形對花芽分化有一定促進(jìn)作用。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況，即一個活細(xì)胞所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，是一種重要的生命科學(xué)研究手段，被廣泛應(yīng)用到多個物種的研究中［30］。本試驗(yàn)中蘋果園進(jìn)行間伐改形后進(jìn)行花芽轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以期找到間伐改形促進(jìn)蘋果樹體花芽分化的關(guān)鍵基因，通過轉(zhuǎn)錄組分析，在蘋果花芽分化2個階段的GO富集分析中找到激素介導(dǎo)的信號通路，包括生長素相關(guān)信號通路、對脫落酸的反應(yīng)、對赤霉素的反應(yīng)、吲哚乙酸生物合成過程等通路。在上述激素介導(dǎo)的信號通路中發(fā)現(xiàn)大量與吲哚乙酸、赤霉素和脫落酸等信號通路的相關(guān)基因，從中挑選出5個表達(dá)量變化明顯的基因，分別是：gene：MD10G1048600（NAC030）、gene：MD01G1090300（CCA1）、gene：MD02G1124900（PIP2-7）、gene：MD01G1016100（ABR1）、gene：MD07G1280300（WRKY27）。對這5個基因進(jìn)行qRT-PCR分析，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果趨勢基本一致，進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可信度。

間伐改形是常用的提高蘋果果實(shí)品質(zhì)的物理方法，但是間伐改形通過哪些基因發(fā)揮作用仍未可知。本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得的5個生長發(fā)育相關(guān)基因，為以后進(jìn)一步研究如何促進(jìn)花芽分化，提高蘋果果實(shí)坐果率，提高果實(shí)品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因已經(jīng)成為現(xiàn)代育種的重要方向，我們下一步將通過對選出的5個基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域研究，為培育高質(zhì)量蘋果品種做出貢獻(xiàn)。

4結(jié)論

綜上所述，郁閉蘋果園通過隔間伐改形可以有效提高赤霉素、吲哚乙酸和脫落酸等生長相關(guān)激素的含量，進(jìn)而說明間伐改形對花芽分化有一定促進(jìn)作用。這種作用可能是通過gene：MD10G1048600（NAC030）、gene：MD01G1090300（CCA1）、gene：MD02G1124900（PIP2-7）、gene：MD01G1016100（ABR1）、gene：MD07G1280300（WRKY27）等基因來調(diào)控的。