摘 要： 為探究天津地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）毒株的流行變異情況。本研究利用豬肺泡巨噬細胞（PAMs）分離培養(yǎng)、有限稀釋法純化和IFA鑒定，從具有嚴重呼吸癥狀斷奶仔豬群中分離鑒定出一株新的PRRSV流行毒株（命名為TJ-C6），并對其開展了全基因組擴增及其分子特征分析。結果顯示，該毒株全基因組全長15011 bp，與NADC30毒株的核苷酸相似性最高（91.7%），為NADC30-like PRRSV（譜系1.8），且其Nsp 2存在131個氨基酸不連續(xù)缺失分子特征（“111+1+19 aa”）；GP5 N-糖基化位點分析顯示存在3個糖基化位點（N32、N43、N50）。重組分析結果顯示，該毒株是以NADC30-like（譜系1.8）為骨架，與NADC34-like（譜系1.5）發(fā)生重組的PRRSV，其重組區(qū)域位于12213～14628 nt（ORF2a～ORF6）。本研究分離鑒定到一株譜系1.8與譜系1.5重組的PRRSV-2毒株，可為天津地區(qū)的豬繁殖與呼吸綜合征綜合防控提供參考。

關鍵詞： 豬繁殖與呼吸綜合征病毒；分離鑒定；基因組特征；重組

中圖分類號： S852.659.6

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3570-09

收稿日期：2023-09-20

基金項目：天津市科技計劃項目（22YFZCSN00100；22ZYCGSN00570；22YDTPJC00420）

作者簡介：楊 程（1998-），女，廣西梧州人，碩士生，主要從事動物傳染病學研究，E-mail： 164377125@qq.com

通信作者：孫英峰，主要從事動物分子病毒學研究，E-mail： yfsun2000@163.com

Genomic Characterization of a Recombinant Strain of PRRSV-2 between Lineages 1.8

and 1.5

YANG" Cheng1， LIU" Ye1， CHENG" Ning1， WANG" Kaiyue1， LI" Xinlei1， SUN" Jiuying1， HAN" Junping

2， LI" Wenjun3， WANG" Huanhuan3， SHAO" Xiao3， CHENG Xuejiao4， SUN" Yingfeng1*

（1.College of Animal Science and Animal Medicine，Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384，

China;

2.Tianjin Jinken Animal Husbandry Group Co.，Ltd， Tianjin 300392，" China;

3.Tianjin

Nongken Kangjia Ecological Breeding Co.， Ltd， Tianjin 300386，" China;

4.Tianjin Zhongsheng Challenge Biotechnology Co.， Ltd， Tianjin 300386， China）

Abstract：" In order to investigate the epidemic variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） strain in Tianjin area， a new epidemic strain of PRRSV （named TJ-C6） was isolated and identified from weaned piglets with severe respiratory symptoms by means of isolation and culture of porcine alveolar macrophages （PAMs）， purification by limited dilution method and identification by IFA. The whole genome amplification and its molecular characteristics were analyzed. The results showed that the whole genome length of this strain was 15011bp， and the nucleotide homology with NADC30 strain was the highest （91.7%）， which was NADC30-like PRRSV （lineage 1.8）. Nsp2 had 131 discontinuous deletion features （\"111+1+19aa\"）. GP5 N-glycosylation site analysis showed that there were three glycosylation sites （N32， N43， N50）. Recombination analysis showed that this strain was a recombinant PRRSV with NADC30-like （lineage 1.8） as the skeleton and NADC34-like （lineage 1.5）， and its recombination region was located in 12213-14628nt （ORF2a-ORF6）. In this study， a recombinant PRRSV-2 strain of lineage 1.8 and lineage 1.5 was isolated and identified， which can provide reference for the prevention and control of porcine reproductive and respiratory syndrome in Tianjin.

Key words： PRRSV; isolation and identification; genomic characterization; recombination

*Corresponding author：" SUN Yingfeng， E-mail： yfsun2000@163.com

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重危害的病毒性傳染?。?］。自20世紀80年代在美國首次報道以來，到目前為止，PRRS疫情已遍布全球［2-5］。我國于1996年首次報道并分離鑒定了以CH-1a為代表的經典PRRSV毒株［6］。2006年我國南方地區(qū)先后暴發(fā)了以JXA1、HUN4等為代表毒株引起的高致病豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRSS），迅速蔓延至全國并演化成優(yōu)勢流行毒株［7-8］。2013年，國內出現的NADC30-like毒株，逐漸取代其他毒株成為優(yōu)勢毒株，該毒株基因組變異度高，易與其他譜系的毒株發(fā)生重組導致田間毒株多樣性［9-12］；2017 年，我國首次報道 NADC34-like PRRSV，隨后此類毒株檢出率逐年攀升，并成為我國的潛在流行毒株［13-14］，這也為 PRRSV 的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)。

PRRSV依據抗原遺傳差異可分為歐洲型（PRRSV-1）與美洲型（PRRSV-2）兩個基因型，國內主要為PRRSV-2為主［15-17］。根據PRRSV ORF5基因序列，將PRRSV-2分為 9 個譜系（lineage1～9），其中l(wèi)ineage 1（NADC30-like、NADC34-like等）、lineage 3（QYYZ、GM2等）、lineage 5（VR2332、R98等）及l(fā)ineage 8（CH-1a、JXA1等）為我國PRRSV主要流行毒株［8］。目前，譜系1.8（NADC30-like）毒株為我國的優(yōu)勢PRRSV流行株，且與其他譜系毒株之間存在廣泛的重組現象［11，18-19］，但譜系1不同亞型毒株之間的重組現象鮮有人報道，伴隨著譜系1.5（NADC34-like）毒株田間上升流行，潛在的譜系1.5與1.8重組毒株加劇了變異毒株的基因組特性、免疫原性和致病性等特性的復雜性，這為 PRRSV的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)。本研究旨在分離鑒定PRRSV譜系1.8與1.5重組毒株并分析其分子遺傳進化特點，為該地區(qū)的PRRS防控提供參考，并為深入解析 PRRSV 毒株的遺傳變異機制和進化關系提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1 病料來源及主要試劑

2023年，在天津地區(qū)某具有嚴重呼吸癥狀斷奶仔豬群的肺臟組織。核酸提取試劑盒購自BioFlux公司；M-MLV、RRI、dNTP Mix購自TaKaRa公司；高保真酶購自全式金公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化試劑（北京）有限公司；pUC- T載體購自上海生工生物有限公司；平末端加A試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自蘇州雙洳生物科技有限公司；FITC標記山羊抗小鼠IgG購自北京索萊寶科技公司；PRRSV N蛋白特異性單抗及豬肺泡巨噬細胞（PAMs）由本實驗室制備并保存。

1.2 引物設計與核酸轉錄

根據GenBank中標準參考毒株的保守基因序列，設計1對特異性引物，上游引物PRRSV-F：5′-GGTGTATCGTGCCGTTCT-3′，下游引物PRRSV-R：5′-GTTCCGCTGAAACTCTGG-3′，PCR產物片段預期大小為534 bp，由上海生工生物有限公司合成。依照RNA提取試劑盒說明書的步驟要求進行病毒RNA的提取，根據反轉錄試劑盒說明書對提取的RNA進行反轉錄。以cDNA為模板進行PCR擴增。反應條件：95℃ 5mim；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s；循環(huán)35次；72℃ 10min。

1.3 病毒分離鑒定與純化

將用“1.2”引物PCR方法檢測陽性的樣品接種于生長狀態(tài)良好PAMs細胞，每日觀察細胞狀態(tài)，于細胞出現80%CPE時收獲細胞培養(yǎng)液。經PCR檢測為陽性的細胞上清使用有限稀釋法純化病毒，具體的有限稀釋法步驟：TJ-C6 F1代作為病毒原液進行十倍倍比稀釋，10-1～10-8共8個梯度，每個稀釋度設6個重復。將稀釋后的病毒液接至生長狀態(tài)良好的PAMs細胞上，培養(yǎng)48～72h，每日觀察細胞狀態(tài)并記錄CPE情況。取出現CPE的最高稀釋度病毒液進行下一輪有限稀釋，共重復3次。收取第3次有限稀釋中出現CPE的最大稀釋度的病毒液進行擴大培養(yǎng)。

對純化后的病毒進行間接免疫熒光（IFA）鑒定，具體的IFA鑒定步驟：當感染后的PAMs細胞出現CPE時，棄去培養(yǎng)基，PBS潤洗后用預冷的4%多聚甲醛固定20min，0.2%Triton室溫孵育15min，含5%脫脂奶粉的PBS封閉1h，一抗（PRRSV N蛋白單抗）4℃過夜孵育，FITC標記的山羊抗小鼠IgG為二抗，37℃避光孵育1h，最后用DAPI室溫孵育5min，在倒置顯微鏡下進行觀察。

1.4 全基因組序列擴增

利用13對重疊的引物對TJ-C6毒株進行擴增（引物信息見表1），將預期片段PCR產物進行回收純化，連接轉化至DH5α感受態(tài)細胞上，挑取陽性菌株擴大培養(yǎng)后測序鑒定。

1.5 遺傳演化及同源性分析

基于MEGA軟件鄰近法（Neighbor Joining， NJ）對TJ-C6與18株標準參考毒株（表2）進行遺傳演化分析。利用MegAlign軟件對TJ-C6與參考毒株基因組中各區(qū)域的核苷酸及其編碼的氨基酸進行比對分析。使用SimPlot及RDP4軟件對TJ-C6進行重組分析（設置CH-1R，JXA1、NADC30、NADC34、QYYZ、VR2332為參考對比分析序列）。

2 結 果

2.1 TJ-C6毒株的分離與鑒定

利用設計的特異性引物進行臨床樣品的PCR擴增，可擴增出534 bp的目的條帶（圖1），測序結果確定為PRRSV陽性。在接種PAMs細胞48h后出現明顯CPE，上清液PCR檢測結果為陽性。對出現CPE的PAMs細胞培養(yǎng)液有限稀釋純化后進行IFA鑒定，可見明顯綠色熒光，陰性對照未見熒光（圖2），表明分離并鑒定一株可在PAMs細胞上增殖的PRRSV。

2.2 全基因組擴增及遺傳進化分析

使用SeqMan拼接測序結果，TJ-C6毒株序列全長為15 011 bp（不含polyA尾）?；贠RF5基因遺傳進化樹顯示，TJ-C6與NADC34-like PRRSV的親緣性更高，其ORF5基因歸屬于譜系1.5（圖3A）。全基因組遺傳進化樹顯示，TJ-C6屬于以NADC30毒株為代表的譜系1.8，為NADC30-like PRRSV（圖3B）。這表明TJ-C6毒株可能存在重組現象。

2.3 全基因組及各基因片段的相似性分析

利用MegAlign軟件對TJ-C6與不同譜系的代表毒株進行核苷酸與氨基酸相似性比對分析。在全基因組同源性比對中，TJ-C6與PRRSV-2譜系1.8的NADC30的相似性最高，為91.7%；與其他譜系代表毒株的相似性為80.9%～85.4%，表明TJ-C6屬于PRRSV-2中的譜系1.8，為NADC30-like毒株。對每個區(qū)域進行相似性分析，結果顯示，TJ-C6的5′UTR～ORF1b、ORF7～3′UTR區(qū)域都與NADC30相似性最高；而ORF2a～ORF6區(qū)域則與NADC34的同源性較高。另外，TJ-C6在Nsp2區(qū)域與代表毒株的相似性為61.7%～86%，其中，與NADC30的相似性最高（86%），且存在131個不連續(xù)氨基酸缺失，與NAD30-like PRRSV的Nsp2缺失模式一致。

GP5蛋白是囊膜蛋白，具有較強的變異能力。TJ-C6的GP5蛋白區(qū)域與代表毒株相似性為82.6%～95%，相似性最高的是譜系1.5的NADC34和ISU-10，均為95%。GP5中的糖基化位點與PRRSV的中和反應或病毒逃逸有關。通過NetNGlyc 1.0 Server進一步對TJ-C6的GP5蛋白N-糖基化位點進行分析，結果顯示存在3個N-糖基化位點，分別位于N32、N43、N50（圖4）。其中表位A中的一個aa（N27S）和表位C中的兩個aa（N57N、N59S）發(fā)生了突變，表位C的突變模式與NADC34的突變模式一致，而表位A的突變模式則與參考毒株的突變模式不同。

2.4 重組分析

利用SimPlot軟件對TJ-C6的全基因組序列進行重組分析，結果顯示TJ-C6存在重組現象（圖5），重組位置在12 213-14 628 nt之間。其中1-12 212 nt與14 627-15 011 nt與NADC30的同源相似性較高，而重組區(qū)域則與NADC34的同源相似性較高。使用RDP4軟件對Simplot分析結果進行驗證。RDP4分析結果與Simplot結果一致（表3），重組區(qū)域的主要部分為NADC34，其余區(qū)域未檢測出重組事件。將三個基因片段分別進行遺傳進化分析，結果見圖6。綜上所述，TJ-C6是一株以譜系1.8為骨架，與譜系1.5發(fā)生重組的PRRSV。

3 討 論

重組是PRRSV新毒株產生與演化的重要機制，不僅增加了田間毒株的復雜性，還使得產生的新毒株出現了毒力的變化。PRRSV可在不同譜系之間發(fā)生重組事件，且重組模式較為復雜［17，20-22］。自譜系1.8毒株（NADC30-like）在國內流行后，已有大量的關于其與我國流行的其他譜系的毒株發(fā)生重組研究報道［23-24］，且部分重組毒株具有較強的致病性［18，25-26］。譜系1.5毒株（NADC34-like）作為我國的潛在流行毒株，近年來，開始在國內部分地區(qū)被檢測到，可能逐漸成為與譜系1.8具有同等優(yōu)勢的流行毒株［27-29］，提高了病毒重組的風險。

本研究從具有嚴重呼吸癥狀斷奶仔豬群中分離鑒定一株PRRSV，命名為TJ-C6，其全基因組分析結果表明，TJ-C6與NADC30的遺傳進化為同一分支，且Nsp2區(qū)域具有與類NADC30毒株一致的不連續(xù)131氨基酸（111+1+19）缺失模式；重組分析說明該毒株為以譜系1.8毒株（NADC30-like）為主要親本，以譜系1.5毒株（NADC34-like）為次要親本，進一步證實了伴隨著譜系1.5毒株在國內流行，其與本土毒株重組的事件可能會逐漸增多。另外，分離毒株GP5蛋白上的表位A與表位C存在氨基酸突變，這些氨基酸位點的變化可能與病毒的進化或免疫逃逸有關，不過該毒株致病性如何還需進一步動物試驗考證。

本研究利用PAMs原代細胞成功分離并鑒定了一株譜系1.5與1.8重組重組類NADC30 PRRSV，盡管其重組具體機制仍不是非常明確，但重組的發(fā)生勢必導致PRRSV毒株致病性和免疫源性的改變，加劇了田間防控的技術難度。對重組病毒TJ-C6基因組特征的描述是對譜系1亞型毒株之間發(fā)生重組變異情況的重要數據補充，為研究我國PRRSV毒株遺傳演化規(guī)律和PRRS防控提供依據。

4 結 論

本研究分離鑒定到一株譜系1.8與譜系1.5重組的PRRSV-2毒株——TJ-C6，重組分析表明該毒株為以譜系1.8毒株（NADC30-like）為主要親本，以譜系1.5毒株（NADC34-like）為次要親本，進一步證實了伴隨著譜系1.5毒株在國內流行，其與本土毒株重組的事件可能會逐漸增多，可為天津地區(qū)的豬繁殖與呼吸綜合征綜合防控提供參考。

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（編輯 白永平）