摘 要：棘胸蛙Quasipaa spinosa為福建省特色分布的大型蛙類，被列入三有保護動物之列，開發(fā)新的辨別福建省內(nèi)棘胸蛙不同地理種群的快速方法對于該物種的保護極為重要。通過選取福建省內(nèi)14個地區(qū)的野生棘胸蛙樣本，提取其DNA并通過PCR擴增出線粒體12SrRNA基因，然后進行一代測序，基于獲得的12SrRNA基因序列構(gòu)建了進化樹。結(jié)果表明：福建省內(nèi)的棘胸蛙可以分成兩大類種群，武夷山、建陽、順昌、將樂、明溪、永安、華安、德化和新羅聚為一類（西部群體），武夷山、政和、屏南、寧德、福鼎、永泰、德化、新羅和福安聚為另一類（東部群體），其中，武夷山、德化、新羅在兩個大類均有分布。為了更快地基于12SrRNA基因區(qū)分兩個群體，篩選了這兩大類種群的12SrRNA基因的SNP位點，并利用競爭性等位基因特異性PCR（KASP，KompetitiveAllele-SpecificPCR）方法，開發(fā)了一種針對這兩個群體的特異性SNP快速分型方法，結(jié)果顯示所開發(fā)的KASP檢測體系能準確區(qū)分福建省野生棘胸蛙的兩個支系。該結(jié)果可為深入了解福建省內(nèi)棘胸蛙的種群分化、有效鑒別不同地理種群，以及為種質(zhì)資源保護和育種工作提供科學依據(jù)。

關鍵詞：棘胸蛙；分子標記；SNP位點；KASP技術

中圖分類號：S966.3 文獻標志碼：A 文章編號：0253?2301（2024）07?0010?07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.07.002

Analysis on Genetic Aiversity of Different Geographical Populations of Quasipaa spinosa in Fujian

Province Based on the Mitochondrial 12S Gene

WURui-qiong，ZHANGXue-ping，YANGLi-cheng，CHENYou-ling，HUANGZhen（College of Life Sciences， FujianiKq2cmobzTOlEtZSUODJlnjfDnOn02Na5QCIRysQ29Q= Normal University ， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： Quasipaa spinosaisalarge-scalefrogspecieswithauniquedistributioninFujianProvinceandislistedasaprotectedspeciesunderthe“ ThreeProtectedCategories” .ThedevelopmentofnewrapidmethodstoidentifydifferentgeographicalpopulationsofQuasipaa spinosainFujianProvinceisextremelyimportantfortheprotectionofthisspecies.Inthisstudy，theDNAwasextractedfromthewildQuasipaa spinosasamplescollectedfrom14regionsinFujianProvince，andthemitochondrial12SrRNAgenewasamplifiedbyusingPCR.Then，thefirst-generationsequencingwasconducted.Theevolutionarytreewasconstructedbasedontheobtained12SrRNAgenesequence.TheresultsshowedthatQuasipaaspinosainFujianProvincecouldbedividedintotwomajorpopulations：Wuyishan，Jianyang，Shunchang，Jiangle，Mingxi，Yong'an，Hua'an，DehuaandXinluowereclusteredintoonegroup（thewesternpopulation）.Wuyishan，Zhenghe，Pingnan，Ningde，F(xiàn)uding，Yongtai，Dehua，XinluoandFu'anwereclusteredintoanothergroup（theeasternpopulation）.?pq99zM26SE0sTay+mSwoR125iOnilgSY9YSH3JpVr2Y=;Amongthem，Wuyishan，DehuaandXinluoweredistributedinbothmajorcategories.Inordertodistinguishthetwopopulationsbasedonthe12SrRNAgenemorequickly，theSNPlociofthe12SrRNAgeneinthetwomajorpopulationswerescreened.AndarapidspecificSNPgenotypingmethodforthesetwopopulationswasdevelopedbasedonthecompetitiveallele-specificPCR（KASP，KompetitiveAllele-SpecificPCR）method.TheresultsshowedthatthedevelopedKASPdetectionsystemcouldaccuratelydistinguishthetwolineagesofwildQuasipaa spinosainFujianProvince.Theresultscouldprovideascientificbasisforthein-depthunderstandingofthepopulationdifferentiationofQuasipaa spinosainFujianProvince，andtheeffectiveidentificationofdifferentgeographicalpopulations，aswellastheprotectionandbreedingofgermplasmresources.

Key words： Quasipaa spinosa；MolecularMarkers；SNPloci；KASPtechnology

棘胸蛙Quasipaa spinosa屬兩棲綱Amphibia無尾目Anura叉舌蛙科Dicroglossidae棘胸蛙屬Q(mào)uasipaa，是我國南方地區(qū)特色的食藥用蛙類。近年來，隨著生態(tài)環(huán)境的惡化，棘胸蛙的棲息地遭受破壞[1]，以及人為的濫捕現(xiàn)象加劇，這些因素共同導致福建省內(nèi)部分地區(qū)的野生棘胸蛙資源受到嚴重破壞，種群數(shù)量日趨減少[2]。針對這一現(xiàn)象，如何有效監(jiān)測省內(nèi)的野生棘胸蛙的種質(zhì)資源遺傳多樣性，并開展種質(zhì)資源保護，成為當前亟待解決的一大問題。棘胸蛙屬于兩棲類，其擴散能力有限，容易受歷史地質(zhì)、氣候事件等因素的影響，而產(chǎn)生遺傳上的譜系地理分歧演化。國內(nèi)許多學者開展過棘胸蛙的遺傳譜系地理分化的研究[3]，發(fā)現(xiàn)其種群存在支系分布現(xiàn)象，且不同支系間存在顯著的遺傳分化。目前，從全國范圍來分析，國內(nèi)分布的棘胸蛙存在3個支系，一支分布于中國東南部：浙江、安徽及福建部分地區(qū)；一支分布于中國中南部：湖南、江西、廣東、廣西及福建部分地區(qū)；一支分布于中國西南部：云南[3?6]。然而，目前關于福建省內(nèi)野生棘胸蛙不同地理種群支系的遺傳多樣性報道較少，這在一定程度上阻礙了野生棘胸蛙保護工作的開展。因此，如何快速、準確地對福建省內(nèi)的棘胸蛙地理種群支系進行判斷，對于福建省棘胸蛙資源的保護具有重要的現(xiàn)實意義。

線粒體是真核生物細胞核外的一種半自主細胞器，是細胞進行有氧呼吸的主要場所，是動物體內(nèi)唯一的核外遺傳信息載體，具有分子量小、嚴格母系遺傳、結(jié)構(gòu)簡單等特點，已被廣泛用于研究物種的遺傳多樣性和群體間遺傳結(jié)構(gòu)的差異[7]。其中，線粒體12SrRNA基因是無尾兩棲動物在遺傳多樣性研究中應用較多的分子標記。單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP），是指基因組水平上由單核苷酸變異引起的序列多態(tài)性。基因組中在同一位置發(fā)生相同堿基突變的概率極低，因此SNP具有遺傳穩(wěn)定、數(shù)量極大、特異性強、便于批量檢測等優(yōu)點，被廣泛用作主流的分子標記[8?9]，并在遺傳疾病診斷[10?11]、分子遺傳學[12]以及動植物育種[12?14]中發(fā)揮著重要作用。本研究基于線粒體12SrRNA基因數(shù)據(jù)，分析了福建省野生棘胸蛙不同地理種群的遺傳多樣性，并根據(jù)不同支系的棘胸蛙在12SrRNA基因上的SNP差異，開發(fā)了競爭性等位基因特異性PCR（KompetitiveAlleleSpecificPCR，KASP）的分型方法，這有助于解析福建省內(nèi)野生棘胸蛙不同種群間的遺傳差異，也有助于建立棘胸蛙的遺傳資源庫，為未來的遺傳育種、種質(zhì)資源保護以及可持續(xù)利用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1野生棘胸蛙的來源

本研究所用的野生棘胸蛙樣本采集自福建省15個地區(qū)：武夷山市、建陽區(qū)、順昌縣、將樂縣、明溪縣、永安市、華安縣、德化縣、新羅區(qū)、政和縣、屏南縣、寧德市、福鼎市、永泰縣、福安市。均取野生棘胸蛙的大腿內(nèi)側(cè)肌肉組織，用于DNA抽提。

1.2野生棘胸蛙DNA提取

剪取棘胸蛙大腿內(nèi)側(cè)肌肉組織，取適量的肌肉組織于EP管中，加入蛋白酶K，用渦旋振蕩儀將其混勻。按照Quick-DNATMMiniprepPlusKit試劑盒（ZYMORESEARCH）說明書的步驟，提取棘胸蛙的DNA。提取好的DNA保存在?80℃冰箱中。

1.3棘胸蛙線粒體12SrRNA基因的PCR引物設計及反應體系

用于擴增棘胸蛙線粒體12srRNA基因的PCR引物序列見表1。PCR反應體系（20μL）組成：2×AccurateTaqMasterMix（艾科瑞生物有限公司）10μL，上下游引物各0.2μL，DNA模版1μL，ddH2O8.6μL。PCR擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)35次；72℃再延伸7min，4℃冷卻保存。PCR擴增所得產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，剩余PCR產(chǎn)物送往鉑尚生物技術（上海）有限公司進行測序。

1.4線粒體12srRNA基因序列數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物的測序序列全部通過NCBI官網(wǎng)進行同源性比對，從而確定所得的序列為棘胸蛙的線粒體12SrRNA基因序列。采用MEGA7.0軟件對所采集的棘胸蛙線粒體12srRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，參數(shù)設置為鄰接法（Neighborjoining，NJ），同時用自展檢驗法（BootstrapTest）獲得系統(tǒng)進化樹各分支的置信值，重復抽樣1000次。構(gòu)建進化樹時以脆皮大頭蛙Limnonectes fragilis和斑腿樹蛙Polypedates megacephalus作為外群。

1.5KASP反應體系及擴增程序

采用ClusterW軟件分析野生棘胸蛙在福建省內(nèi)兩大地理種群分支的線粒體12SrRNA基因序列，通過序列比對，找到兩個地理種群分支中獨有的SNP位點。進一步基于DNAMAN軟件和引物設計軟件Primer3針對SNP位點設計KASP特異性引物（見表2），引物設計完成后經(jīng)鉑尚生物技術（上海）有限公司合成。KASP引物混合體系的配置：12SrRNA-F1（100μmol·L?1）12μL，12SrRNA-F2（100μmol·L?1）12μL，12SrRNA-R（100μmol·L）30μL，ddH2O46μL，混合均勻。KASP反應體系（10μL）：HiGeno2×ProbeMix（北京嘉程生物科技有限公司）5μL，KASP引物0.14μL，DNA模板1μL，ddH2O4μL。AQPTM基因分型系統(tǒng)的PCR擴增程序：95℃預變性10min；95℃變性20s，61℃退火40s，循環(huán)35次，每循環(huán)1次，溫度降0.6℃；95℃變性20s，55℃退火/延伸40s，循環(huán)45次；4℃冷卻保存。PCR擴增循環(huán)結(jié)束后，采用TaqManGenotyperSoftware對AQPTM基因分型數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1棘胸蛙樣本的DNA提取結(jié)果

提取的棘胸蛙基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳（圖1）檢測，條帶明亮清晰，并且無明顯拖帶現(xiàn)象，可用于后續(xù)的基因PCR擴增。

2.2棘胸蛙線粒體12SrRNA基因的擴增

棘胸蛙線粒體12SrRNA基因片段的PCR擴增結(jié)果經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖譜顯示均獲得明亮清晰的條帶，12SrRNA擴增所獲片段長度為400bp左右，見圖2。

2.3基于線粒體12SrRNA基因序列分析福建省野生棘胸蛙的種群分化

以脆皮大頭蛙和斑腿樹蛙的線粒體12SrRNA基因?qū)蛄袨橥馊?，對所篩得的福建野生棘胸蛙單倍型進行聚類分析。結(jié)果顯示，以鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹（圖3）中，可以將福建省野生棘胸蛙分成兩大支，武夷山（WY）、建陽（JY）、順昌（SC）、將樂（JL）、明溪（MX）、永安（YA）、華安（HA）、德化（DH）和新羅（XL）聚為一支A1，武夷山（WY）、政和（ZH）、屏南（PN）、寧德（ND）、福鼎（FD）、永泰（YT）、德化（DH）、新羅（XL）和福安（FA）聚為一支B1。其中，武夷山、德化、新羅在兩個大支均有分布。

2.4福建省內(nèi)野生棘胸蛙線粒體12SrRNA基因序列上地區(qū)特異SNP篩選

將所有棘胸蛙的線粒體12SrRNA基因測序結(jié)果分別進行序列比對，對獲得的分組進行組間序列比較，挑選出每組特有的SNP位點（圖4）。

2.5基于線粒體12SrRNA基因序列上地區(qū)特異SNP開發(fā)KASP快速分型體系

本研究基于線粒體12SrRNA基因數(shù)據(jù)分析，在12SrRNA上篩選出1個特異的SNP位點，根據(jù)該SNP位點（圖5）設計1對KASP引物。KASP反應測試在ABIStepOnePlus實時熒光定量PCR儀基因分型平臺上進行，KASP基因分型的實驗結(jié)果見圖6。圖中綠色為TC基因型，對應于武夷山、建陽、順昌、將樂、明溪、永安、華安、德化和新羅的地理種群；紅色為TT基因型，包括武夷山、政和、屏南、寧德、福鼎、永泰、德化、新羅和福安的地理種群。對KASP標記分型結(jié)果進行統(tǒng)計，基因分型結(jié)果與基于線粒體12SrRNA基因片段對野生棘胸蛙的聚類結(jié)果一致，說明采用所設計的KASP分型引物，能正確區(qū)分福建省野生棘胸蛙的兩大支系。對KASP標記分型結(jié)果進行統(tǒng)計，與預測結(jié)果一致，說明采用本研究所設計的KASP分型引物，能正確區(qū)分福建省野生棘胸蛙的兩大支系。

3 討論與結(jié)論

Che等[15]利用棘蛙屬的核基因和線粒體基因進行系統(tǒng)發(fā)生樹分析時，提出了一個假設，即棘蛙屬這一物種內(nèi)部可能隱藏著未被識別的隱種，他們的研究揭示了棘蛙屬在遺傳層面上的復雜性。隨后，路慶芳[4]研究通過對13個棘胸蛙地理種群的線粒體DNA細胞色素b基因562bp序列的測定，發(fā)現(xiàn)棘胸蛙可以分為4個不同的支系，這4個支系分別與越南、中國西部、中國中部和中國東部的種群相對應。這些支系之間的地理分布互不重疊，且遺傳距離較大，接近種間分化水平。Zheng等[16]采用了磁珠富集法篩選了15對多態(tài)性較高的微衛(wèi)星引物。這些引物在來自兩個種群的38只棘胸蛙個體中表現(xiàn)出了較高的多態(tài)性，顯示出它們在棘胸蛙種群遺傳結(jié)構(gòu)研究中的潛在價值。鄭榮泉[3]利用其中多態(tài)性較高的12對微衛(wèi)星引物，進行了棘胸蛙的遺傳結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，棘胸蛙具有較高的遺傳多樣性，進一步證實了棘胸蛙種群的遺傳多樣性。聚類分析和系統(tǒng)發(fā)生樹分析的結(jié)果與線粒體DNA數(shù)據(jù)基本一致，均支持棘胸蛙存在4個遺傳分化單元，這些單元嚴格符合進化顯著單元的條件。黃華[17]在測定國內(nèi)的棘胸蛙及其近緣種的線粒體16SrRNA和12SrRNA基因序列后，也得出了類似的結(jié)論。他認為廣泛分布在中國南部的棘胸蛙可能至少包含兩個隱存種。這些隱存種在形成過程中可能從西南向東北方向擴散。這些研究為理解棘胸蛙的遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)生以及可能的隱種存在提供了寶貴的見解，揭示了這一物種在進化和遺傳上的復雜性。

由于福建省多山，而棘胸蛙屬于兩棲類，其擴散能力有限，容易受歷史地質(zhì)因素的影響，而產(chǎn)生遺傳上的譜系地理分歧演化。因此，福建省內(nèi)野生的棘胸蛙種群也可能存在隱存種。本研究通過采集了福建省內(nèi)多個地區(qū)的野生棘胸蛙樣本，進行了遺傳多樣性研究。結(jié)果顯示，基于棘胸蛙的12SrRNA基因片段所構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹可以把福建省野生棘胸蛙種群分為兩大支系：一支包括武夷山、建陽、順昌、將樂、明溪、永安、新羅、德化和華安的地理種群；另一支包括武夷山、政和、新羅、永泰、德化、屏南、福安、寧德和福鼎的地理種群。其中武夷山、德化、新羅樣品在兩個大支系中均有分布。這兩個支系已經(jīng)在遺傳上產(chǎn)生了分化，因此可能是隱存種。通過對于地區(qū)的地貌特征查看，這兩種福建省內(nèi)野生棘胸蛙的隱存種的分布趨勢可能與山脈形成有關。最后，為了對福建省的野生棘胸蛙進行兩大支系的判斷更加便捷和低成本，本研究基于福建省野生棘胸蛙兩個支系在線粒體12SrRNA基因上的差異位點，開發(fā)競爭性等位基因特異性PCR（KASP）的分型方法。研究結(jié)果顯示，采用本研究所設計的KASP分型引物，能正確區(qū)分福建省野生棘胸蛙的兩個支系。與傳統(tǒng)的PCR擴增測序方法相比，KASP標記利用特異熒光引物，對目標SNP位點進行精準的擴增，通過掃描熒光信號進行基因型分型，不需要進行電泳、照相和讀帶分析，具有便捷、快速的特點。本研究基于KASP所建立的方法具有操作簡單、時間短、成本低的優(yōu)點，可應用于大規(guī)模樣品的檢測。本研究成果有助于解析福建省內(nèi)野生棘胸蛙不同種群間的遺傳差異，也有助于建立棘胸蛙的遺傳資源庫，為未來的遺傳育種、種質(zhì)資源保護以及可持續(xù)利用提供基礎數(shù)據(jù)。

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（責任編輯：柯文輝）