摘 要：哈氏窩是文昌魚生殖內(nèi)分泌調(diào)控軸重要組成部分，為了進(jìn)一步揭示文昌哈氏窩形態(tài)特征與性腺發(fā)育的關(guān)系，豐富文昌魚的生物學(xué)基礎(chǔ)信息，利用組織學(xué)切片及HE染色技術(shù)觀察了佛羅里達(dá)文昌魚在性腺發(fā)育不同時(shí)期哈氏窩形態(tài)變化。結(jié)果表明：佛羅里達(dá)文昌魚在性腺剛出現(xiàn)及早期時(shí)，哈氏窩位于文昌魚哈氏窩位于脊索附近，有一層薄膜相隔，呈近似對(duì)稱的倒“凹”狀；在性腺發(fā)育和成熟時(shí)期，哈氏窩頂部增厚，胞質(zhì)清晰，兩側(cè)向窩內(nèi)增大，窩內(nèi)空隙變小，形狀呈現(xiàn)矮寬；在性腺排空及退化時(shí)期，哈氏窩兩側(cè)呈細(xì)長(zhǎng)狀，窩內(nèi)空間狹窄。

關(guān)鍵詞：佛羅里達(dá)文昌魚；哈氏窩；石蠟切片；組織學(xué)觀察

中圖分類號(hào)：Q954.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253?2301（2024）07?0017?04

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.07.003

Morphological and Structural Changes of Hatschek's Pit Tissue in Branchio-stoma floridae atDifferent Stages of Gonadal Development

CENWan，WURui-qiong，YANGLi-cheng，HUANGZhen

（1.College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China;2.Innovation and Transformation Center， Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： Thehatschek'spitisanimportantcomponentof thereproductiveendocrineregulationaxisinAmphioxus.Inordertofurtherrevealtherelationshipbetweenthemorphologicalcharacteristicsofhatschek'spitandgonadaldevelopmentofAmphioxus，andenrichthebiologicalbasicinformationofAmphioxus，themorphologicalchangesofhatschek'spitatdifferentstagesofgonadaldevelopmentofBranchio-stoma floridae wereobservedbyusingthehistologicalsectionandHEstainingtechnique.TheresultsshowedthatwhenthegonadsofBranchio-stoma floridaeappearedatthebeginningandearlystageofdevelopment，thehatschek'spitwaslocatednearthenotochordofAmphioxus，withathinfilmseparatingit，forminganapproximatelysymmetricalinverted"concave"shape.Duringthedevelopmentandmatureperiodofgonads，thehatschek'spithadathickenedtop，clearcytoplasm，enlargedonbothsidestowardsthepit，smallergapswithinthepit，andashorterandwidershape.Duringtheperiodofgonadalemptyinganddegeneration，thetwosidesofthehatschek'spitwereslenderandthespaceinsidethepitwasnarrow.

Key words： Branchio-stoma floridae；Hatschek'spit；Paraffinsectioning；Histologicalobservation

文昌魚Amphioxus屬于脊索動(dòng)物門、頭索動(dòng)物亞門、頭索綱，是無脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物的中間態(tài)，有著脊索動(dòng)物的三大特征：有鰓裂、神經(jīng)管和脊索，可以提供有關(guān)脊椎動(dòng)物起源和演化的重要線索[1]。常見的文昌魚有佛羅里達(dá)文昌魚Branchio-stoma floridae、白氏文昌魚Branchiostoma belcheri、日本文昌魚Branchiostoma. japonicum等。目前佛羅里達(dá)文昌魚的基因組已經(jīng)被發(fā)表，結(jié)果顯示文昌魚的基因組演化速率相對(duì)較慢，其保留了與現(xiàn)代脊椎動(dòng)物相似的身體結(jié)構(gòu)[2]。

文昌魚的哈氏窩（Hatschek'spit）屬于輪器的一部分，起源于內(nèi)胚層或外胚層，位于口腔頂部，是個(gè)凹坑結(jié)構(gòu)[3]。哈氏窩因在文昌魚的攝食機(jī)制中發(fā)揮作用[4]而引起了特別的關(guān)注，因?yàn)樗c被囊動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的多種結(jié)構(gòu)同源，目前認(rèn)為它對(duì)應(yīng)于脊椎動(dòng)物的垂體。Drach[5]也提到了哈氏窩和環(huán)口動(dòng)物垂體管之間的特殊同源性關(guān)系。我國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了文昌魚存在原始的生殖內(nèi)分泌調(diào)控軸、腦-哈氏窩-性腺軸，與脊椎動(dòng)物腦（下丘腦）-腦垂體-性腺軸相似，該軸調(diào)節(jié)文昌魚性腺發(fā)育成熟及其生殖活動(dòng)[6?8]。因此，剖析文昌魚哈氏窩的發(fā)育特征為探索器官的生理功能和演化歷程提供了的線索，具備一定的研究?jī)r(jià)值。本研究通過組織學(xué)切片的技術(shù)手段觀察不同發(fā)育時(shí)期的哈氏窩形態(tài)，為佛羅里達(dá)文昌魚發(fā)育生物學(xué)和哈氏窩結(jié)構(gòu)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中佛羅里達(dá)文昌魚Branchiostoma floridae是實(shí)驗(yàn)室科研引進(jìn)后人工飼養(yǎng)繁育的子三代。收集性腺發(fā)育早期（性腺剛開始、性腺分化早期）、發(fā)育中期（性腺發(fā)育中、性腺成熟）、發(fā)育后期（性腺排空、性腺退化完整）的文昌魚。

1.2哈氏窩組織切片制備

整只文昌魚置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的PFA（多聚甲醛）溶液中，4℃條件下固定24h。固定完成后，將樣品置于體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%和100%酒精中進(jìn)行梯度脫水，充分脫水后的組織經(jīng)二甲苯透明和石蠟包埋，制備成為蠟塊，之后進(jìn)行石蠟切片，切片厚度為8μm。

1.3蘇木精-伊紅染色（H.E染色）

將石蠟組織切片置于烘箱（60℃）中烘烤30min，經(jīng)二甲苯、酒精梯度脫蠟和復(fù)水，隨后用蘇木精-伊紅染色，再次梯度脫水后用中性樹脂封片。

1.4顯微觀察

待樹脂干后通過顯微鏡（ZeissAxioZoom.V16）進(jìn)行觀察，運(yùn)用軟件ZEN2Pro進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果與分析

2.1佛羅里達(dá)文昌魚性腺發(fā)育初期的哈氏窩形態(tài)

在性腺剛出現(xiàn)的文昌魚中，通過解剖，在脊索中線側(cè)下方能觀察到倒“凹”型的哈氏窩組織。左右近似對(duì)稱，哈氏窩頂部與脊索以一層薄膜相連，僅有薄薄的上皮構(gòu)成哈氏窩初型，其窩內(nèi)空隙大。通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，哈氏窩的細(xì)胞核呈圓形（圖1a、1a′）。當(dāng)文昌魚發(fā)育至性腺早期時(shí)，哈氏窩頂部體積增大，兩側(cè)逐漸成形，以細(xì)長(zhǎng)狀為主向窩內(nèi)突起，并且在靠近哈氏窩底部開始出現(xiàn)細(xì)小纖毛，具有致密細(xì)胞核，核與核間堆疊，核數(shù)目增多，胞質(zhì)較少（圖1b、1b′）。

2.2佛羅里達(dá)文昌魚性腺發(fā)育中期的哈氏窩形態(tài)

在佛羅里達(dá)文昌魚性腺逐漸成熟的過程中，通過取樣觀察可以看到，哈氏窩頂部組織繼續(xù)增厚，細(xì)胞核由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)形，且排列緊密，胞質(zhì)清晰，兩側(cè)向窩內(nèi)增大，窩內(nèi)空隙變?。▓D2a、2a′）。至性腺發(fā)育成熟時(shí)，哈氏窩頂部沒有明顯改變，兩側(cè)向哈氏窩頂部回縮，不再向窩底部方向增大，形狀呈現(xiàn)矮寬，但繼續(xù)向窩內(nèi)增厚，纖毛變長(zhǎng)并排列有序（圖2b、2b′）。

2.3佛羅里達(dá)文昌魚性腺發(fā)育晚期的哈氏窩形態(tài)

當(dāng)佛羅里達(dá)文昌魚處于性腺排空時(shí)期，可以在切片中觀察到哈氏窩兩側(cè)逐漸變回細(xì)長(zhǎng)狀，仍有纖毛存在，窩內(nèi)變得狹窄（圖3a、3a′）。當(dāng)性腺退化后，哈氏窩細(xì)胞核排列緊密，形態(tài)幾乎與性腺排空時(shí)期相差不大，僅有窩內(nèi)空間增大（圖3b、3b′）。

3 討論與結(jié)論

在文昌魚哈氏窩的相關(guān)研究中，通常把哈氏窩的凹槽作為識(shí)別標(biāo)志。在本研究中同樣顯現(xiàn)了凹槽的哈氏窩，并從組織學(xué)上對(duì)不同性腺發(fā)育時(shí)期的佛羅里達(dá)文昌魚哈氏窩發(fā)育規(guī)律進(jìn)行了探索。結(jié)果表明文昌魚哈氏窩位于脊索附近，有1層薄膜相隔，呈近似對(duì)稱的倒“凹”狀。在性腺不斷發(fā)育過程中，哈氏窩兩側(cè)逐漸增厚，由細(xì)長(zhǎng)型轉(zhuǎn)為矮寬型，體積不斷向窩內(nèi)變大，于后期再次轉(zhuǎn)為細(xì)長(zhǎng)型且體積縮小，哈氏窩頂部變化不大。同樣地，Gorbman[9]等發(fā)現(xiàn)只有1層薄薄的透明基底膜狀將哈氏窩與相鄰的組織分開，并且凹槽結(jié)構(gòu)雖不完全對(duì)稱，但僅有些許差距。而哈氏窩的窩內(nèi)空隙，因哈氏窩兩側(cè)體積變化而變化，當(dāng)哈氏窩兩側(cè)體積增大后，窩內(nèi)空隙就變小，反之，空隙變大。另外哈氏窩具有致密的細(xì)胞核，并且核的數(shù)目隨著發(fā)育進(jìn)行而增多，直至發(fā)育成熟后便不再增多，核形狀也由最初的圓形至中期開始轉(zhuǎn)為細(xì)長(zhǎng)形。文昌魚哈氏窩是由3種類型的細(xì)胞所組成，分別為：位于頂部的上皮細(xì)胞、位于中間的不規(guī)則細(xì)胞以及位于底部（近口腔）的纖毛黏液細(xì)胞[10]。而在本研究中，也發(fā)現(xiàn)了纖毛的存在，纖毛不斷變長(zhǎng)并有序排列。

文昌魚的生殖內(nèi)分泌調(diào)控系統(tǒng)（腦泡-哈氏窩-性腺）能夠調(diào)控性腺發(fā)育、成熟及生殖活動(dòng)等[11]。佛羅里達(dá)文昌魚哈氏窩發(fā)育變化可能與水溫有關(guān)，哈氏窩位于口腔頂部，與水流相通，對(duì)于水溫敏感，接受到刺激后，傳入神經(jīng)刺激端腦中類似GnRH系統(tǒng)，緊接著該神經(jīng)元發(fā)出纖維到達(dá)哈氏窩，促使哈氏窩逐漸發(fā)育合成多種脊椎動(dòng)物腺垂體激素[12]，調(diào)控文昌魚的性腺發(fā)育。本試驗(yàn)對(duì)佛羅里達(dá)文昌魚哈氏窩發(fā)育進(jìn)行了初步探究，為佛羅里達(dá)文昌魚哈氏窩發(fā)育的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）