摘 要：為了探究不同類別的植物源性抗氧化劑對太湖豬精液常溫保存效果的影響，選取了姜黃素、β-胡蘿卜素兩種常見的抗氧化劑，分別以不同濃度（姜黃素：0、3、6、9μg·mL?1；β-胡蘿卜素：0、10、20、40μg·mL?1）添加到太湖豬精液稀釋液中，采用目測法、低滲腫脹法和瑞氏-吉姆薩染色法檢測精子在17℃保存環(huán)境中第1、3、5、7d的活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率。結(jié)果表明：添加一定濃度的姜黃素、β-胡蘿卜素均能顯著提高精子質(zhì)量，其中姜黃素的最適添加濃度為6μg·mL?1，β-胡蘿卜素的最適添加濃度為20μg·mL?1。

關(guān)鍵詞：豬精液；常溫保存；姜黃素；β-胡蘿卜素

中圖分類號：S828 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：0253?2301（2024）07?0021?05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.07.004

Influence of Curcumin and β-Carotene on the Preservation Effect of Taihu Pig Semenat Room Temperature

QIYa-dong， LIANGJia-wen，HOUZhen-ye，F(xiàn)ENGYu-chen，ZHAOXiao-jie，WUYi，WUJie-ge， LIUJing-ge

（College of Animal Science and Food Engineering， Jinling Institute of Technology， Nanjing， Jiangsu 210000， China）

Abstract：InordertoexploretheeffectofdifferenttypesofphytogenicantioxidantsonthepreservationofTaihupigsemenatroomtemperature，thetwocommonlyusedantioxidants，curcuminandβ-carotene，wereselected.Theywereaddedatdifferentconcentrations（curcumin：0，3，6，9μg·mL;β-carotene：0，10，20，40μg·mL）tothesemendiluentofTaihupig.Thespermvitality，plasmamembraneintegrityrateandacrosomeintegrityrateweredetectedbyusingthevisualobservation，hypotonicswellingmethodandWright-Giemsastainingmethodonthe1st，3rd，5thand7thdayofpreservationat17°C.Theresultsshowedthattheadditionofcertainconcentrationsofcurcuminandβ-carotenecouldsignificantlyimprovethespermquality，withtheoptimalconcentrationsbeing6μg·mLforcurcuminand20μg·mLforβ-carotene.

Key words： Pigsemen；Roomtemperaturepreservation；Curcumin；β-carotene

豬精液的保存技術(shù)是現(xiàn)代畜牧生產(chǎn)中重要的實用技術(shù)之一?，F(xiàn)有的豬精液保存技術(shù)包括常溫保存、低溫保存和冷凍保存。其中，常溫保存所需的設(shè)備簡單，生產(chǎn)成本更低，更容易普及和推廣。在豬精液的常溫保存中，精液質(zhì)量易受多方面因素的影響，如溫度、pH、滲透壓、稀釋倍數(shù)、抗氧化水平、微生物等[1]，其中精液中過量的活性氧（ROS）會對精子質(zhì)量造成很大影響，不但降低精子的活力，還會使精子DNA鏈斷裂，影響其受精能力[2]。因此，在保存過程中抑制氧化應(yīng)激對維持精子的活力至關(guān)重要。在稀釋液中添加一定的抗氧化物質(zhì)有助于提高精液的抗氧化水平，降低因活性氧自由基累積造成的精液品質(zhì)下降，從而延長精液的保存時間[3]。

植物性提取物具有良好的抗氧化能力，可以降低體外保存過程中精子的氧化應(yīng)激損傷，抑制精子膜的脂質(zhì)過氧化，對精子的結(jié)構(gòu)與功能具有保護作用[4?5]。盡管現(xiàn)有的研究結(jié)果表明植物源性抗氧化劑普遍能夠提升常溫保存下豬精液的品質(zhì)[6?8]，但由于不同試驗中所采集到的精液品質(zhì)難免有所差異，難以對不同植物源性抗氧化劑的作用效果進行橫向比較。

本試驗選取姜黃素和β-胡蘿卜素兩種不同植物源性的抗氧化劑，分別以不同的濃度加入到太湖豬精液稀釋液中，通過檢測常溫下精子在第1、3、5、7d的活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率，評價兩種植物源性抗氧化劑對豬精液常溫保存效果的影響，從而篩選出能夠應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中更安全、更有效的抗氧化劑，為豬精液常溫保存過程中抗氧化劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1主要試劑 姜黃素、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品購于Rhawn公司，以少量DMSO助溶配制為1μg·mL?1母液；低滲液由0.735g檸檬酸鈉和1.35g果糖溶解至100mL超純水配合而成；快速瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色液購自Phygene公司，商品稀釋粉為法國大歐公司產(chǎn)品。

1.1.2豬精液的采集與處理 精液取自南京竹順生物技術(shù)有限公司豬場的8頭健康太湖豬，由豬場工作人員用手握法采集，并對其顏色、體積、pH、氣味以及活力進行檢查。新鮮采集的精子活力大于70%、畸形率小于20%、無異味、色澤為乳白色方為合格[9]。將檢測合格的精液分裝到干凈的EP管中，等溫梯度稀釋9倍。將處理好的精液放入17℃恒溫箱中，每隔12h顛倒混勻1次，以防精子沉積。

1.2試驗方法

1.2.1試驗設(shè)計 試驗于2024年1月中旬進行，以不添加抗氧化劑的精液稀釋液為對照組，設(shè)置6個試驗組，使最終精液稀釋液中分別含3、6、9

μg·mL的姜黃素和10、20、40μg·mL?1的β-胡蘿卜素。每組設(shè)置3個重復(fù)，并分別在第1、3、5、7d對精子的活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率進行測定。

1.2.2活力檢測 精子的活力采用目測法進行檢測。在顯微鏡下觀察精液稀釋液中呈直線運動的精子數(shù)量，并計算其占總精子數(shù)的百分比。

1.2.3質(zhì)膜完整率 質(zhì)膜完整率用低滲腫脹法檢測。將100μL精液稀釋液添加到1mL低滲液中充分混勻，37℃水浴30min。取20μL混合液滴于載玻片上，拉薄，在顯微鏡下觀察清晰視野中彎尾精子的數(shù)量，并計算其占總精子數(shù)的百分比。

1.2.4頂體完整率 用快速瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液對經(jīng)70%乙醇固定的精子進行染色，待干燥后觀察頭部被染成紅色的精子數(shù)量，并計算其占總精子數(shù)的百分比。

1.2.5數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)使用Excel2021和SPSS27.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1姜黃素對太湖豬精液常溫保存效果的作用

由表1可知，在常溫保存第1～3d，3個試驗組的精子活力均高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。在常溫保存第5～7d，3個試驗組的精子活力顯著高于對照組（P＜0.05）。

在常溫保存第1d時，3μg·mL?1和6μg·mL?1姜黃素添加組的質(zhì)膜完整率高于對照組，而9μg·mL姜黃素添加組的質(zhì)膜完整率低于對照組，但差異均不顯著（P＞0.05）。在保存第3d時，3個試驗組的質(zhì)膜完整率均高于對照組，其中3μg·mL和6μg·mL?1姜黃素添加組與對照組之間差異顯著（P＜0.05）。在常溫保存第5～7d時，3個試驗組的質(zhì)膜完整率均顯著高于對照組（P＜0.05），其中6μg·mL?1姜黃素添加組的質(zhì)膜完整率最高。

在常溫保存第1d時，3個試驗組的頂體完整率均顯著高于對照組（P＜0.05）。在常溫保存第3d時，3個試驗組的頂體完整率均高于對照組，但9μg·mL姜黃素添加組與對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05）。在常溫保存第5d時，各組精子的頂體完整率無顯著差異（P＞0.05）。在保存第7d時，6μg·mL?1姜黃素添加組的頂體完整率高于對照組和3μg·mL?1姜黃素添加組（P＜0.05），和9μg·mL姜黃素添加組無顯著差異（P＞0.05）。2.2β-胡蘿卜素對豬精液常溫保存效果的影響由表2可知，在常溫保存第1 d時，10μg·mL和20μg·mL?1β-胡蘿卜素添加組的精子活力高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。在常溫保存第3d時，10μg·mL?1和20μg·mL?1β-胡蘿卜素添加組的精子活力顯著高于對照組（P＜0.05），但與40μg·mL?1β-胡蘿卜素添加組無顯著差異（P＞0.05）。在常溫保存第5 d時，20μg·mLβ-胡蘿卜素添加組的精子活力顯著高于對照組和40μg·mL?1β-胡蘿卜素添加組，但與10μg·mLβ-胡蘿卜素添加組無顯著差異（P＞0.05）。在常溫保存第7d時，20μg·mL?1β-胡蘿卜素添加組的精子活力顯著高于其他各組（P＜0.05）。

在常溫保存第1～3d時，10μg·mL?1和20μg·mLβ-胡蘿卜素添加組的精子質(zhì)膜完整率顯著高于對照組（P＜0.05），但與40μg·mL?1β-胡蘿卜素添加組無顯著差異（P＞0.05）。在常溫保存第5d時，3個試驗組的質(zhì)膜完整率均顯著高于對照組（P＜0.05）。在常溫保存第7d，20μg·mL?1β-胡蘿卜素添加組的精子質(zhì)膜完整率顯著高于其他各組（P＜0.05）。

在常溫保存第1d和第5d時，3個試驗組的頂體完整率均顯著高于對照組（P＜0.05）。在常溫保存第3d和第7d時，20μg·mL?1β-胡蘿卜素添加組的頂體完整率顯著高于其他各組（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

姜黃素是從郁金、姜黃、菖蒲、莪術(shù)等植物根莖中提取出來的一種植物多酚，化學(xué)性質(zhì)活潑，生理活性廣泛，具有較好的抗炎、抗菌和抗氧化性能[10]。多年來廣泛用于食品、化妝品和醫(yī)療行業(yè)[11?12]。龔琴琴[13]研究表明：低濃度姜黃素可以降低ROS含量、抗脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，對人精子DNA具有明顯的保護作用，而高濃度的姜黃素則會促進ROS形成，從而破壞精子結(jié)構(gòu)。楊金風(fēng)[14]研究表明，姜黃素能顯著降低脂質(zhì)過氧化，提高睪丸組織抗氧化水平，顯著改善環(huán)磷酰胺對小鼠睪丸的有害作用。這些結(jié)果表明，姜黃素通過清除活性氧和增強內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的活性，在體外保護細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，并降低細(xì)胞氧化應(yīng)激。牛統(tǒng)娟[15]在研究活性氧對常溫保存豬精子的抗凋亡作用的研究中，測定了姜黃素對常溫保存豬精子活力的影響，結(jié)果表明稀釋液中添加15μmol·mL姜黃素和能夠顯著提高豬精子活力，與本試驗結(jié)果類似。但本試驗中并未出現(xiàn)在高處理濃度中活力遠(yuǎn)低于對照組的情況，可能的原因是本試驗中精液稀釋比高于常規(guī)豬精液稀釋倍數(shù)，減輕了高濃度姜黃素對精子產(chǎn)生的不利影響。

β-胡蘿卜素是維生素A最重要的來源之一，廣泛地存在于各類植物性食品中。哺乳動物不能自主合成類胡蘿卜素，需要從食物中攝入。類胡蘿卜素對雄性生殖功能和精子發(fā)生有諸多重要的影響[16]。Ma等[17]研究表明β-胡蘿卜素顯著提高了白消安處理后的小鼠精子濃度和活力，提高了精子生成相關(guān)的多個基因（如VASA、SYCP3、PGK2等）和蛋

白質(zhì)PIWIL1的表達水平，提高了睪丸中的抗氧化酶活性（SOD、GPX1、CAT）和總抗氧化能力，從而減少了白消安引起的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。此外，越來越多的試驗證實了類胡蘿卜素的抗氧化能力同樣能對冷凍精液的保存起到積極作用[18?19]。本試驗結(jié)果表明稀釋液中添加一定濃度的β-胡蘿卜素能有效延長豬精液的常溫保存效果。在常溫保存7d時，豬精子的活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率相較于對照組均有顯著提升，其中添加20μg·mL的試驗組效果最好，3個指標(biāo)相比對照組均有顯著的提升。

姜黃素的抗氧化能力源于兩個鄰甲氧基酚性羥基，β-胡蘿卜素的抗氧化能力源于其多共軛多烯、多烯鏈的結(jié)構(gòu)和官能團（特別是共軛碳基）[20]。過量的ROS可以和蛋白質(zhì)、DNA以及不飽和脂肪酸發(fā)生作用，對精子造成多種氧化損傷，如質(zhì)膜損傷、DNA完整性損傷、精子細(xì)胞凋亡、活力及運動能力下降等[21]。將姜黃素和β-胡蘿卜素添加到精液稀釋液中，去除了冗余的ROS，提升了常溫下精液的保存效果。

本研究結(jié)果表明，添加一定濃度的姜黃素和β-胡蘿卜素均有助于維持精子的活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率。其中，姜黃素的最適添加濃度為6μg·mL、β-胡蘿卜素的最適添加濃度為20μg·mL?1。在保存效果方面，最適濃度下β-胡蘿卜素添加組精子的活力和質(zhì)膜完整率與姜黃素添加組相似，頂體完整率略高于姜黃素添加組，但所需處理的濃度遠(yuǎn)高于姜黃素組。本試驗中所購得的β-胡蘿卜素的價格是姜黃素的3倍，綜合分析，常溫保存的豬精液中添加6μg·mL?1的姜黃素性價比更高。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）