摘 要 為了全面評(píng)估引種尼泊爾黃花木的低溫適應(yīng)性，對(duì)其葉片進(jìn)行了4、0、-4、-8、-12、 -16 ℃的低溫處理，詳細(xì)測(cè)定并分析了9個(gè)生理指標(biāo)的變化情況。采用相關(guān)性分析法、隸屬函數(shù)法和主成分分析法進(jìn)行綜合分析評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：引種尼泊爾黃花木丙二醛（MDA）含量與大多生理指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，而超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）活性和脯氨酸（Pro）、可溶性糖（SS）含量之間存在正相關(guān)關(guān)系，其在-12 ℃以上具有較好的低溫適應(yīng)能力。

關(guān)鍵詞 尼泊爾黃花木；引種；低溫適應(yīng)性；江蘇省徐州市

中圖分類號(hào)：S793.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.17.020

尼泊爾黃花木（Piptanthus nepalensis），為豆科黃花木屬灌木，通常株高1.5～3.0 m，在海拔1 600～4 000 m的山坡林緣、河流和草地灌叢中均有分布。在西藏高寒地區(qū)，其生長(zhǎng)較快，病蟲(chóng)害較少，抗逆性強(qiáng)，非常適合用于城市綠化和生態(tài)修復(fù)，引種開(kāi)發(fā)潛力巨大。2023年3月，將尼泊爾黃花木由林芝引種至徐州種植，由于徐州地處南北氣候過(guò)渡帶，氣候變化較為復(fù)雜，“倒春寒”現(xiàn)象較為頻繁，露地引種的尼泊爾黃花木于2024年2月開(kāi)始結(jié)束休眠期，相對(duì)種源地較早抽芽的苗木能否順利度過(guò)“倒春寒”頻發(fā)期是引種成功不可忽略的問(wèn)題[1]。研究引種培育尼泊爾黃花木在低溫脅迫下的生理指標(biāo)的變化，對(duì)于評(píng)價(jià)其低溫適應(yīng)性具有重要意義。

1" 材料與方法

1.1" 植物材料

尼泊爾黃花木葉片采集自引種地苗圃試驗(yàn)田內(nèi)，株體為2023年4月播種苗。低溫處理葉片可以更好地控制試驗(yàn)條件，避免植株其他部位（如根系、莖干等）的干擾，從而更準(zhǔn)確地分析葉片本身的生理響應(yīng)。

1.2" 試驗(yàn)儀器及試劑

天平（寧波浪力儀器有限公司），研缽、微量石英比色皿、玻璃試管、錫箔紙、烘箱（力辰科技有限公司），干燥器（力辰科技有限公司），分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司），水浴鍋（群安科學(xué)儀器有限公司）。乙醇、丙酮、石英砂、碳酸鈣、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、磺基水楊酸、酸性茚三酮溶液、冰醋酸、甲苯、磷酸緩沖液（PBS）、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑（NBT）、核黃素、EDTA-Na2、愈創(chuàng)木酚、過(guò)氧化氫溶液、苯酚溶液、濃硫酸、考馬斯亮藍(lán)G-250染料、牛血清白蛋白。

1.3" 試驗(yàn)方法

將從露地采得的尼泊爾黃花木葉片裝入保鮮箱，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后采用低溫程序控制箱模擬葉片在自然環(huán)境中可能經(jīng)歷的低溫狀態(tài)。溫度分別設(shè)置為4、0、-4、 -8、 -12、-16 ℃，并將4 ℃處理的葉片作為對(duì)照。在試驗(yàn)過(guò)程中，低溫程序控制箱以每10 min下降1 ℃的速度逐漸降低溫度，達(dá)到設(shè)定溫度后維持12 h；取出樣品置于常溫下12 h后測(cè)定葉綠素含量、相對(duì)含水量（RWC）、丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、可溶性糖（SS）含量、可溶性蛋白（SP）含量。

采用乙醇提取法測(cè)定葉綠素含量， 烘干法測(cè)定葉片RWC，硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定MDA含量[2]，酸性茚三酮比色法測(cè)定Pro含量[3]，氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定SOD活性[4]，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性[5]，紫外線吸收法測(cè)定CAT活性，苯酚-硫酸法測(cè)定SS含量，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定SP含量[6]。

1.4" 隸屬函數(shù)法評(píng)價(jià)

在對(duì)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析后，對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定值采用模糊數(shù)學(xué)隸屬度公式進(jìn)行定量轉(zhuǎn)換，隸屬函數(shù)值計(jì)算公式為：

U（Xij） = （Xij- Xjmin） / （Xjmax - Xjmin） （1）

U（Xij） = 1 - （Xij- Xjmin） / （Xjmax - Xjmin） （2）

式中：U（Xij） 表示第i個(gè)低溫處理下第j個(gè)指標(biāo)的隸屬度，Xij 表示第i個(gè)低溫處理下第j個(gè)指標(biāo)的測(cè)定值，Xjmax 和 Xjmin 分別表示所有處理中第j個(gè)指標(biāo)的最大值和最小值。對(duì)于正相關(guān)指標(biāo)，選用公式（1）；對(duì)于負(fù)相關(guān)指標(biāo)，選用公式（2）。

根據(jù)公式計(jì)算尼泊爾黃花木葉片在不同低溫脅迫下每個(gè)生理指標(biāo)的隸屬值。為了全面評(píng)估其低溫適應(yīng)性，將同一低溫處理下的所有耐寒指標(biāo)隸屬值進(jìn)行累加，并取其平均值作為綜合評(píng)價(jià)值。平均隸屬值越大，表明尼泊爾黃花木在該低溫條件下的適應(yīng)性和抗寒能力越強(qiáng)。

1.5" 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2019軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)整理，使用SPSS 27.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 低溫處理對(duì)引種尼泊爾黃花木生理指標(biāo)的影響

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素分解較慢的植物通常具有更強(qiáng)的抗寒性[7]。由表1可知，在4～（-12） ℃的范圍內(nèi)，尼泊爾黃花木的葉綠素含量先下降后小幅回升，但仍低于4 ℃時(shí)的水平，表明在低溫環(huán)境下其光合作用可能受到了一定抑制。植物體內(nèi)自由水和束縛水的比例會(huì)隨著環(huán)境條件的變化而變化，株體可以通過(guò)降低自由水含量、提高束縛水含量以提高抗性[8]。低溫脅迫下，尼泊爾黃花木葉片RWC在初期上升后整體變化趨于平穩(wěn)，表明其能夠通過(guò)調(diào)節(jié)自身水分平衡來(lái)適應(yīng)低溫環(huán)境。通常MDA含量較低表示植物細(xì)胞膜系統(tǒng)相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)性較強(qiáng)；而MDA含量較高則可能意味著植物細(xì)胞膜系統(tǒng)已遭受?chē)?yán)重?fù)p傷，對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)性較弱[9]。尼泊爾黃花木葉片MDA含量在初期大幅上升后隨著溫度降低逐漸下降，表明植株在低溫環(huán)境下可能通過(guò)降低MDA含量來(lái)保護(hù)細(xì)胞膜免受低溫凍害。

Pro、SS、SP作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以降低植物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的凝固點(diǎn)，從而減少細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的可能性，保護(hù)細(xì)胞免受低溫?fù)p傷[10]。低溫脅迫下，Pro、SS、SP含量均在初期呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在-16 ℃時(shí)降至4 ℃或更低水平，表明尼泊爾黃花木在極端低溫下代謝活動(dòng)受到嚴(yán)重抑制。

當(dāng)植物遭受低溫脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，這些自由基會(huì)對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成損傷，從而影響植物的正常生理功能，而SOD、POD、CAT作為重要的抗氧化酶，能夠清除這些自由基，保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整性，從而提高植物的抗寒性[11]。SOD活性和POD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在（-4）～（-12） ℃時(shí)，兩種酶活性均快速上升以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，但在（-12）～（-16） ℃時(shí)，酶活性急劇下降，表明該溫度是尼泊爾黃花木能夠維持正常生理功能的極限；CAT活性的變化則呈“雙峰”形態(tài)，表明在抵御低溫環(huán)境時(shí)酶活性被2次誘導(dǎo)，但第2次酶活性增幅顯著降低。

2.2" 相關(guān)性分析

由表2可知，對(duì)低溫處理后測(cè)定的尼泊爾黃花木9個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，MDA與Pro、SOD、POD、SS均呈負(fù)相關(guān)，表明在葉片受到低溫脅迫時(shí)MDA與這些指標(biāo)響應(yīng)不協(xié)同，因此，MDA含量越高，尼泊爾黃花木抗寒性越弱，這與魏鑫等在研究低溫脅迫下不同類型藍(lán)莓品種的抗寒性時(shí)得出的結(jié)論一致[12]。SOD與Pro顯著正相關(guān)，POD與Pro、SOD顯著正相關(guān)，SS與SOD、POD顯著正相關(guān)，表明這些指標(biāo)在尼泊爾黃花木受到低溫脅迫時(shí)起到正向協(xié)同作用，含量或活性越高，抗寒性越強(qiáng)。

2.3" 隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)尼泊爾黃花木的低溫適應(yīng)性

采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)法對(duì)測(cè)定的9個(gè)生理指標(biāo)求平均隸屬值，由表3可知，4～（-12） ℃間，隨著溫度逐漸降低，尼泊爾黃花木指標(biāo)平均隸屬值整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在此階段各保護(hù)酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量逐漸增加，其中4～0 ℃時(shí)變化較大，表明引種尼泊爾黃花木對(duì)冰點(diǎn)低溫較為敏感，能快速通過(guò)多指標(biāo)協(xié)同抵御低溫脅迫。當(dāng)溫度降低到-12 ℃時(shí)，尼泊爾黃花木9個(gè)生理指標(biāo)平均隸屬值達(dá)到最大值，此時(shí)Pro含量、SS含量、SOD活性、POD活性也達(dá)到最大值，葉片在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)酶的互相協(xié)同作用下抗寒能力達(dá)到峰值。

2.4" 主成分分析

由表4可知，各變量的公因子方差皆處于較高水平，均大于0.7，表明提取的公因子具有較高的信度，對(duì)原始變量的解釋程度較高，說(shuō)明本研究的因子分析過(guò)程有效。

由表5可知，前3個(gè)成分的特征值均大于1，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到88.166%，表明提取的3個(gè)主要成分基本上覆蓋了9個(gè)原始變量的所有信息，滿足特征值大于1的標(biāo)準(zhǔn)，因此，可選取前3個(gè)成分來(lái)構(gòu)建尼泊爾黃花木低溫處理各項(xiàng)指標(biāo)情況，將其命名為F1、F2、F3。

由表6可知，3個(gè)成分在9個(gè)原始變量上的載荷呈現(xiàn)出明顯的差異。通常來(lái)講，如果因子載荷的絕對(duì)值大于0.5，則可以將其分類為這種因子。由分析結(jié)果可見(jiàn)，X3（MDA）、X4（Pro）、X5（SOD）、X6（POD）、X8（SS）在第1成分上有很大的載荷量；X1（葉綠素）、X2（RWC）、X9（SP）在第2成分上有很大的載荷量；X7（CAT）在第3成分上有很大的載荷量。

表6" 成分矩陣及成分得分系數(shù)矩陣

[成分矩陣 成分矩陣 成分得分系數(shù)矩陣 1 2 3 1 2 3 X1 -0.779 -0.002 -0.232 -0.341 X2 0.690 0.038 0.462 -0.150 X3 -0.809 -0.155 0.177 -0.139 X4 0.897 0.277 0.136 -0.220 X5 0.939 0.259 0.112 -0.131 X6 0.918 0.238 -0.065 -0.056 X7 -0.770 -0.113 -0.106 0.599 X8 0.944 0.156 -0.082 0.223 X9 0.847 -0.037 0.429 0.034 ]

根據(jù)成分得分系數(shù)矩陣，設(shè)3個(gè)主成分為Fi，9個(gè)因素為Xj，因子載荷為Mij，主成分的表達(dá)式為：

[Fi=1j（MijXj）]，i=1，2，3；j=1，2，3，…，9 （3）

由公式（3）得到各因子的表達(dá)式：

F1=-0.002 X1+0.038 X2-0.155 X3+0.277 X4+0.259 X5+0.238 X6-0.113 X7+0.156 X8-0.037 X9 （4）

F2=-0.232 X1+0.462 X2+0.177 X3+0.136 X4+0.112 X5-0.065 X6-0.106 X7-0.082 X8+0.429 X9 （5）

F3=-0.341 X1-0.15 X2-0.139 X3-0.220 X4-0.131 X5-0.056 X6+0.599 X7+0.223 X8+0.034 X9 （6）

根據(jù)解釋的總方差表，計(jì)算出F1、F2、F3的權(quán)重分別為0.559、0.272、0.168，由主成分權(quán)重可得出綜合指數(shù)P的計(jì)算表達(dá)式為：

P=0.559 F1+0.272 F2+0.168 F3 （7）

低溫處理綜合指標(biāo)P得分越高，表示尼泊爾黃花木在低溫脅迫下的整體表現(xiàn)越活躍，同時(shí)其抗寒性越強(qiáng)。由表7可知，-12 ℃時(shí)引種尼泊爾黃花木P值最大，其次為-8 ℃，表明引種尼泊爾黃花木在-12 ℃時(shí)抗寒性最強(qiáng)，與前述隸屬函數(shù)分析結(jié)果相符。

3" 結(jié)論

在低溫脅迫下，引種尼泊爾黃花木的9個(gè)生理指標(biāo)均發(fā)生了顯著變化。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MDA含量與大多生理指標(biāo)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了其在抗寒性評(píng)估中的重要參考價(jià)值。SOD、POD活性和Pro、SS含量之間的正相關(guān)關(guān)系則揭示了這些生理指標(biāo)在協(xié)同增強(qiáng)植物抗寒能力方面的重要作用。綜合多個(gè)生理指標(biāo)的變化，采用隸屬函數(shù)法和主成分分析法對(duì)尼泊爾黃花木的抗寒性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，在-12 ℃時(shí)，尼泊爾黃花木的抗寒能力達(dá)到最佳狀態(tài)。引種地極端低溫-12 ℃，“倒春寒”持續(xù)期間最低溫度-8 ℃，尼泊爾黃花木幼苗在6個(gè)低溫處理梯度下表現(xiàn)出較快的響應(yīng)能力和較好的抗寒能力，表明其可適應(yīng)引種地極端低溫和“倒春寒”溫度的變化。

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（責(zé)任編輯：易" 婧）

作者簡(jiǎn)介：王甲喜（1994—），碩士，主要從事森林培育研究。E-mail：851503505@qq.com。

*為通信作者，E-mail：1837426844@qq.com。