摘要：目的利用同源重組技術(shù)構(gòu)建肺炎克雷伯菌NTUH-K2044株鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)modA基因缺失株和回補(bǔ)株，探討modA基因?qū)Ψ窝卓死撞鷧捬跸跛猁}呼吸生長及表型的影響。方法利用自殺載體pKO3-Km質(zhì)粒構(gòu)建modA基因缺失株，同時(shí)擴(kuò)增包含modA基因啟動(dòng)子、開放閱讀框（ORF）和終止子區(qū)域的整條序列片段，將其克隆至pGEM-T-easy質(zhì)粒中獲得重組質(zhì)粒modApGEM-T-easy，電轉(zhuǎn)化至modA缺失株中得到回補(bǔ)株C-modA，通過體外厭氧硝酸鹽呼吸生長測定、競爭力指數(shù)實(shí)驗(yàn)、生物膜結(jié)晶紫定量實(shí)驗(yàn)、黏度定量實(shí)驗(yàn)以及菌株形態(tài)Image J測量法比較分析NTUH-K2044野生株、modA基因缺失株、回補(bǔ)株的厭氧硝酸鹽呼吸生長、細(xì)菌競爭力、生物膜合成能力及超黏表型、菌株形態(tài)改變。結(jié)果利用自殺載體pKO3-Km質(zhì)粒成功構(gòu)建肺炎克雷伯菌modA基因缺失株ΔmodA；隨后將重組質(zhì)粒modA-pGEM-T-easy電轉(zhuǎn)化入ΔmodA中，得到回補(bǔ)株C-modA；相較于肺炎克雷伯菌野生株（WT）、C-modA，modA基因缺失株厭氧硝酸鹽呼吸生長受抑制；ΔmodA相對野生株WT的體外厭氧培養(yǎng)競爭力明顯減弱（Plt;0.05）；ΔmodA厭氧生長生物膜合成減少，與WT、C-modA差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；modA基因缺失株厭氧條件下黏液表型明顯被削弱，相對WT、C-modA差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；厭氧條件下ΔmodA菌體形態(tài)由正常的短桿狀變?yōu)榍蛐?，與WT、C-modA長度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.0001）。結(jié)論鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)編碼基因modA與肺炎克雷伯菌的厭氧硝酸鹽呼吸、細(xì)菌體外競爭力、生物膜形成、超黏表型以及菌體形態(tài)變化等致病力因素相關(guān)。

關(guān)鍵詞：肺炎克雷伯菌；ModA蛋白；厭氧生長；菌體形態(tài)

肺炎克雷伯菌作為臨床上繼大腸埃希菌后的主要條件致病菌，可引起多部位的感染，包括尿路感染、菌血癥、肺炎、肝膿腫和腦膜炎等，尤其是K1、K2血清型，目前已成為臨床細(xì)菌性肝膿腫的主要致病菌，其日益嚴(yán)峻的耐藥形勢也令人堪憂［1-3］。腸桿菌科兼性厭氧菌在人體腸道炎性環(huán)境中主要通過攫取一系列電子受體如硝酸鹽（NO3-）、亞硝酸鹽（NO2-）等進(jìn)行厭氧呼吸而擴(kuò)張，從而增加異位感染的易感性，而鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體ModABC可能在其中發(fā)揮了重要作用［4， 5］。有研究顯示，大腸埃希菌進(jìn)行厭氧硝酸鹽呼吸的關(guān)鍵酶是硝酸還原酶，而硝酸還原酶的活性中心為含有鉬（Mo）的鉬輔因子MoCo，Mo 的轉(zhuǎn)運(yùn)則離不開鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ModABC［6-8］。通過對高毒力肺炎克雷伯菌NTUHK2044（K1血清型超黏表型）［9］全基因組分析，發(fā)現(xiàn)該菌株中也存在著完整的MoCo合成途徑以及多達(dá)9個(gè)硝酸還原酶編碼基因。課題組前期蛋白質(zhì)譜研究數(shù)據(jù)顯示，編碼肺炎克雷伯菌毒力控制因子CRP的基因被敲除后，細(xì)菌蛋白ModA的表達(dá)量出現(xiàn)明顯下降［10］。CRP作為全局調(diào)控因子，其對肺炎克雷伯菌的菌毛、生物膜形成、體外生長和致病發(fā)揮著重要作用［11］。Liu等［10］研究也顯示在易感條件下，cAMP-CRP能夠通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)以改變細(xì)菌的形態(tài)，而這對增強(qiáng)細(xì)菌致病力有重要意義。那ModABC系統(tǒng)對肺炎克雷伯菌體外厭氧生長及毒力又會(huì)有怎樣的影響？本研究通過同源重組敲除肺炎克雷伯菌鉬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)modA基因［12］，分析該基因?qū)Ψ窝卓死撞鶱TUH-K2044厭氧硝酸鹽呼吸和生物膜、超黏表型等毒力因素形成的作用，及在此過程中與菌體形態(tài)改變這一致病因素的關(guān)系。本研究將有助于為臨床治療耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌感染提供新思路。