【摘要】目的 探究循環(huán)血Septin9基因甲基化檢測結果對結直腸癌篩查的價值，為臨床篩查結直腸癌提供參考依據(jù)。方法 回顧性分析2022年1月至2024年2月江蘇省人民醫(yī)院宿遷醫(yī)院收治的68例結直腸癌患者的臨床資料，作為觀察組，同時回顧性分析同期在江蘇省人民醫(yī)院宿遷醫(yī)院接受相關診療的67例非腫瘤的良性肛腸科疾病患者的臨床資料，作為對照組。兩組患者均進行血清糖類抗原199（CA199）、糖類抗原724（CA724）、癌胚抗原（CEA）、外周血Septin9基因甲基化檢測。比較兩組患者血清CA199、CA724、CEA水平，外周血Septin9基因甲基化的檢測結果；分析觀察組Septin9基因甲基化檢測結果與TNM分期的關系；以病理診斷結果為金標準，比較CA199、CA724、CEA水平及Septin9基因甲基化對結直腸癌的診斷價值。結果 觀察組患者的血清CA199、CA724、CEA水平均高于對照組（均P<0.05）；對照組共檢出3例Septin9基因甲基化陽性（肛瘺、混合痔、肛裂中各檢出1例），陽性檢出率為4.48%（3/67）；觀察組共檢出59例Septin9基因甲基化陽性，陽性檢出率86.76%（59/68），相較于對照組，觀察組患者的陽性檢出率更高（P<0.05）。隨著結直腸癌患者TNM分期的升高，Septin9基因甲基化陽性檢出率也會隨之升高；Septin9基因甲基化對結直腸癌的診斷靈敏度、特異度、準確度均高于CA199、CA724、CEA，且CEA的靈敏度、準確度均高于CA199、CA724（均P<0.05）。結論 循環(huán)血Septin9基因甲基化檢測能夠評估結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，且其診斷價值高于CA199、CA724、CEA，可用于結直腸癌的篩查中。

【關鍵詞】直腸癌 ; 循環(huán)血Septin9基因甲基化 ; 癌胚抗原 ; 糖類抗原724 ; 糖類抗原199

【中圖分類號】R735.3 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.19.0107.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.19.035

結直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，早期診斷結直腸癌可顯著改善患者預后。電子結腸鏡是目前臨床檢測結直腸癌的金標準，但其具有侵入性，易造成腸穿孔、腸道感染等并發(fā)癥，有些患者難以接受，在初篩階段難以推廣[1]。腫瘤標志物糖類抗原199（CA199）、糖類抗原724（CA724）、癌胚抗原（CEA）是臨床篩查結直腸癌患者時較為常用的腫瘤標志分子，在結直腸癌的診斷中具有一定的診斷價值，但其診斷靈敏度和特異度較差，因此，無法滿足針對早期結直腸癌篩查的需求[2]。Septin9基因在人體真核細胞內廣泛分布，參與細胞膜二次建構、細胞分裂及細胞極化等生物學過程，Septin9基因編碼的Septin9蛋白能調節(jié)細胞生長，防止細胞分裂過快或不受控制的分裂增殖，具有一定的抑癌作用[3]。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾方式，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著關鍵角色。有研究表明，Septin9基因甲基化可導致抑癌活性喪失，促進結直腸病變向惡性進展，且部分腫瘤細胞出現(xiàn)壞死或凋亡，可代謝進入循環(huán)外周血，因此可將循環(huán)血Septin9基因甲基化檢測應用于結直腸癌的臨床篩查中[4]。基于此，本研究主要對循環(huán)血Septin9基因甲基化檢測結果在結直腸癌篩查中的診斷價值進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2022年1月至2024年2月江蘇省人民醫(yī)院宿遷醫(yī)院收治的68例結直腸癌患者的臨床資料，作為觀察組，同時回顧性分析同期在江蘇省人民醫(yī)院宿遷醫(yī)院接受相關診療的67例非腫瘤的良性肛腸科疾病患者的臨床資料，作為對照組。對照組患者中男性35例，女性32例；年齡53～69歲，平均（58.67±4.07）歲；21例為肛裂，29例為混合痔，17例為肛瘺。觀察組患者中男性為36例，女性32例；年齡54～70歲，平均（59.38±5.14）歲；TNM腫瘤分期[5]情況：7例為Ⅰ期，27例為Ⅱ期，28例為Ⅲ期，6例為Ⅳ期。兩組患者性別、年齡一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），組間可比。納入標準：⑴觀察組患者符合《中國結直腸癌診療規(guī)范（2020年版）》 [6]中結直腸癌的診斷標準；⑵對照組患者符合《肛裂臨床診治中國專家共識（2021版）》 [7]中肛裂或《中國痔病診療指南（2020）》 [8]中混合痔或《肛瘺的診治專家共識（2020版）》 [9]中肛瘺的診斷標準；⑶患者臨床資料完整。排除標準：⑴有大型腹部手術治療既往史；⑵合并其他惡性腫瘤疾病；⑶未行化療或者放療。江蘇省人民醫(yī)院宿遷醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準本研究。

1.2 檢測方法 醫(yī)護人員應當囑咐所有入組者以晨起空腹狀態(tài)接受血液采集，同時要求其在采集血液前24 h內不可飲酒，在72 h內不可攝入蛋白含量過高的食物、辛辣食物及油膩食物。血液樣本采集前，采血人員清洗雙手，晾干后佩戴無菌手套，分別使用真空管和抗凝管采集患者空腹靜脈血各5 mL。⑴腫瘤標志物檢測：真空采血管以1 500 r/min，離心12 min，將上層清液轉移至 -80 ℃冰箱保存待測，采用電化學發(fā)光法檢測血清CA199、CA724及CEA水平。⑵Septin9 基因甲基化檢測：抗凝管室溫（18～26 ℃）下放置約30 min，待血液凝固、血塊收縮后，3 000 r/min的轉速離心10 min，分離血漿至離心管中；并標記樣本編號、姓名、采血時間、住院號，將合格的樣本保存在-80 ℃冰箱，避免反復凍融。具體檢驗操作如下：①溶液的制備：使用無菌具有刻度100 mL的量筒，分別加60、40 mL無水乙醇到60 mL洗液A濃縮液和7 mL洗液B濃縮液中，顛倒混勻5次，并標記稀釋時間及簽名；②融化樣本：溶液樣本應在60 min內完全融化，并在開始融化60 min內進入裂解程序，將3.5 mL血漿樣本加入事先標記的15 mL離心管；③裂解：15 mL離心管中加入3.5 mL裂解吸附液，蓋好管蓋、震蕩混勻，室溫孵育10 min；④DNA結合：15 mL離心管中加入90 mL磁珠（新鮮懸?。┻M行DNA結合；⑤加入洗液進行DNA洗滌；⑥渦旋混勻洗脫液進行DNA洗脫；⑦依次加入亞硫酸鹽和保護液置于80 ℃恒溫孵育來進行亞硫酸鹽轉化的DNA進行洗滌、干燥和洗脫；⑧聚合酶鏈式反應（PCR）：將經亞硫酸鹽轉化的DNA（Bis-DNA）和PCR預反應液渦旋混合加入PCR板對應的孔中，用膠膜密封，進行PCR反應：階段一為活化，溫度設置為94 ℃，時間持續(xù)20 min。階段二為

45個循環(huán)，溫度設置為62 ℃，時間持續(xù)5 s；溫度設置為55.5 ℃，時間持續(xù)35 s；溫度設置為93 ℃，時間持續(xù)30 s；階段三為降溫，溫度設置為40 ℃，時間持續(xù)5 s。Septin9基因甲基化檢測所使用試劑盒為人Septin9基因甲基化檢測試劑盒[博爾誠（北京）科技有限公司]。⑨結果判讀。根據(jù)待測樣本在PCR儀器上測得的Septin9和ACTB的Ct結果進行判讀，Septin9的Ct≤41.0，ACTB的Ct≤32.1判定為陽性；Septin9無Ct或Ct>41.0，ACTB的Ct≤32.1判定為陰性；Septin9的Ct為任何情況，ACTB的Ct>32.1判定為無效[10]。

1.3 觀察指標 ⑴比較兩組患者血清CA199、CA724、CEA水平。⑵比較兩組患者Septin9基因甲基化的檢測結果，觀察組Septin9基因甲基化檢測結果與TNM分期的關系。⑶以病理診斷結果為金標準，比較CA199、CA724、CEA水平及Septin9基因甲基化結果診斷結直腸癌的診斷價值，其中靈敏度=[真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)]×100%，特異性=[真陰性例數(shù)/（假陽性+真陰性）例數(shù)]×100%，準確度=[（真陽性+真陰性）例數(shù)/總例數(shù)]×100%。腫瘤標志物陽性值：CEA>5.0 ng/mL；CA724 >10 ng/mL；CA199>37 U/mL [11]。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以[例（%）]表示，兩組間比較采用χ2檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗，多組間計數(shù)資料比較采用χ2趨勢檢驗；計量資料首先采用S-W法檢驗符合正態(tài)分布，以（ x ±s）表示，兩組間比較采取獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者CA199、CA724、CEA水平比較 觀察組患者的血清CA199、CA724、CEA水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見表1。

2.2 兩組患者Septin9基因甲基化檢測結果比較 對照組共檢出3例Septin9基因甲基化陽性（肛瘺、混合痔、肛裂中各檢出1例），陽性檢出率為4.48%（3/67）；觀察組共檢出59例Septin9基因甲基化陽性，陽性檢出率86.76%（59/68）。相較于對照組，觀察組Septin9基因甲基化陽性檢出率更高（χ2=92.017，P<0.05）。隨著結直腸患者TNM分期的升高，Septin9基因甲基化陽性檢出率也會隨之升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 CA199、CA724、CEA及Septin9基因甲基化對結直腸癌的診斷價值 Septin9基因甲基化對結直腸癌的診斷靈敏度、特異度、準確度均高于CA199、CA724、CEA，且CEA的靈敏度、準確度均高于CA199、CA724，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見表3、表4。

3 討論

結直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，早期癥狀不明顯，隨著腫瘤的增大而表現(xiàn)排便習慣改變、便血、腹瀉、局部腹痛等癥狀。根治性腫瘤切除手術是目前結直腸癌治療的主要手段，早期發(fā)現(xiàn)及早期治療可以顯著提高患者的生存率并能提高患者生活質量，但是晚期結直腸癌的復發(fā)轉移仍嚴重影響術后患者的預后[12]。篩查和早期規(guī)范化診斷及治療是改善結直腸癌患者預后的關鍵所在?，F(xiàn)階段，臨床診斷結直腸癌的金標準即電子結腸鏡，但由于該檢查方法屬于侵入性檢查，鏡檢過程中患者會感到痛苦，且存在一定的并發(fā)癥風險，因此一些患者難以接受，同時該方法在一些經濟發(fā)展水平較為落后的地區(qū)具有較大的推廣難度。

血清中包含有大量的無形成分，如碳水化合物、生長因子、激素、無機物、人體代謝產物等，其所包含的各種化學成分比例相對固定，當出現(xiàn)異常波動時往往預示著生理與病理改變。CEA是一種具有人類胚胎抗原特異性的單體糖蛋白，在結直腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中檢測水平較高，在正常組織中檢測水平較低，雖然其對結直腸癌不具備特異性，但可作為篩查結直腸癌的重要參考指標；血清CA199為胃腸道相關抗原，常用于結直腸癌篩查中，并且在其他消化道腫瘤組織中的表達也明顯升高；CA724屬于一種非特異性腫瘤標志物，在成人的正常組織中不表達，在結直腸癌、胃癌及胰腺癌等實體瘤中均有表達，因而常用于結直腸癌的檢測中[13]。而非腫瘤的良性肛腸科疾病患者伴隨有腸道黏膜的損傷或炎癥時，CA199、CA724、CEA水平也會存在一定的升高，但并不一定意味著惡性腫瘤的存在，應結合患者的臨床表現(xiàn)和其他檢查結果進行綜合評估[14]。本研究中，觀察組患者的血清CA199、CA724、CEA水平均高于對照組，這表明結直腸癌患者體內CA199、CA724、CEA水平高于良性肛腸科疾病患者，可用于篩查結直腸癌。

近年來，分子標志物檢查在結直腸癌中也逐漸發(fā)展起來，DNA是最常見的分子標志物之一，DNA甲基化的改變是癌癥中最早的表觀遺傳學變化之一，可以控制基因表達，與腫瘤的發(fā)生密切相關。DNA的甲基化指在不改變DNA序列的前提下，使基因的表型也發(fā)生可遺傳的變化，同時調控DNA的重組及特定基因的轉錄活性，使目的基因啟動子區(qū)域的甲基化并直接導致相關基因的表達沉默，使該基因轉錄、翻譯特定蛋白的能力下降，進而使細胞的功能發(fā)生改變。人類基因組中的Septin基因中共有亞型

13種，而本研究所涉及的Septin9基因，其主要處于17號染色體q25.3上。在Septin9基因編碼中，含有一種Septin9蛋白，其能夠對細胞生長發(fā)揮一定調節(jié)作用，避免由于細胞分裂速度過快而導致細胞分裂增殖失去控制，因此Septin9蛋白具有一定抑癌效果[15]。腫瘤抑癌基因的甲基化調控被認為是腫瘤起始過程中的關鍵步驟，因為DNA甲基化沉默許多腫瘤抑癌基因的轉錄，從而導致腫瘤細胞的永生化生長；同時，DNA甲基化的狀態(tài)也隨著腫瘤惡性程度的增加而表現(xiàn)明顯。Septin9是一組支架蛋白，在細胞分裂過程中提供結構支持，其啟動子區(qū)域高甲基化伴隨轉錄受損時將導致抑癌活性喪失，促進結直腸病變向惡性進展。因此，外周循環(huán)血Septin9基因甲基化檢測逐漸被認為是結直腸癌患者特異性的腫瘤標志物，也是一種無創(chuàng)、簡便、易行的篩查和早期診斷指標[16]。本研究結果中，相較于對照組，觀察組患者的陽性檢出率更高，且隨著結直腸癌患者TNM分期的升高，Septin9基因甲基化陽性檢出率也會隨之升高，這表明結直腸癌患者循環(huán)血Septin9基因甲基化水平高于良性肛腸科疾病患者，循環(huán)血Septin9基因甲基化檢測能夠評估腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，為患者疾病情況的動態(tài)化監(jiān)測提供有效途徑。

此外，本研究結果顯示，Septin9基因甲基化對結直腸癌診斷的靈敏度、特異度、準確度均高于CA199、CA724、CEA，且CEA的靈敏度、準確度均高于CA199、CA724，這提示對結直腸癌患者應用外周循環(huán)血Septin9基因甲基化檢測的診斷價值高于腫瘤標志物。分析其原因在于，CEA、CA199、CA724等腫瘤標志物通常在腫瘤中晚期才顯著升高，靈敏度相對較低，且在其他惡性腫瘤中升高，還容易受到其他因素（如炎癥、良性病變等）的干擾，特異性相對較低；而Septin9基因甲基化檢測在結直腸癌的早期階段即可以檢測出來，具有較高的靈敏度，作為結直腸癌的一個特異性標志物，其檢測的特異性相對較高，有助于減少誤診和漏診的情況[17]。CEA診斷價值高于CA199、CA724的原因分析在于，CEA與多種腫瘤相關，使得CEA在多種腫瘤類型中的陽性率相對較高，且CEA在腫瘤組織中的表達更為普遍或穩(wěn)定，從而更容易被檢測

出來[18]。

綜上，循環(huán)血Septin9基因甲基化檢測能夠評估腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且其診斷價值高于CA199、CA724、CEA，可用于結直腸癌的篩查中，有利于結直腸癌的診斷和治療。

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