摘要：目的 研究黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊（HZC）調(diào)節(jié)mPGES-1干預(yù)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法 隨機(jī)選取24只SD大鼠并分為正常組、模型組、HZC組、甲氨蝶呤（methotrexate， MTX）組，造模成功后對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃給藥，除正常組外，其余三組采用牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑混合乳化劑構(gòu)建膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis， CIA）模型，大鼠分別給予生理鹽水、MTX和HZC灌胃，共給藥21 d。比較各組足腫脹、脾指數(shù)、微粒體前列腺素E2合酶-1（microsomal prostaglandin E synthase 1， mPGES-1）的表達(dá)情況。結(jié)果 與正常組大鼠比較，模型組大鼠足腫脹程度明顯且伴隨著關(guān)節(jié)變形腫大，HZC組和MTX組大鼠未見(jiàn)明顯足腫脹和關(guān)節(jié)變形。模型組給藥第14、21天足腫脹厚度高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而HZC組和MTX組給藥后第14、21天足腫脹厚度低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組脾指數(shù)高于正常組、HZC組、MTX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織mPGES-1蛋白表達(dá)上升（P<0.05），而與模型組比較，HZC組和MTX組mPGES-1蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 HZC能通過(guò)干預(yù)mPGES-1的表達(dá)情況而改善CIA大鼠的炎癥反應(yīng)，起到治療作用。

關(guān)鍵詞：黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊;膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎;mPGES-1

中圖分類(lèi)號(hào)：R593 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.20.009

文章編號(hào)：1006-1959（2024）20-0057-05

Study on the Effect of Heiguteng Zhuifeng Huoluo Capsule in Regulating mPGES-1to Improve Collagen-induced Arthritis

LUO Jinfang1，2，HE Ji2，3，LE Lan3，HE Kang3，HUANG Yongqi1，2，YAO Xueming4，HUANG Cong1，2，4

[1.Department of Pharmacology，School of Basic Medicine，Guizhou Universityof Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，Guizhou，China;

2.Key Laboratory on the Property&Effect of Chinese Medicine （Ethnic Medicine），Guiyang 550025，Guizhou，China;

3.College of Pharmacy，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，Guizhou，China;

4.Department of Rheumatism and Immunology，the Second Affiliated Hospital of Guizhou Universityof Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，Guizhou，China]

Abstract：Objective To study the mechanisms of Heiguteng Zhuifeng Huoluo cupsule （HZC） on collagen-induced arthritis （CIA） rats by regulating mPGES-1.Methods A total of 24 SD rats were randomly selected and divided into normal group， model group， HZC group and methotrexate （MTX） group. After the model was successfully established， the rats were given intragastric administration. Except for normal group， collagen-induced arthritis（CIA） model were constructed with bovine type Ⅱ collagen and complete Freund's adjuvant mixed emulsifier. Rats were given normal saline， MTX and HZC by gavage for 21 days. The foot swelling， spleen index and the expression of microsomal prostaglandin E synthase 1 （mPGES-1） in each group were compared.Results Compared with the normal group， the degree of foot swelling in the model group was obvious and accompanied by joint deformation and swelling， while there was no obvious foot swelling and joint deformation in the HZC group and MTX group. The thickness of foot swelling in the model group was higher than that in the normal group on the 14th and 21st days after administration， and the difference was statistically significant （P<0.05）， while the thickness of foot swelling in the HZC group and MTX group was lower than that in the model group on the 14th and 21st days after administration， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The spleen index of the model group was higher than that of the normal group， the HZC group and the MTX group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the normal group， the expression of mPGES-1 protein in synovial tissue of rats in the model group increased （P<0.05）， while compared with the model group， the expression of mPGES-1 protein in HZC group and MTX group decreased （P<0.05）.Conclusion HZC can significantly improve the inflammatory response of CIA rats by interfering with the expression of mPGES-1， and play a therapeutic role.

Key words：Heiguteng Zhuifeng Huoluo capsule;Collagen-induced arthritis;mPGES-1

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以慢性關(guān)節(jié)炎和病理性血管增生為主要病理特征的自身免疫病，可發(fā)生于任何年齡段[1，2]。目前，臨床上治療RA藥物有糖皮質(zhì)激素、抗風(fēng)濕藥、非甾體抗炎藥、生物制劑和植物藥等，以及特定靶標(biāo)治療，即共刺激調(diào)節(jié)劑或靶向合成藥如JAK抑制劑，其多著眼于調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫，但存在價(jià)格高昂、不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)[5，6]。且大多數(shù)藥物治療目標(biāo)都是緩解癥狀或盡量達(dá)到低級(jí)疾病活動(dòng)度[7]，但藥物副作用大[8]。RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，古代醫(yī)家根據(jù)病情特點(diǎn)，有“鼓槌風(fēng)”“鶴膝風(fēng)”“骨痹”等描述[9]?！督饏T要略·中風(fēng)歷節(jié)病》篇指出：“寸口脈沉而弱，沉即主骨，弱即主筋，沉即為腎，弱即為肝……”肝腎虧損、氣血虧虛，易造成外邪侵襲，這是歷節(jié)病發(fā)生的內(nèi)在因素[10];《黃帝內(nèi)經(jīng)》中指出“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”;《素問(wèn)·舉痛論》：“寒氣客于脈外則脈寒，脈寒則蜷縮，蜷縮則脈絀急，絀急則外引小絡(luò)，故猝然而痛”[11]。黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊（Heiguteng Zhuifeng Huoluo capsule， HZC）主要成分為黑骨藤、青風(fēng)藤、追風(fēng)傘，其中黑骨藤作為君藥，為蘿藦科杠柳屬植物黑龍骨的干燥根或全株，又名“黑骨頭、黑龍骨、柳葉過(guò)山龍、飛仙藤”，苦、辛，性溫，有小毒，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、跌打損傷等，與結(jié)石草、銀杏稱(chēng)為苗藥三珍寶，是目前發(fā)現(xiàn)的草藤科類(lèi)治療風(fēng)濕類(lèi)疾病的有效藥物[12]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[13]，黑骨藤富含皂苷、揮發(fā)油等有機(jī)物，故有抗炎、鎮(zhèn)痛等功效。而黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊的功效為活血通絡(luò)、祛風(fēng)除濕[14]，但該膠囊是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)mPGES-1蛋白改善RA疾病狀態(tài)尚不完全清楚。本研究以膠原誘導(dǎo)大鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型為研究對(duì)象，基于mPGES-1蛋白初步研究HZC對(duì)RA的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，體重160～180 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008]。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，經(jīng)過(guò)貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2主要藥物與試劑 本研究所用藥物與試劑見(jiàn)表1。

1.3主要儀器 電子天平（上海然浩電子有限公司，型號(hào)：JCS-51001C），高壓滅菌鍋（美國(guó)ZEALWAY，型號(hào)：GI54T）、游標(biāo)卡尺（武漢芯泰科技有限公司，型號(hào)：JS119F150）、高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司，型號(hào)：Sorvall Legend Micro 21R）、超靈敏多功能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光機(jī)（美國(guó)Bio-Rad，型號(hào)：ChemiDocTM）、酶標(biāo)儀（北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司，型號(hào)：Infinite M200）、電泳儀（北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，型號(hào)：HT-Zy02）、正置白光拍照顯微鏡（Nikon，型號(hào)：Eclipse Ci-L）、切片機(jī)（德國(guó)feica，型號(hào)：RM2265）。

1.4分組、造模及給藥方法 將24只大鼠隨機(jī)分為4個(gè)組：正常組、模型組、MTX組、HZC組，每組6只。除正常組外，其余組均構(gòu)建膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型（采用二次免疫法）。膠原的配置：往研缽（滅菌處理后）中加入弗氏佐劑2.5 ml，邊研磨邊緩慢加入同體積的牛Ⅱ型膠原，使混合物充分乳化，研至滴入水中呈圓形不散（進(jìn)行冰浴操作），膠原即配置完成。除正常組在其尾根部注射0.1 ml生理鹽水外，其余的大鼠均在尾根部注射0.1 ml充分乳化好的弗氏佐劑和牛Ⅱ型膠原混合物。第1次免疫反應(yīng)結(jié)束后第7天進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫反應(yīng)并標(biāo)記，并稱(chēng)重。第2次免疫后，次日開(kāi)始給藥，給藥方法：HZC組根據(jù)體重按照1 ml/0.1 kg（243 mg/kg）進(jìn)行灌胃給藥，1次/d，正常組與模型組用生理鹽水進(jìn)行灌胃治療，給藥組用黑骨藤追風(fēng)活絡(luò)膠囊配置的藥液灌胃，HZC給藥量按照人服用量折算成大鼠給藥劑量，MTX組用MTX灌胃給藥，劑量為1 mg/kg，各組均連續(xù)給藥21 d。

1.5足趾部腫脹測(cè)量 在大鼠造模后用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠后足足趾的腫脹數(shù)值，分別于給藥前、給藥后第7、14、21天對(duì)關(guān)節(jié)腫脹程度進(jìn)行記錄，共4次。

1.6脾指數(shù)測(cè)量 在給藥結(jié)束后，麻醉大鼠，取其血液，處死大鼠，開(kāi)腹解剖取大鼠脾臟，分別在分析天平上進(jìn)行稱(chēng)重，并記錄，裝入EP管中，在零下20 ℃下保存。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）。

1.7 Western Blot法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織mPGES-1蛋白的表達(dá) 取大鼠滑膜組織加入液氮搗碎后，再加入RIPA裂解液，待裂解完成后以14 000 rpm/min離心15 min，取上清液進(jìn)行蛋白定量后加入蛋白上樣緩沖液煮沸，并于-20 ℃保存。后期按照表2中Western blot詳細(xì)步驟檢測(cè)mPGES-1蛋白表達(dá)。最后用ImageJ軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)資料服從正態(tài)分布用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，若為方差齊的組間比較，則用LSD法;若為方差不齊的組間比較，則用Tamhane檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 HZC對(duì)CIA大鼠足腫脹度的影響 與正常組大鼠比較，模型組大鼠足腫脹程度明顯且伴隨著關(guān)節(jié)變形腫大，HZC組和MTX組大鼠未見(jiàn)明顯足腫脹和關(guān)節(jié)變形，見(jiàn)圖1。模型組給藥后第14、21天足腫脹厚度高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而HZC組和MTX組給藥后第14、21天足腫脹厚度低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

2.2 HZC對(duì)CIA大鼠脾指數(shù)的影響 模型組脾指數(shù)高于正常組、HZC組、MTX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表4。

2.3 Western blot測(cè)量大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織mPGESE-1蛋白表達(dá) 與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織mPGES-1蛋白表達(dá)上升（P<0.05）;與模型組比較，HZC組和MTX組mPGES-1蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05），見(jiàn)圖2。

3討論

本實(shí)驗(yàn)采用的是牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)CIA大鼠模型，其各項(xiàng)特征與人類(lèi)RA非常相似，因此是篩選和研究治療RA藥物的理想動(dòng)物模型。RA是一種嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的慢性炎癥性自身免疫性疾病，也是結(jié)締組織中炎性關(guān)節(jié)損害最常見(jiàn)的疾病之一[15]。臨床研究中，甲氨蝶呤（MTX）對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者具有肯定的治療作用[16]，故本試驗(yàn)選取MTX作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。大鼠造膜成功后，大鼠足趾腫脹，足墊增厚變腫脹;HZC組和MTX組足腫脹得到減輕，這初步證明了HZC對(duì)RA具有一定的抗炎和治療作用。脾臟是機(jī)體的免疫器官[17]，脾臟指數(shù)可以反映動(dòng)物機(jī)體免疫功能，目前已被廣泛用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫狀態(tài)。該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HZC對(duì)大鼠的脾指數(shù)有影響作用，與模型組比較，其可改善脾指數(shù)，表明HZC對(duì)CIA大鼠有一定保護(hù)作用。

mPGES-1是3種前列腺素E2合酶之一，能被致炎因子誘導(dǎo)而大量表達(dá)，在多種炎癥疾病中，如關(guān)節(jié)炎的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在炎癥中，mPGES-1是催化PGE2生物合成的終端酶，目前有研究認(rèn)為抑制mPGES-1是控制RA的重要手段之一[18-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明，HZC能有效降低RA大鼠滑膜組織mPGES-1蛋白表達(dá)，提示HZC可能通過(guò)抑制mPGES-1蛋白的高表達(dá)以減輕CIA大鼠足腫脹炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮抗RA的作用。

綜上所述，HZC對(duì)RA大鼠滑膜組織中高表達(dá)的蛋白具有明顯抑制作用。

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編輯/杜帆

基金項(xiàng)目：1.貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題（編號(hào)：QZYY-2021-012）;2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家與省級(jí)科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)培育項(xiàng)目（編號(hào)：貴中醫(yī)TD合字[2022]004號(hào)）;3.貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：黔科合基礎(chǔ)-ZK[2022]一般477;黔科合基礎(chǔ)-ZK [2021]一般537）

作者簡(jiǎn)介：羅進(jìn)芳（1989.10-），女，貴州黔西人，博士，講師，主要從事中藥抗炎免疫藥理研究

通訊作者：黃聰（1982.8-），男，貴州盤(pán)州人，博士，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事中藥抗炎免疫藥理研究