關(guān)鍵詞：非靶向代謝組學；鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）；菜心；不同組織；代謝產(chǎn)物

鄰苯二甲酸酯（Phthalic acid esters，PAEs）被廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，并大量進入環(huán)境。尤其PAEs作為增塑劑在塑料制品中含量高達60%，而農(nóng)田塑料薄膜（地膜、塑料大棚）的廣泛使用導致我國農(nóng)田土壤和農(nóng)作物PAEs污染問題日益突出。鄰苯二甲酸二丁酯（di-n-butyl phthalate. DBP）是PAEs中最常見的一種，其在農(nóng)業(yè)土壤中的檢出量可高達57.7mg·kg-1，顯著高于PAEs中的其他種類。DBP是一類典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有三致效應(yīng)和雌激素效應(yīng)，可危害人體健康和生態(tài)環(huán)境，被美國和我國列為優(yōu)先控制的環(huán)境污染物。DBP屬于疏水性、較難被降解的污染物，容易在土壤中富集，易被蔬菜等農(nóng)作物吸收累積，日常食用含DBP的蔬菜會導致長期低劑量暴露，極大增加人體DBP暴露風險。研究表明，我國大齡兒童DBP的攝人量是歐洲的17倍，攝人量高的主要原因來自對設(shè)施蔬菜的消費。面對農(nóng)田土壤一作物系統(tǒng)DBP污染的嚴峻形勢，為降低農(nóng)作物DBP的吸收累積，探索DBP對農(nóng)作物代謝及品質(zhì)影響的信號調(diào)控機制，對于保障農(nóng)產(chǎn)品安全和人體健康具有重要的科學和現(xiàn)實意義。

代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學后，新發(fā)展起來的“組學”，其主要研究對象是作為代謝路徑底物和產(chǎn)物的小分子代謝物（分子量lt;1000）。通過對植物代謝組學的研究，不僅可以了解植物生理狀態(tài)在代謝水平的反映，還可以分析代謝物的變化及積累模式，從整體上認識代謝物及其調(diào)控，為解析植物發(fā)育及其應(yīng)對逆境脅迫的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。按照研究目的，代謝組學可分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學。其中非靶向代謝組學是無偏向性地分析樣品中盡可能廣泛的代謝產(chǎn)物，有利于發(fā)現(xiàn)新的代謝通路，目前已廣泛應(yīng)用于生物學、臨床醫(yī)學、藥學、食品等生命科學領(lǐng)域。Wang等利用非靶向代謝組學揭示了鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯脅迫對紫花苜蓿（Medi-cagosativa）根系分泌物的影響。羅慶等利用非靶向代謝組學方法對鎘、鉛脅迫下東南景天根系分泌物進行研究，發(fā)現(xiàn)了對東南景天耐受或富集重金屬起主要作用的關(guān)鍵根系分泌物質(zhì)及關(guān)鍵通路。

本研究為揭示DBP對農(nóng)產(chǎn)品代謝及品質(zhì)影響的信號調(diào)控機制，采用非靶向代謝組學方法研究DBP脅迫下菜心不同組織代謝產(chǎn)物的變化?；谥鞒煞址治觯≒CA）、偏最小二乘判別分析（PIS-DA）等多元統(tǒng)計分析方法，分析菜心不同組織代謝產(chǎn)物的差異及其關(guān)鍵通路，以期為后續(xù)開發(fā)關(guān)鍵通路上的靶向化學調(diào)控劑提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1水培實驗

在恒溫（25.0±0.5）℃和相對濕度60%±2%的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)菜心幼苗。在前人工作的基礎(chǔ)上，制備了改良的8692營養(yǎng)液。生長18d后，選擇3株體積相近的幼苗，在50mL玻璃離心管中分別暴露于DBP（對照，CK）、10、100mg·L-13d?；谟酌绲南鄬ιL抑制率分別達到0、20%和75%時推導得出3種不同的有效濃度（EC0、EC20和EC75），再根據(jù)以上3種不同的有效濃度確定DBP溶液的濃度。每個處理進行4個生物學重復。為最大限度地減少水的蒸發(fā)并防止藻類生長，離心管上覆蓋了鋁箔。

1.2代謝產(chǎn)物的收集與提取

取菜心不同組織的樣本200mg（+1%），放入2mL的EP管中。向管中準確加入0.6mL的-20℃的甲醇配制2-氯苯丙氨酸（4mg·L-1），使用渦旋振蕩器充分振蕩30s；添加100mg的玻璃珠，將EP管中的混合物放人組織研磨儀中，在60Hz下研磨90s；使用超聲波設(shè)備在室溫下處理樣品15min，在25℃和12000r·min-1的條件下離心10min，取上清液300uL過濾。過濾液通過0.22um膜過濾后，加入到檢測瓶中。通過液相色譜一質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)進行檢測。從每個待測樣本中取出20uL樣品混合，用于質(zhì)量控制以校正分析結(jié)果偏差和儀器誤差，剩余待測樣本進行LC-MS檢測。

1.3代謝產(chǎn)物的分析

采用高效液相色譜儀（Thermo Scientific Van-quish Core HPLC，賽默飛，美國），配備AcoUITYUPLC@ HSS T3 （2.1mmX150mm，1.8um）色譜柱，設(shè)置自動進樣器的溫度為8℃，流速為0.25mL·min-1，柱溫為40℃，進樣量為2uL，進行梯度洗脫。正離子模式的流動相為0.1%甲酸水（B1）和0.1%甲酸乙腈（A1）；負離子模式的流動相為5mmol·L-1甲酸銨水（B3）和乙腈（A3）。梯度洗脫程序：0～1min，2%的A1/A3： 1-9min. 2%-50%的A1/A3： 9-12min. 50%-98%的A1/A3; 12-13.5min. 98%的A1／A3; 13.5-14min，98%-2%的A1/A3；14-20min．2%的A1-正模式（其中，14-17min，2%的A3-負模式）。

使用質(zhì)譜儀（Thermo Scientific Q ExactivePlus，賽默飛，美國），采用電噴霧離子源和正負離子電離模式。正離子噴霧電壓設(shè)定為3.50kV，負離子噴霧電壓設(shè)定為2.50kV，鞘氣設(shè)定為9000mL．min-1，輔助氣設(shè)定為3000mL·min-1。毛細管溫度設(shè)置為325℃，在70000分辨率下進行全掃描，掃描范圍81～1000，二級裂解采用高能碰撞解離（HCD）技術(shù)，碰撞電壓設(shè)定為30eV，同時采用動態(tài)排除功能去除無關(guān)的MS/MS信息。

1.4數(shù)據(jù)分析

使用Proteowizard軟件（v3.0.8789）將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML格式（xcms輸入文件格式）。然后利用R（v3.3.2）中的XCMS程序包進行峰識別、峰過濾、峰對齊。此過程中的主要參數(shù)：bw=5，ppm=15，peak-width=c （5. 30）， mzwid=0.015， mzdiff=0.01. method=“centWave”。通過這些步驟得到包括質(zhì)核比、保留時間和峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣。為確保不同量級的數(shù)據(jù)可進行比較，對數(shù)據(jù)進行了峰面積的批次歸一化。

應(yīng)用PCA對樣品進行分類，在此過程中無外加的人為因素，因此可獲得代謝組數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)。同時采用PLS-DA區(qū)分各組間代謝的總體差異，進而篩選差異代謝產(chǎn)物。

采用聚類熱圖對富集在通路上的顯著差異代謝產(chǎn)物表達量進行分析。不同顏色的區(qū)域為不同的聚類分組信息，即具有相似代謝模式的代謝產(chǎn)物被聚合在一起。這種聚類可以提供關(guān)于代謝產(chǎn)物功能的推測，因為同一組內(nèi)的代謝產(chǎn)物可能具有相似的功能或參與相同的生物學過程。通過這種方式，我們可以推斷已知或未知代謝產(chǎn)物的生物學功能。利用差異代謝產(chǎn)物的KEGG（Kvoto Encyclopedia of Genes and Ge-nomes）進行通路富集分析，獲得代謝通路富集結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1菜心不同組織代謝產(chǎn)物的差異分析

2.1.1PCA

菜心不同組織代謝產(chǎn)物PCA得分如圖1所示，在得分圖中，兩個樣品的距離越近，它們屬于同一類別的可能性就越大，在主成分空間中更具有相似的特征。葉部樣品中，LT1（DBP 10mg·L-1）與LCK（對照）兩組樣品有部分重疊，說明DBP處理濃度為10mg·L-1的樣品與對照組代謝產(chǎn)物間沒有顯著差異。LT3（DBP100mg·L-1）分布于第1象限和第4象限，LCK分布于第2象限和第3象限，表明DBP處理濃度為100mg·L-1的樣品與對照組代謝產(chǎn)物間有顯著差異，代謝模式都與DBP處理濃度為10mg·L-1的樣品不同。與葉部樣品不同的是，根部樣品在DBP10mg·L-1（RT1）和100mg·L-1（RT3）的處理下都與LCK有顯著的差異，說明DBP脅迫對根部代謝產(chǎn)物的影響比對葉部代謝產(chǎn)物的影響大。PCA不僅有助于全面了解菜心不同組織代謝產(chǎn)物的總體情況，而且有助于檢測和排除異常樣品，從而提高模型的準確性。

2.1.2 PLS-DA

菜心不同組織代謝產(chǎn)物PLS-DA得分如圖2所示，不同DBP濃度處理的代謝產(chǎn)物均與對照組存在明顯分離，表明不同DBP濃度處理下代謝產(chǎn)物與對照組存在顯著差異。全部樣品組都位于置信區(qū)間內(nèi)，同時參數(shù)模型（對y變量數(shù)據(jù)集）可解釋度（R2Y）和模型可預測度（Q2）都大于0.8（表1），說明模型的穩(wěn)定性較好，數(shù)據(jù)可靠，這表明DBP脅迫導致了菜心分泌物的變化。經(jīng)過PLS-DA置換檢驗發(fā)現(xiàn)，02點從左到右均低于最右邊的原始的藍色的Q2點，且Q2lt;0，R2和Q2的回歸線與橫坐標交叉或者lt;0，說明評估模型沒有發(fā)生過擬合。以上結(jié)果表明PLS-DA模型能有效區(qū)分各組樣本，具有較好的預測能力，并且預測有效，可用于后續(xù)的差異成分分析。其中，DBP處理濃度為10mg·L-1的葉部樣品在PCA中沒有明顯分離，但在PLS-DA下明顯分離，表明PLS-DA的分析效果更佳。

2.2差異代謝產(chǎn)物的篩選與鑒別

根據(jù)PLS-DA生成的第1主成分變量重要性值投影（Variable importance in the projection，VIP），并結(jié)合一維方差分析（One-way ANOVA．P-value）來篩選組間差異代謝產(chǎn)物（P≤0.01且VIP≥1），共篩選到105種顯著差異代謝產(chǎn)物。對DBP不同濃度處理下葉、根分別進行組間比較，在LT1、LT3、RT1、RT3組中分別篩選到5、26、21、65個差異代謝產(chǎn)物（表2）。將不同濃度處理下的不同組織特有的差異代謝產(chǎn)物和共有差異代謝產(chǎn)物進行交集分析（圖3），發(fā)現(xiàn)LT1、LT3、RT1、RT3特有的差異代謝產(chǎn)物分別有1、20、15、59個。3個及以上樣本共有差異代謝產(chǎn)物為Sebacic acid。

2.3差異代謝產(chǎn)物熱圖分析

為了更直觀地展示樣本之間的關(guān)系及代謝產(chǎn)物在不同樣本之間的表達差異，對富集在通路上的顯著差異代謝產(chǎn)物表達量進行了聚類熱圖分析。如圖4所示，使用顏色來表示代謝產(chǎn)物的含量，其中紅色為含量高表達，紫色為含量低表達。從圖中條帶可以看出各樣品中都有明確的高表達或者低表達區(qū)域，說明差異代謝產(chǎn)物在不同樣品中的含量有明顯差異，且篩選的顯著差異代謝產(chǎn)物能作為標志物將兩組區(qū)分開。聚在一簇的代謝產(chǎn)物具有相似功能或共同參與同一代謝途徑。熱圖分析發(fā)現(xiàn)差異代謝產(chǎn)物在根部樣品和葉部樣品中的含量有明顯區(qū)分，如葉部組織樣品中，4-異丙基苯（甲）醛（4-1sopropylbenzaldehyde）、吲哚乙酸（Indoleacetic acid）、油酰胺（Oleamide）等代謝產(chǎn)物的含量相對較高，根部組織樣品中，尿酸（Uricacid）、棕櫚油酸（Palmitoleic acid）、二苯乙內(nèi)酰脲（Phenvtoin）等代謝產(chǎn)物的含量相對較高，說明在DBP脅迫下，不同組織中代謝產(chǎn)物種類和含量均有差異，其代謝方式和代謝途徑也不同。這有助于后續(xù)開發(fā)關(guān)鍵通路上的靶向化學調(diào)控劑。

2.4代謝產(chǎn)物代謝途徑分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫進一步對差異代謝產(chǎn)物進行通路富集分析。如圖5所示，差異代謝產(chǎn)物主要分布在36條代謝途徑中，其中Plt;0.05的代謝途徑有3條，分別是色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、丁酸代謝。其中，色氨酸代謝通路最為顯著，P值為0.017，-1g P為1.759，主要有3個被檢測到的差異代謝產(chǎn)物富集于此代謝通路上，分別為3-吲哚乙腈（3-Indoleacetoni-trile）、吲哚-3-乙酰胺（Indol-3 -yl）acetamide、吲哚乙酸（Indole-3-acetate），三者均為植物激素，與植物逆境環(huán)境下的生長和積累密切相關(guān)。富集在苯丙氨酸代謝通路上的差異代謝產(chǎn)物為苯乙酸（Phenylace-tic acid）和反式肉桂酸酯（trans-Cinnamate）。富集在丁酸代謝通路上的差異代謝產(chǎn)物為丁酸（Butanoic ac-id）和a-酮戊二酸（2-Oxoglutarate）。

3討論

非靶向代謝組學是無偏向性地分析樣品中盡可能廣泛的代謝產(chǎn)物，可以從整體上反映代謝產(chǎn)物的變化，有助于新代謝通路的發(fā)現(xiàn)，可直觀比較不同樣品間的代謝特征。本文采用非靶向代謝組學結(jié)合多元統(tǒng)計方法，對常見農(nóng)作物菜心的不同組織進行分析，總共篩選出105個顯著差異代謝產(chǎn)物，主要參與色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、丁酸代謝、甜菜堿生物合成等36條代謝途徑。其中色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、丁酸代謝較為顯著，可能為影響DBP脅迫下菜心代謝及品質(zhì)的關(guān)鍵通路。因此，本文將重點討論這3條代謝途徑。

3.1色氨酸代謝

色氨酸作為植物自身合成的氨基酸之一，在植物體內(nèi)廣泛存在。其不僅為植物蛋白質(zhì)合成提供必要的原料，而且是許多重要次生代謝物（如植物生長素、生物堿、血清素等）的前體，在植物生長和發(fā)育過程中扮演著關(guān)鍵的角色。在DBP脅迫下，色氨酸可能在多個方面發(fā)揮作用，包括植物生長調(diào)控、抗逆性增強以及次生代謝物的合成。

色氨酸是苯丙氨酸的前體，它參與了苯丙氨酸代謝途徑的調(diào)節(jié)。DBP脅迫下，色氨酸的積累可能促進苯丙氨酸代謝途徑的活化，進而影響植物生長和發(fā)育。而苯丙氨酸代謝途徑涉及合成多種重要物質(zhì)，如植物激素。植物激素在植物的根系發(fā)育、生理調(diào)節(jié)、光合作用和植物抵抗逆境等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DBP脅迫下，菜心顯著差異代謝產(chǎn)物中的植物生長素吲哚乙酸富集于色氨酸代謝途徑，而吲哚乙酸的合成依賴于色氨酸代謝途徑，這說明色氨酸在DBP脅迫下可能通過調(diào)節(jié)苯丙氨酸代謝途徑，影響植物的生長和發(fā)育過程。此外，色氨酸在抗逆性調(diào)節(jié)中起著重要作用。色氨酸可以參與植物的抗氧化防御系統(tǒng)，它是合成類黃酮類化合物的前體，這些物質(zhì)具有抗氧化性質(zhì)，可以幫助植物對抗氧化應(yīng)激，被認為與植物的抗逆性密切相關(guān)。

3.2苯丙氨酸代謝

苯丙氨酸代謝是一種植物重要的次生代謝途徑，研究表明，一切含有苯丙烷骨架的物質(zhì)都是由這一途徑直接或間接生成的，因此在一個植物細胞中，有20%以上的代謝會通過這條途徑，其中主要包括苯丙烷代謝和異黃酮合成代謝。苯丙氨酸代謝途徑在植物生長調(diào)控、抗逆性增強以及次生代謝物合成方面起重要作用，通過該途徑能合成異黃酮類植物防御素、木質(zhì)素和苯丙氨酸解氨酶（PAI）等多種抗病物質(zhì)。

苯丙氨酸是許多重要生物活性物質(zhì)的前體，包括植物激素生長素、抗逆素和次生代謝物等。在DBP脅迫下，苯丙氨酸的代謝通路可能受到調(diào)節(jié)，導致其積累或降低。苯丙氨酸代謝通路的激活可能會參與調(diào)控植物的生長和發(fā)育過程。生長素是植物生長的主要激素，能促進細胞分裂和伸長，對根系和莖葉的發(fā)育起關(guān)鍵作用。抗逆素參與植物對逆境的響應(yīng)，增強植物的逆境適應(yīng)能力。因此，在DBP脅迫下，苯丙氨酸的代謝調(diào)控可能通過影響生長素和抗逆素的合成和信號傳遞，影響植物的生長和發(fā)育。DBP脅迫會對植物產(chǎn)生氧化應(yīng)激和細胞膜損傷等不利影響。苯丙氨酸可以參與合成類黃酮類化合物，這些化合物能夠中和活性氧自由基，保護細胞免受氧化損傷。苯丙氨酸還參與合成其他抗氧化物質(zhì)，如過氧化物酶和抗壞血酸等，從而進一步增強植物的抗氧化能力。苯丙氨酸還可能調(diào)節(jié)編碼抗氧化酶和抗逆蛋白的基因，從而增強植物對DBP脅迫的適應(yīng)能力。此外，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的作用下可以轉(zhuǎn)化為多種次生代謝物，如酚類物質(zhì)、堿類化合物和酯類化合物等，這些次生代謝物在DBP脅迫下積累，可能參與植物對污染物的解毒和排斥，從而保護植物的生理功能和生存能力。

3.3丁酸代謝

丁酸是一種簡單的有機酸，在DBP脅迫下可能發(fā)揮多種作用，如代謝調(diào)控、使抗氧化和抗逆性增強、激活防御反應(yīng)以及減輕毒害效應(yīng)等。丁酸可以通過參與丁酸代謝途徑和相關(guān)代謝通路的調(diào)控，調(diào)節(jié)植物的能量代謝和物質(zhì)合成。此外，丁酸還可以作為三羧酸循環(huán)的一個旁路在植物體內(nèi)參與調(diào)節(jié)細胞質(zhì)pH，參與植物生長發(fā)育及形態(tài)建成等多種生理生化及代謝過程，調(diào)節(jié)與逆境脅迫相關(guān)的基因表達及蛋白質(zhì)的合成，進而增強植物抗逆性等一系列重要的生命活動。丁酸還可能通過調(diào)節(jié)抗逆相關(guān)基因的表達，如編碼抗氧化酶和抗逆蛋白的基因，增強植物對DBP脅迫的適應(yīng)能力。

DBP脅迫可能引發(fā)植物的防御反應(yīng)，而丁酸可能在調(diào)節(jié)防御基因表達和激活防御反應(yīng)方面發(fā)揮作用。丁酸可以參與信號轉(zhuǎn)導通路和基因表達調(diào)控，從而激活植物的防御反應(yīng)。這包括激活與逆境響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、激素信號通路和防御相關(guān)基因的表達，進而增強植物的抵抗力和適應(yīng)能力。丁酸還可能通過調(diào)節(jié)細胞膜的滲透性和穩(wěn)定性，減少DBP進入細胞的量和速率，從而降低DBP對植物的毒性。

富集在丁酸代謝途徑上的差異代謝產(chǎn)物a-酮戊二酸（2-oxoglutarate）是連接丁酸代謝和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，在丁酸代謝途徑中扮演重要的角色。它能為植物提供能量，可以作為合成多個重要代謝產(chǎn)物的前體分子，如谷氨酸、谷胱甘肽、絲氨酸和色氨酸等，是植物維持正常生理和適應(yīng)環(huán)境變化的重要分子之一。在植物的抗逆性和防御機制中，它可能通過參與氧化還原反應(yīng)，抑制活性氧的產(chǎn)生，從而減輕DBP脅迫引起的氧化損傷。它還可以通過參與調(diào)節(jié)基因表達、激素合成和信號傳導等生物化學過程，調(diào)控植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)。

因此，通過調(diào)控這些關(guān)鍵代謝途徑及其中的代謝產(chǎn)物來調(diào)控菜心的表達，可以減少污染物累積的發(fā)生，提高農(nóng)作物的品質(zhì)，在后期的研究中，將在非靶向代謝組的基礎(chǔ)上利用靶向代謝組學對菜心代謝產(chǎn)物做進一步定性和定量的研究。

4結(jié)論

（1）DBP脅迫下，菜心不同組織代謝產(chǎn)物存在顯著差異，共篩選出ios種顯著差異代謝產(chǎn)物，其中色氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、丁酸代謝為關(guān)鍵的代謝通路。

（2）DBP脅迫下，3條關(guān)鍵代謝通路可能發(fā)揮的作用主要包括影響植物生長調(diào)控、增強抗逆性以及合成次生代謝物等。

（3）DBP脅迫下，菜心的代謝產(chǎn)物含量不僅在不同組織間存在差異，而且在不同濃度下的代謝方式也不同。