摘 要： 旨在分析使用低密度芯片的基因分型數(shù)據(jù)通過基因型填充獲取高密度的基因型數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。本研究利用10K SNP芯片數(shù)據(jù)填充至50K，分析填充所得基因型與50K真實基因型的基因型一致性。具體方法如下：使用4 435只健康純系蛋雞母系個體為試驗群體，采用蛋雞“鳳芯壹號”50K芯片進(jìn)行基因型測定獲得基因型數(shù)據(jù)。在該群體中，隨機(jī)抽取部分個體分別作為填充群體和參考群體。從填充群體的50K分型數(shù)據(jù)中均勻抽取10K基因型作為已知信息，其余位點信息將通過填充獲得。填充時，結(jié)合參考群數(shù)據(jù)，利用Beagle 4.0軟件將填充群體的10K分型數(shù)據(jù)填充至50K水平，對比填充基因型和真實基因型的一致性，以基因型填充一致性評價基因型填充準(zhǔn)確性。同時比較系譜使用與否（所用填充群100只，參考群1 000只）、群體間親緣關(guān)系（所用填充群100只，參考群1 000只）以及參考群體規(guī)模（所用填充群100只，參考群500、1 000、2 000、3 000只）3種因素對基因型填充準(zhǔn)確性的影響。結(jié)果表明，本研究群體中，系譜信息的使用與否未影響基因型填充的一致性（0.973 vs. 0.973）?；蛐吞畛湟恢滦噪S群體間親緣關(guān)系的改變而變化，當(dāng)參考群體選取18世代個體（1 000只），來填充19世代群體（100只）基因型時，填充一致性為0.972，當(dāng)參考群體分別均勻選取16、17、18世代個體（三世代群體總計選擇1 000只）時，基因型填充一致性下降至0.968。基因型填充一致性隨參考群體規(guī)模增大而上升，參考群體規(guī)模按500、1 000、2 000、3 000依次擴(kuò)大時，基因型填充一致性依次提高，分別為0.959、0.973、0.980、0.984。本研究結(jié)果表明，蛋雞基因芯片從10K填充至50K的方法可行，可在基因組選擇育種中大規(guī)模推廣，以降低應(yīng)用成本。

關(guān)鍵詞： 蛋雞；基因芯片；基因型填充；分子育種

中圖分類號：S831.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4325-09

收稿日期：2024-03-06

基金項目：國家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-40）；國家重點研發(fā)項目（2021YFD1300600）；國家自然科學(xué)基金（32272865）

作者簡介：吳俊鋒（1996-），男，河南信陽人，博士生，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：wjf960428@163.com

*通信作者：連 玲，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail： lianlinglara@126.com

Accuracy Analysis of Genotype Imputation from 10K to 50K SNP Loci in Layers

WU" Junfeng1，2， YAN" Yiyuan3， YANG" Ning1，2， SUN" Congjiao1，2， LI" Guangqi3， WANG" Bin3， WU" Guiqin

3， LIAN" Ling1，2*

（1.College of Animal Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193，

China;

2.Frontier Science Center for Molecular Design Breeding， China Agricultural University，

Beijing 100193， China;

3.Beijing Huadu Yukou Poultry Industry Co.， Ltd.， Beijing 101206， China）

Abstract：" The aim of this study was to analyze the accuracy of using low-density chip genotyping data to obtain high-density genotype data through genotype imputation.

In this study， the genotypic consistency between the imputed genotypes based on 10K and the 50K real genotypes was analyzed. The 4 435 healthy brown laying hens from pure-line were selected， and 50K SNP array of laying hens was used for genotype determination. Some individuals were randomly selected as test and reference populations， respectively. The 10K genotype data was evenly selected from 50K typing data as known genotypes， and Beagle 4.0 software was used to impute genotypes of the rest 40K to obtain 50K data. The consistency of the imputed genotype and the real genotype was compared.

The accuracy of genotype filling was evaluated by genotype filling consistency. We also analyzed the influence of following 3 aspects on the accuracy of genotype filling： 1） usage of pedigree or not （100 individuals in test population vs. 1 000 individuals in reference population）; 2） kinship between reference and test population （100 individuals in test population vs. 1 000 individuals in reference population）; 3） reference population size （100 individuals in test population vs. 500， 1 000， 2 000， 3 000 individuals in reference population）. The results showed that the consistency of genotypic imputation was not affected by the use of genealogical information or not （0.973 vs. 0.973）. The consistency of genotypic imputation was changed as the change of inter-population kinship. Using the individuals from 18th generation （1 000 individuals） as reference population to impute the genotypes of 19th generation population （100 individuals）， the consistency of genotypic imputation was to 0.972. When using individuals from the 16th， 17th and 18th generations as reference population to impute the genotypes of 19th generation population， and the consistency of genotypic imputation was decreased to 0.968. The imputation consistency of genotype was increased with the increase of reference population size. The consistency of genotype imputation was 0.959， 0.973， 0.980， and 0.984 when the reference population size was 500， 1 000， 2 000， and 3 000， respectively. Collectively， this study shows that the imputation of layer SNP array from 10K to 50K is feasible， and it can be applied in genome selection breeding to reduce genotyping costs.

Key words： laying hens; SNP array; genotype imputation; molecular breeding

*Corresponding author： LIAN Ling， E-mail： lianlinglara@126.com

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是基因組上最常見的重要遺傳變異，占已知多態(tài)性的90%以上［1］，具有分布廣、密度高、遺傳穩(wěn)定、檢測便捷等優(yōu)點［2］，是繼第一代限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記、第二代微衛(wèi)星標(biāo)記后的第三代分子遺傳標(biāo)記。高通量測序是基因型檢測的必要條件，隨著高通量SNP芯片的研發(fā)，基因組選擇廣泛應(yīng)用于畜禽育種中［3-4］。但高通量SNP芯片在大群體中的應(yīng)用成本較高［5-7］，因此，低密度芯片應(yīng)運(yùn)而生。在基因組選擇育種中，可以將低密度基因型數(shù)據(jù)填充至高密度水平，在保持填充準(zhǔn)確率的同時不影響基因組選擇的準(zhǔn)確性，能夠大幅降低應(yīng)用成本［8-10］。

基因型填充技術(shù)是利用已有的SNP分型信息對缺失的位點進(jìn)行基因型預(yù)測。目前主流填充方法主要有兩種，一種是利用群體連鎖不平衡信息構(gòu)建單倍型來填充，如Impute2、Beagle、Plink等［11-12］；另一種則是利用系譜信息結(jié)合連鎖信息構(gòu)建單倍型，如AlphaImpute、Fimpute等［13-14］。研究表明，基因型填充準(zhǔn)確性受多方因素影響，如填充軟件［15-17］、參考群規(guī)模［18-20］、參考群體與目標(biāo)群體的親緣關(guān)系［21］、最小等位基因頻率［17，22-23］等。而在目前基于基因組選擇的畜禽育種中，50K芯片是主流分型方式［24-25］。本研究旨在評估蛋雞10K基因型數(shù)據(jù)填充至50K的填充效果，探究影響基因型填充準(zhǔn)確性的因素，為低密度芯片在育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物來自某公司的純系蛋雞群體，目前已經(jīng)完成了19個世代的產(chǎn)蛋性能選育。本研究使用的群體是第16～19世代（2020—2023年）的4 435只蛋雞。

1.2 芯片數(shù)據(jù)處理

對所有個體采集全血后，使用蛋雞“風(fēng)芯壹號”50K SNP芯片進(jìn)行基因型測定，使用Plink軟件對所有個體的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除檢出率低于95%、最小等位基因頻率小于0.05及分型錯誤的SNPs。質(zhì)量控制后保留43 681個標(biāo)記和全部個體。

1.3 10K低密度芯片位點獲取

對Plink［26］質(zhì)控過濾后的43 681個標(biāo)記采用相同排序間隔提取方式，相等排序間隔提取是以10K位點數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)，從50K芯片中每隔10個SNPs取1個SNP，考慮到雞的不同染色體片段長度差異較大， 根據(jù)各染色體長度差異按比例確定各染色體上的SNP挑選數(shù)量。最終從43 681個SNPs中隨機(jī)提取10 146個SNPs以生成10K低密度芯片數(shù)據(jù)。由于每條染色體上提取起始SNP的位置可以不同，因此按照上述提取原則可以生成多個10K位點數(shù)據(jù)集，以便進(jìn)行多次重復(fù)試驗。

1.4 基因型填充

本研究使用Beagle 4.0［27］對低密度標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行填充，為研究不同因素對填充準(zhǔn)確性的影響，在以參考群為模板的情況下，按照“1.3”中的原則，提取填充群的10K數(shù)據(jù)，對填充群體的40K位點進(jìn)行基因型填充，相同流程重復(fù)10次。用填充后的基因型與真實的50K基因型的一致性，衡量填充效果（基因型一致性是指填充正確的基因位點占需要填充基因位點的比例［28-29］）。使用T-test檢驗不同分組條件下基因型一致性的差異。

1.4.1 系譜有無對基因型填充準(zhǔn)確性的影響

為探究系譜使用與否對填充準(zhǔn)確性的影響，均勻選取了16世代（333個體）、17世代（333個體）、18世代（334個體）組成的1 000個個體的參考群，隨機(jī)從19世代群體中抽取100個個體作為填充群體分別采用有系譜和無系譜兩個策略，比較系譜使用與否對基因型填充一致性的影響，使用T-test檢驗兩種情況下基因型一致率的差異。

1.4.2 親緣關(guān)系對基因型填充準(zhǔn)確性的影響

為探究參考群體與填充群體親緣關(guān)系對填充準(zhǔn)確性的影響，本研究參考群體選取方法同分別均勻選取了16世代（333個體）、17世代（333個體）、18世代（334個體）組成的1 000個個體的參考群，以及單獨(dú)使用18世代1 000個體作為參考群體兩個策略，同樣隨機(jī)從19世代群體中抽取100個個體作為填充群體，重復(fù)上述填充流程，比較參考群體與填充群體的親緣關(guān)系對基因型一致性的影響，差異檢驗同“1.4.1”。

1.4.3 參考群規(guī)模對基因型填充準(zhǔn)確性的影響

為探究參考群體規(guī)模對填充準(zhǔn)確性的影響，本研究等比例從16世代、17世代、18世代分別均勻篩選了共500、1 000、2 000、3 000個個體作為參考群體，另外隨機(jī)抽取19世代100個個體作為填充群體，重復(fù)基因型填充流程。比較參考群體規(guī)模對基因型填充一致性的影響，差異檢驗同“1.4.1”。

2 結(jié) 果

2.1 10K和50K芯片的描述性統(tǒng)計

表1對兩種基因型的SNP數(shù)、SNP相鄰平均間隔、最小等位基因頻率和連鎖不平衡程度進(jìn)行了統(tǒng)計。10K和50K芯片33條常染色體分別共計10 146和43 687個位點。10K芯片的平均間隔為118 000 bp，最小等位基因頻率為0.30，連鎖不平衡程度為0.263；50K芯片的平均間隔為30 000 bp，最小等位基因頻率為0.29，連鎖不平衡程度為0.261。說明10K與50K基因型相比，標(biāo)記間的平均間隔雖然擴(kuò)大，但在基因組和染色體水平的最小等位基因頻率和連鎖不平衡程度卻幾乎沒有變化。

2.2 系譜對基因型填充準(zhǔn)確性的影響

表2和圖1均顯示了系譜使用與否時的基因型填充一致性，并對兩組結(jié)果進(jìn)行了差異分析。可以看出對本研究群體而言，10次重復(fù)中，只使用Beagle的基因型填充一致性平均為0.973，使用Beagle聯(lián)合系譜的基因型填充一致性平均為0.973（表2），二組間無顯著差異（P gt;0.05）。

二者對比看出系譜使用與否對本群體的基因型填充一致性無明顯影響。但結(jié)合系譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基因型填充的10次重復(fù)進(jìn)行的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差（0.000 64）略低于無系譜數(shù)據(jù)填充（0.000 65）。

2.3 參考群體與填充群體親緣關(guān)系對基因型填充準(zhǔn)確性的影響

本研究進(jìn)一步分析了參考群體與填充群體的親緣關(guān)系對基因型填充一致性的影響（圖2）。結(jié)果顯示，以16、17、18世代均勻組成的1 000個個體參考群體為模板的基因型填充一致性平均為0.968，而只以18世代的1 000個個體為參考群體的基因型填充一致性平均為0.972（表3）。

可以看出，使用親緣關(guān)系較近的18世代作為參考群體，基因型填充的一致性更好，且10次重復(fù)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差更低。而參考群體引入親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的16、17世代群體后，基因型填充的一致性由0.972顯著下降至0.968（Plt;0.001），且標(biāo)準(zhǔn)差也由0.000 82增加至0.001 32，變異系數(shù)由0.000 84增加至0.001 36。

2.4 參考群體規(guī)模對基因型填充準(zhǔn)確性的影響

本研究同時分析了參考群體規(guī)模對基因型填充一致性的影響。結(jié)果表明，在500只的參考群規(guī)模下，基因型填充一致性為0.959；當(dāng)參考群規(guī)模增加至1 000時，基因型填充一致性提升了0.014（Plt;0.001），為0.973；繼續(xù)擴(kuò)大參考群規(guī)模至2 000時，基因型填充一致性隨之提升了0.007（Plt;0.001），為0.980；當(dāng)參考群規(guī)模增加至3 000時，基因型填充一致性提升了0.004（Plt;0.001），為0.984（表4、圖3）?；蛐吞畛錅?zhǔn)確性隨參考群規(guī)模的增大而提高，但提升幅度會隨之降低。

3 討 論

本研究中使用Beagle單獨(dú)進(jìn)行填充與Beagle聯(lián)合系譜填充的基因型一致性結(jié)果并無差別，而前人的研究表明使用系譜可以提升基因型填充的效果［30］，如陽文攀等［31］對比了系譜有無對基因型填充效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Beagle聯(lián)合系譜進(jìn)行填充的效果是最佳的。兩個研究存在差異的原因，可能是由于本研究所使用群體已連續(xù)選育數(shù)代，世代間的基因流傳遞十分完整，導(dǎo)致系譜信息的使用與否對基因型填充并無顯著影響。

多個研究表明，當(dāng)填充群體規(guī)模固定時，參考群體與填充群體的親緣關(guān)系更強(qiáng)，基因型填充的效果更好［18，32］。Pausch等［33］發(fā)現(xiàn)，參考群體與填充群體親緣關(guān)系較近時，基因型填充的一致性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于利用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的參考群體進(jìn)行填充。因為當(dāng)參考群體與填充群體的親緣關(guān)系更近時，參考群體可以在最大限度上代表整個群體的遺傳變異，可以更好的作為基因型參考模板來對填充群體進(jìn)行填充［34］。本研究也得到相似的結(jié)果，在保持填充群體為19世代的100個個體不變的情況下，當(dāng)參考群體與填充群體親緣關(guān)系較近時，基因型填充的一致性也隨之提升。因此，在基因型填充的應(yīng)用中，可以篩選與填充群體親緣關(guān)系較近的個體組成參考群體，以保障基因型填充準(zhǔn)確性。

隨著參考群體的規(guī)模增大，基因型填充的準(zhǔn)確性提高［35-37］。本研究中，當(dāng)參考群體從500、1 000、2 000、3 000只按梯度擴(kuò)大時，基因型填充一致性也隨之提高，且伴隨著準(zhǔn)確性的提高，10次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差也下降，填充效果也趨于穩(wěn)定，這說明了參考群體規(guī)模大小對基因型填充準(zhǔn)確性有較大的影響。Weng等［38］以2 108頭中國荷斯坦奶牛群體的20%、40%、80%、95%分別作為參考群體并保持填充群體不變，將基因型數(shù)據(jù)由3K填充至7K，發(fā)現(xiàn)基因型填充準(zhǔn)確性逐漸提升；Ghoreishifar 等［39］使用水牛群體進(jìn)行研究，同樣保持填充群體規(guī)模固定而增加了參考群規(guī)模，基因型填充準(zhǔn)確性在參考群由小到中等規(guī)模擴(kuò)大時提升較為明顯，從中等到大規(guī)模擴(kuò)大時提升較慢，均與本研究結(jié)果類似。這是因為參考群體規(guī)模的大小直接影響了單倍型的構(gòu)建［5，28］，當(dāng)參考群規(guī)模增加時，越多的個體可以提供更豐富的單倍型信息，單倍型的推斷和匹配填充會更加準(zhǔn)確。但參考群體規(guī)模的進(jìn)一步擴(kuò)大會使單倍型信息趨于飽和，使得基因型填充準(zhǔn)確性的提升幅度逐漸降低［33，40-41］。故在實際應(yīng)用中，在保障基因型填充效果的前提下，需要適當(dāng)控制參考群體規(guī)模，以進(jìn)一步降低應(yīng)用成本。

綜上，本研究探究了參考群體與填充群體親緣關(guān)系，使用系譜與否及參考群規(guī)模對基因型填充一致性的影響，發(fā)現(xiàn)使用系譜與否對基因型填充一致性沒有顯著影響，參考群體與填充群體親緣關(guān)系較近時，基因型填充的準(zhǔn)確性更高。同時，參考群規(guī)模增加也會提升基因型填充準(zhǔn)確性，但當(dāng)規(guī)模增加到一定程度，一致性的提升幅度會減緩。

4 結(jié) 論

基因芯片低密度化已成為分子育種實踐中降低基因型測定成本的有效手段。本研究結(jié)果表明，將蛋雞基因芯片中的10K位點填充至50K是可行的，可通過參考群體親緣關(guān)系篩選以及適當(dāng)控制參考群體規(guī)模，保障基因型填充準(zhǔn)確性?？梢赃M(jìn)行大規(guī)模早期選種，降低基因組選擇的分型成本。

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（編輯 郭云雁）