摘 要： 旨在通過誘導(dǎo)瘤胃酸中毒模型，探究瘤胃酸中毒對山羊胃腸道組織和菌群結(jié)構(gòu)的影響。本試驗(yàn)選取8只健康波爾山羊?yàn)樵囼?yàn)對象，對照組4只，造模后的酸中毒組4只。通過瘤胃插管灌服玉米面的方法構(gòu)建山羊瘤胃酸中毒模型。取胃腸道組織進(jìn)行HE染色、RT-qPCR和Western blot檢測，探究瘤胃酸中毒對山羊消化道組織形態(tài)、功能蛋白的影響。另外分別取瘤胃液和盲腸內(nèi)容物，應(yīng)用 Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)測定樣本中細(xì)菌的16S rRNA，分析酸中毒對山羊胃腸道細(xì)菌群落組成的影響。結(jié)果顯示：與對照組相比，酸中毒組山羊的瘤胃和小腸的組織形態(tài)出現(xiàn)損傷，其結(jié)構(gòu)完整性被破壞；瘤胃和十二指腸中的MCT1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白質(zhì)表達(dá)量均極顯著升高（Plt;0.01），而SLC5A8 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均極顯著降低（Plt;0.01）。對瘤胃內(nèi)容物進(jìn)行高通量測序后，相較于對照組，酸中毒組Alpha多樣性分析中Shannon指數(shù)顯著低（Plt;0.05），擬桿菌門（Bacteroidetes）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）的相對豐富度極顯著降低（Plt;0.01），纖維桿菌門（Fibrobacteres）、軟壁菌門（Tenericutes）的相對豐度顯著升高（Plt;0.05），瘤球菌屬（Ruminococcus）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）的相對豐富度顯著降低（Plt;0.05）。對盲腸內(nèi)容物高通量測序后，與對照組相比，酸中毒組的瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）的相對豐富度顯著降低（Plt;0.05），梭菌屬（Clostridium）相對豐富度顯著升高（Plt;0.05）。綜上可知，瘤胃酸中毒可使山羊消化道組織形態(tài)完整性破壞，相關(guān)蛋白表達(dá)受影響，導(dǎo)致消化道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂。

關(guān)鍵詞： 山羊；瘤胃酸中毒；胃腸道形態(tài)；高通量測序；菌群分析

中圖分類號： S858.26

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4760-13

收稿日期：2023-10-17

基金項(xiàng)目：安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)基金資助（AHCYJSTX-07）；安徽省自然科學(xué)基金優(yōu)青項(xiàng)目（2208085Y13）；安徽省自然科學(xué)基金（2308085QC104）；安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)高層次人才科研啟動經(jīng)費(fèi)（RC92107）。

作者簡介：張道亮（1999-），男，河南淮濱人，研究生，主要從事畜禽營養(yǎng)代謝病研究，E-mail：zdl15936569251@stu.ahau.edu.cn

*通信作者：李 玉，主要從事畜禽營養(yǎng)代謝病與中毒病研究，E-mail：lydhy2014@ahau.edu.cn

Effect of Rumen Acidosis on Gastrointestinal Function， Morphology， and Microflora

in Goats

ZHANG" Daoliang1， DING" Hongyan2， WANG" Liuxing1， TAI" Wenjun1， KONG" Hao1， ZHAO" Chang1，

FENG" Shibin1， WANG" Xichun1， XUE" Yanfeng1， WU" Jinjie1， LI" Yu1*

（1.College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei 230036，" China;

2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Anhui Academy of Agricultural Sciences，

Hefei 230031，" China）

Abstract：" This study utilized a model of rumen acidosis induced by the administration of corn flour to investigate its impact on the gastrointestinal tract flora structure of goats. In this experiment， eight healthy Boer goats were selected as test subjects， 4 in the control group and 4 in the acidosis group after modeling. Gastrointestinal（GI） tissues were collected for HE staining， RT-qPCR， and Western blot assay to investigate the effects of rumen acidosis on the morphology and functional proteins of goat GI tissues. Illumina MiSeq high-throughput sequencing was used to determine the 16S rRNA of the bacteria in rumen fluid and cecum content， aimed to sutdy the effect of acidosis on the bacterial communities in the gastrointestinal tracts. The results showed that， compared with the control group， the tissue morphology and structural integrity of the rumen and small intestine were damaged in the acidosis group. The relative expression levels of MCT1 mRNA and protein in rumen and duodenum were extremely significantly increased （Plt;0.01）， while the relative expression levels of SLC5A8 mRNA and protein were extremely significantly decreased （Plt;0.01）. The results of high-throughput sequencing in rumen contents showed that， the Shannon index of Alpha diversity analysis in the acidosis group was significantly lower than that in the control group （Plt;0.01）， and the relative richness of Bacteroidetes and Synergistetes was significantly decreased （Plt;0.01）. The relative abundance of Fibrobacteres and Tenericutes was significantly increased （Plt;0.05）， while the relative abundance of Ruminococcus and Prevotella was significantly decreased （Plt;0.05）. After high-throughput sequencing of cecum contents， compared with the control group， the relative richness of Ruminococcus and Oscillospira in acidosis group was significantly decreased （Plt;0.05）， while the relative richness of Clostridium was significantly increased （Plt;0.05）. In conclusion， rumen acidosis can destroy the integrity of digestive tract morphology， affect the expression of related proteins， and disturb digestive tract flora structure.

Key words： goat; rumen acidosis; gastrointestinal morphology; high-throughput sequencing; flora analysis

*Corresponding author： LI Yu，E-mail：lydhy2014@ahau.edu.cn

在反芻動物養(yǎng)殖過程中，為了經(jīng)濟(jì)效益最大化，人們通過改變飼喂方式和增加飼糧中精料比例來實(shí)現(xiàn)反芻動物的快速育肥。然而，這種飼喂方法雖然在短期內(nèi)可能有助于提高反芻動物生長性能和經(jīng)濟(jì)效益，但對動物的胃腸健康有相當(dāng)大的影響。提高反芻動物日糧中精料比例時，瘤胃內(nèi)的短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）的濃度會增加，瘤胃pH也隨之降低，繼而有可能引發(fā)瘤胃酸中毒［1］。

胃腸道屏障具有阻止病原體及毒害物質(zhì)侵入的功能，在維持和穩(wěn)定胃腸道健康方面發(fā)揮著重要作用，也是維持腸-肝軸穩(wěn)定的核心［2］。使用谷物類飼料誘導(dǎo)牛羊等反芻動物發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis， SARA）后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高谷物飼糧組瘤胃乳頭出現(xiàn)角化不全，角質(zhì)層細(xì)胞與顆粒層細(xì)胞之間的黏連受到損害，減少上皮細(xì)胞緊密連接，使細(xì)胞間縫隙增大，通透性升高對瘤胃組織造成長久的影響［3-4］。與此同時，飼喂高谷物的日糧不僅會影響山羊瘤胃的功能，還可能影響腸道功能，瘤胃中未經(jīng)消化的碳水化合物會進(jìn)入小腸，較高的滲透壓和低pH環(huán)境可引起腸道上皮結(jié)構(gòu)和微生物發(fā)酵發(fā)生改變［5］。SCFA主要由反芻動物胃腸道內(nèi)微生物發(fā)酵飼糧所產(chǎn)生，是腸道微生物的產(chǎn)物之一，通過腸道上皮被機(jī)體快速吸收，為動物提供60%～70%的能量［6］。當(dāng)反芻動物食用的日糧成分發(fā)生變化時，其瘤胃液中的SCFA的含量也會隨之發(fā)生相應(yīng)的變化。與此同時，單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（monocarboxylate transporter，MCT1）和Na+耦合單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（solute carrier gene family 5 member 8，SLC5A8）則介導(dǎo)了SCFA的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收［7-8］。

反芻動物胃腸道中棲息著大量的微生物，而這些胃腸道微生物與胃腸道正常的生理機(jī)能密切相關(guān)，胃腸道菌群失調(diào)會引起機(jī)體代謝紊亂和微生物感染，從而打破與宿主的互利作用，對動物機(jī)體健康產(chǎn)生影響。反芻動物瘤胃內(nèi)微生物數(shù)量豐富，種類繁多，主要菌門為擬桿菌門、厚壁菌門，主要菌屬為普雷沃氏菌屬［9］。當(dāng)給反芻動物飼喂精料過高的日糧時，瘤胃pH下降，LPS濃度升高，引起瘤胃菌群之間的平衡發(fā)生紊亂，從而影響反芻動物纖維消化率以及正常生理性能［10］。盲腸微生物在反芻動物腸道健康方面以及消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)方面的重要作用不可忽視［11］。瘤胃酸中毒會導(dǎo)致反芻動物腸道發(fā)酵產(chǎn)生大量揮發(fā)性脂肪酸、pH下降，進(jìn)而改變腸內(nèi)容物中微生物群落組成結(jié)構(gòu)，對動物的健康和生長性能造成一定的危害［12］。綜上，改變?nèi)占Z中精料比例，可能會引起后腸微生物的群落發(fā)生改變。

本試驗(yàn)通過瘤胃插管灌服玉米面的方法構(gòu)建山羊瘤胃酸中毒模型，研究假設(shè)，瘤胃酸中毒產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是導(dǎo)致黏膜屏障破損、重要功能蛋白異常表達(dá)、瘤胃和盲腸菌群異常定/增殖的原因，以此探究瘤胃酸中毒對山羊消化道組織形態(tài)、功能蛋白、菌群的影響，進(jìn)一步為瘤胃酸中毒對山羊造成的危害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與模型建立

選取8只12月齡左右的健康波爾山羊分為酸中毒組與對照組，每組4只，公母隨機(jī)，分欄預(yù)飼養(yǎng)1周。在預(yù)飼養(yǎng)期間，所有的山羊每日定時飼喂3次，飼喂原料以花生秧、玉米、麩皮、豆粕等飼糧為主，不限制飲水。試驗(yàn)期間，保持圈舍衛(wèi)生，確保通風(fēng)和飼糧清潔，并做好山羊基本情況記錄。預(yù)飼養(yǎng)1周后，采用瘤胃插管灌注玉米面法構(gòu)建立試驗(yàn)動物模型，以45 g·kg-1體重的比例確定玉米面用量，用溫開水?dāng)嚢璩氏『隣顚ι窖蜻M(jìn)行灌服。灌服前抽取瘤胃液，測定造模前瘤胃pH。灌服結(jié)束后，在不同時間節(jié)點(diǎn)（12、24、36、48 h）抽取瘤胃液檢測pH的變化。并時刻觀察山羊臨床特征，根據(jù)精神狀況、血?dú)庵笜?biāo)、pH等綜合變化來判定是否造模成功。

1.2 樣本采集與處理

在整個試驗(yàn)過程中，觀察記錄山羊基本情況：體溫、呼吸數(shù)、精神狀況、飲食狀況、糞便狀態(tài)等情況。試驗(yàn)開始前和試驗(yàn)結(jié)束時對全部試驗(yàn)山羊進(jìn)行靜脈采血，肝素抗凝，盡快送往實(shí)驗(yàn)室使用愛德士VetStat電解質(zhì)和血?dú)夥治鰞x進(jìn)行血?dú)夥治鰴z測（pH、CO2分壓、HCO3-、總CO2、剩余堿、緩沖堿、Na+、K+、Cl-）。采集山羊造模前和造模后每12 h的新鮮糞便（直腸檢查獲?。?、尿液（導(dǎo)尿管獲?。?、瘤胃液（胃管導(dǎo)出）并用精密pH儀進(jìn)行pH的檢測。試驗(yàn)結(jié)束后，將酸中毒組與對照組各4只山羊放血致死后，解剖腹腔，取出瘤胃、小腸和盲腸等組織。用生理鹽水（0.9% NaCl）沖洗后，分裝于5 mL的凍存管和含4%多聚甲醛的離心管中。用于后期的蛋白質(zhì)印跡分析法（Western blot）、實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析以及組織切片的制作。將采集的瘤胃液（四層紗布過濾后）分裝于15 mL的凍存管內(nèi)，無菌法截斷盲腸，將盲腸內(nèi)容物分裝于2個無菌凍存管內(nèi)，用于胃腸道菌群的測定。

1.3 組織切片的制作

將收集的瘤胃和小腸組織進(jìn)行依次固定、漂洗、脫水、透明后包埋于石蠟中。每個蠟塊不連續(xù)切5塊厚6 μm的組織，進(jìn)行HE染色，最后封片。在顯微鏡下鏡檢，對胃腸道組織形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.4 RT-qPCR和Western blot檢測瘤胃及十二指腸MCT1和SLC5A8的mRNA及蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量

RNA快速提取試劑盒（山東思科捷生物技術(shù)有限公司）提取瘤胃與小腸組織的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。引物序列如表1所示，所有引物由欣樂生物技術(shù)（安徽）有限公司合成。使用RT-qPCR儀（PIKOREAL96 Thermo Scientific）對目的基因及內(nèi)參基因進(jìn)行定量。反應(yīng)程序如下：95℃ 30 s預(yù)變性；95℃ 5 s，60℃ 34 s，重復(fù)40個循環(huán)。使用20 μL反應(yīng)體系（2 μL cDNA、10 μL qPCR mix、1 μL primer F、1 μL primer R、6 μL ddH2O），所有樣品設(shè)3個重復(fù)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果采用2-ΔΔCt方法。

稱取0.1 g組織，按比例加入配好的總蛋白提取液，勻漿后4℃孵育20min，離心取上清使用BCA檢測盒（山東思科捷生物技術(shù)有限公司）測算組織樣品蛋白濃度。Western blot試驗(yàn)過程參考文獻(xiàn)［13］。在膜上滴入按1∶1配好的ECL化學(xué)發(fā)光液（武漢塞維爾生物有限公司），使用凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂 BIO-RAD 有限公司）自動曝光。

1.5 胃腸道內(nèi)容物高通量測序

胃腸道內(nèi)容物的總DNA提取和純化參考Li等［9］描述的方法進(jìn)行。采用Nanodrop對DNA進(jìn)行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。選擇16S rRNA 基因的V4區(qū)作為擴(kuò)增和測序的目的片段，引物序列為：515F （5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R （5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′），然后對目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。使用熒光試劑為 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，將PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，采用Illumina平臺進(jìn)行測序。按照QIIME2 dada2或Vsearch分析流程進(jìn)行序列去噪或OTU聚類。對各組在不同物種分類學(xué)水平的具體組成進(jìn)行展示，了解整體概況。根據(jù)ASV/OTU在不同樣本中的分布，評估每個樣本的Alpha多樣性水平，并通過稀疏曲線反映測序深度是否合適。在物種分類學(xué)組成層面，通過各種非監(jiān)督、監(jiān)督的排序、聚類和建模手段，結(jié)合相應(yīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)方法，進(jìn)一步衡量不同組間的物種豐度組成差異。

1.6 數(shù)據(jù)分析及繪圖

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。采用SPSS20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立性T檢驗(yàn)，上標(biāo)*表示差異顯著（Plt;0.05），上標(biāo)**表示差異極顯著（Plt;0.01）。運(yùn)用Image j軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度值分析，文中柱狀圖繪制均采用Graphpad Prism7數(shù)據(jù)軟件進(jìn)處理。

2 結(jié) 果

2.1 造模成功的判定

在試驗(yàn)造模前后，采集山羊新鮮的瘤胃液、尿液、糞便并用精密pH試紙分別進(jìn)行pH的檢測記錄。結(jié)果如圖1所示，山羊造模前的瘤胃液、尿液、糞便的pH在7～8之間，呈弱堿性。造模后，隨著時間的變化山羊瘤胃液、糞便、尿液pH出現(xiàn)急劇降低。在造模后12～24 h內(nèi)山羊瘤胃液、尿液pH均在5.0～5.8之間，呈弱酸性。與造模后12 h內(nèi)相比，在造模后36～48 h之間山羊瘤胃液、尿液pH隨著造模時間的延長出現(xiàn)上升，但均低于造模前。

如表2所示，采用動物血?dú)夥治鰞x測定山羊造模前后血液血?dú)庵笜?biāo)。與對照組相比，酸中毒組山羊血液中K+極顯著降低（Plt;0.01），pH、HCO3-、TCO2、BE、BB均顯著降低（Plt;0.05）。表明以45g·kg-1的玉米面誘導(dǎo)山羊瘤胃酸中毒模型成功。

2.2 瘤胃酸中毒對消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示，在光學(xué)顯微鏡下，對照組A、C的瘤胃上皮組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列緊密、毛細(xì)血管無明顯擴(kuò)張。與對照組相比，如圖2中黑色箭頭指出的，酸中毒組B、D的瘤胃上皮組織形態(tài)層次結(jié)構(gòu)完整性被破壞，角質(zhì)層細(xì)胞出現(xiàn)糜爛壞死、脫落、瘤胃部分乳頭出現(xiàn)缺損、毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞間隙增大。

如圖3所示，A、C、E分別為十二指腸、空腸、回腸的對照組，B、D、F依次為十二指腸、空腸、回腸的酸中毒組。通過光學(xué)顯微鏡對小腸上皮形態(tài)組織進(jìn)行觀察，對照組腸絨毛排列整齊，腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，無脫落破損現(xiàn)象。與對照組相比，如圖3中黑色箭頭指出的，酸中毒組腸組織形態(tài)完整性被破壞，出現(xiàn)明顯缺損，且腸絨毛排列不齊、出現(xiàn)明顯破損、脫落現(xiàn)象。

2.3 酸中毒對瘤胃和十二指腸MCT1和SLC5A8 mRNA與蛋白相對表達(dá)量影響

試驗(yàn)通過采用RT-qPCR法，檢測MCT1與SLC5A8在對照組與酸中毒組山羊瘤胃和十二指腸mRNA的表達(dá)。結(jié)果如圖4A和4B所示，與對照組相比，酸中毒組瘤胃和十二指腸中MCT1 mRNA相對表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01）。如圖4C和D所示，與對照組相比，瘤胃和十二指腸中SLC5A8 mRNA相對表達(dá)量極顯著降低（Plt;0.01）。

試驗(yàn)采用Western blot試驗(yàn)法檢測MCT1與SLC5A8在對照組和酸中毒組瘤胃和十二指腸中蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖5A所示，與對照組相比，酸中毒組瘤胃和十二指腸中的MCT1蛋白表達(dá)量均極顯著升高（Plt;0.01）。如圖5B所示，與對照組相比，酸中毒瘤胃和十二指腸中SLC5A8的蛋白表達(dá)量極顯著降低（Plt;0.01）。

2.4 瘤胃酸中毒對瘤胃和盲腸菌群的影響

2.4.1 瘤胃和盲腸菌群多樣性的分析

對照組與酸中毒組各樣品稀釋曲線和覆蓋度曲線由圖6所示，樣本稀釋曲線隨著試驗(yàn)測序深度的增加，各曲線趨于平坦。表明取樣合理，能夠大部分覆蓋山羊瘤胃和盲腸內(nèi)容物菌群的變化。結(jié)合所有樣本的覆蓋度曲線圖，表明本試驗(yàn)對于樣本的測序量及測序深度合理。

2.4.2 goods_coverage指數(shù)評估測序

測序結(jié)果代表了各樣本中微生物的覆蓋率，F(xiàn)aith_pd指數(shù)是對細(xì)菌菌群豐富度指數(shù)的評估，Pielou_e指數(shù)是評估物種豐富度有關(guān)的均勻度指數(shù)。由圖7所示，與對照組相比，酸中毒組Observed species、Chao1、Shannon、Pielou_e、Faith_pd指數(shù)差異均顯著降低（Plt;0.05）。以上結(jié)果表明，酸中毒改變了盲腸內(nèi)容物中的細(xì)菌多樣性和豐富度。

2.4.3 酸中毒對瘤胃和盲腸菌群門水平與屬水平的影響

反芻動物胃腸道主要優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）。如圖8A和表3所示，顯示了瘤胃內(nèi)容物樣品在門水平上各菌門的相對豐富度變化。在瘤胃微生物門水平上，與對照組相比，酸中毒組極顯著降低了擬桿菌門、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）的相對豐富度（Plt;0.01）。極顯著升高了纖維桿菌門（Fibrobacteres）的相對豐富度（Plt;0.01），顯著升高了軟壁菌門（Tenericutes）的相對豐富度（Plt;0.05）。如圖8B所示，瘤胃微生物中屬水平相對豐度的變化情況。根據(jù)相對豐度不同，主要優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬（Prevotella）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（streptococcus）以及雙歧桿菌屬（Bifidobacteria）。與對照組相比，酸中毒組極顯著降低了瘤胃球菌屬（Ruminococcus）的相對豐富度（Plt;0.01），顯著降低了普雷沃氏菌屬相對豐富度（Plt;0.05）。如圖8C所示，顯示了盲腸內(nèi)容物樣品在門水平上各菌門的相對豐富度。與對照組相比，酸中毒組產(chǎn)生了較高的變形桿菌門，降低了厚壁菌門、擬桿菌門的相對豐度。如圖8D和表4所示，盲腸微生物中屬水平相對豐度的變化情況。與對照組相比，酸中毒組極顯著降低了瘤球菌屬的相對豐富度（Plt;0.01）。顯著降低了顫螺旋菌屬（Oscillospira）的相對豐富度（Plt;0.05）。顯著升高了梭菌屬（Clostridium）相對豐富度（Plt;0.05）。

3 討 論

近年來，國家高度重視“三農(nóng)”問題，各級政府對農(nóng)業(yè)尤其是畜牧業(yè)的重視力度越來越大。在鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略中牛羊產(chǎn)業(yè)迎來高質(zhì)量發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模也逐漸朝向標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化、高效化模式發(fā)展。但是以瘤胃酸中毒為代表的營養(yǎng)代謝性疾病的發(fā)生比例逐年升高，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，需要研究出更多對策來應(yīng)對反芻動物瘤胃酸中毒，為提高生產(chǎn)需求提供實(shí)際的指導(dǎo)意義。

多種因素都能夠影響到瘤胃組織結(jié)構(gòu)，其中日糧成分則是主要的影響因素之一。以往研究報道，長時間飼喂高精日糧會降低瘤胃pH，導(dǎo)致瘤胃乳頭脫落、角質(zhì)化不全、細(xì)胞間隙變大等異常現(xiàn)象［4，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，酸中毒組山羊的瘤胃上皮組織形態(tài)層次結(jié)構(gòu)完整性被破壞，角質(zhì)層脫落，瘤胃部分乳頭出現(xiàn)缺損、毛細(xì)血管擴(kuò)張充血等，這與上述試驗(yàn)結(jié)果一致。這一結(jié)果提示，瘤胃酸中毒破環(huán)了瘤胃組織形態(tài)使其組織受損，對反芻動物瘤胃組織形態(tài)造成了危害。

小腸調(diào)控著腸道消化吸收，是機(jī)體內(nèi)主要的營養(yǎng)物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的部位。因此，保持腸道結(jié)構(gòu)的完整性對維持動物機(jī)體消化系統(tǒng)以及健康十分重要。前人研究報道，飼喂高精飼料導(dǎo)致的瘤胃酸中毒增加了微生物和LPS通過瘤胃上皮進(jìn)入血液循環(huán)，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致奶山羊腸上皮細(xì)胞間隙明顯增寬造成腸組織損傷［15］。本研究中，使用玉米面造模誘導(dǎo)山羊發(fā)生瘤胃酸中毒后，酸中毒組山羊小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。其十二指腸、空腸、回腸腸絨毛均出現(xiàn)脫落、排列不齊等現(xiàn)象。這與薛春旭［16］試驗(yàn)結(jié)果基本一致。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，酸中毒可造成小腸的腸道組織形態(tài)受損。

可溶性碳水化物在瘤胃不斷發(fā)酵累積產(chǎn)生大量SCFA在瘤胃內(nèi)蓄積引發(fā)瘤胃酸中毒。位于瘤胃上皮細(xì)胞基底外側(cè)膜的MCT1，介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)SCFA和其代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)等［17-18］。Yan等［19］與劉軍花等［20］研究均發(fā)現(xiàn)，給反芻動物長期飼喂高比例精飼料或提高日糧中精料比例均可顯著提高瘤胃上皮細(xì)胞中MCT1 mRNA以及蛋白表達(dá)量。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后酸中毒組上調(diào)了山羊瘤胃和十二指腸組織MCT1 mRNA以及蛋白表達(dá)量。結(jié)果可能表明，當(dāng)瘤胃快速發(fā)酵產(chǎn)生大量SCFA時，瘤胃為了穩(wěn)定pH和適應(yīng)這一變化加速SCFA從瘤胃快速轉(zhuǎn)出，進(jìn)而提升了MCT1的表達(dá)，但具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步的探究［21］。SLC5A8參與多種代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)，如SCFA、煙酸和乳酸等。在本試驗(yàn)中，造模后酸中毒組SLC5A8在瘤胃和十二指腸的表達(dá)量均降低。這可能是因?yàn)樯窖蛩嶂卸竞?，瘤胃?nèi)蓄積大量的SCFA，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致pH降低影響其表達(dá)量。

瘤胃酸中毒打破動物機(jī)體內(nèi)菌群之間的平衡，引起瘤胃菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本試驗(yàn)結(jié)果表明，酸中毒組山羊瘤胃細(xì)菌多樣性（Shannon）指數(shù)顯著低于對照組。這表明瘤胃酸中毒降低了山羊瘤胃內(nèi)菌群組成的多樣性，對瘤胃菌群組成影響較大。與此同時，在瘤胃菌群的門水平中，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門均為山羊瘤胃菌群中的優(yōu)勢菌門，這與先前研究報道的一致［22］。Khafipour等［23］研究使用谷物類飼糧誘導(dǎo)奶牛發(fā)生SARA后，擬桿菌門在反芻動物瘤胃中的相對豐度降低，而厚壁菌門在反芻動物瘤胃中的相對豐度增加。本研究中，相比于對照組，酸中毒組擬桿菌門數(shù)量顯著降低，而厚壁菌門在山羊瘤胃內(nèi)容物中的相對豐度升高，但差異不顯著。擬桿菌門中的雷沃氏菌屬為豐富革蘭陰性菌屬，當(dāng)飼喂高精日糧反芻動物后擬桿菌門數(shù)量和相對豐度降低。這可能是由于發(fā)生酸中毒后瘤胃處于酸性環(huán)境狀態(tài)，而革蘭陰性菌不耐酸，因此較低的pH導(dǎo)致與革蘭陰性菌有關(guān)細(xì)菌發(fā)生破裂或死亡［22］。放線菌門、纖維桿菌門與纖維降解有關(guān)，其主要作用能夠促進(jìn)瘤胃對纖維物質(zhì)的降解。本研究中，酸中毒組顯著提高了山羊瘤胃菌群中放線菌門的相對豐度，降低了纖維桿菌門的相對豐度。本試驗(yàn)還觀察到，山羊瘤胃酸中毒后降低了互養(yǎng)菌門的相對豐度，顯著提升了軟壁菌門相對豐度，但具體作用，還需進(jìn)一步探究。在屬水平上，普雷沃氏菌屬為擬桿菌門中相對豐度較高的菌屬，可產(chǎn)生大量的復(fù)合酶，參與多種代謝活動，其作用是促進(jìn)非纖維性多糖和蛋白質(zhì)的降解。而瘤球菌屬和密螺旋體屬則在降解纖維和半纖維過程中起重要的作用［24］。Mao等［22］試驗(yàn)結(jié)果表明，SARA組中普雷沃氏菌屬、密螺旋體的豐度均低于對照組，而雙歧桿菌屬的豐富度顯著增加。而在本試驗(yàn)中，通過玉米面灌服法誘導(dǎo)山羊發(fā)生酸中毒后，降低了瘤胃微生物中普雷沃氏菌屬、密螺旋體屬的相對豐富度，提高了雙歧桿菌屬的相對豐富度，試驗(yàn)結(jié)果與以上研究一致。丁酸弧菌屬和乳酸菌屬是瘤胃中主要的乳酸產(chǎn)生菌屬。本試驗(yàn)中，在發(fā)生酸中毒后，山羊瘤胃菌群微生物中，丁酸弧菌的相對豐度出現(xiàn)下降，而乳酸桿菌的相對豐度呈升高趨勢。其結(jié)果可能與酸中毒后瘤胃pH降低有關(guān)，提示瘤胃處于酸性環(huán)境下，乳酸桿菌亦能大量繁殖生存。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，造模后酸中毒組盲腸微生物中Simpson、Chao1、Shannon指數(shù)均顯著低于對照組，這與Liu等［25］的研究結(jié)果一致。表明酸中毒對盲腸微生物結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了較大的影響。已有研究報道，在山羊盲腸菌群門水平中，厚壁菌門與擬桿菌門占總菌門的比例較大，為優(yōu)勢菌門［26］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對照組與酸中毒組山羊盲腸微生物中優(yōu)勢菌門依次為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，這與上述報道基本一致；并且酸中毒組降低了盲腸微生物中瘤球菌屬數(shù)量、升高乳桿菌屬的相對豐度。乳桿菌屬為乳酸主要產(chǎn)生者，顫螺菌屬、瘤球菌屬其作用是參與降解纖維，以供宿主基本的代謝［27］。雙歧桿菌可利用淀粉、葡萄糖等作為底物產(chǎn)生乳酸和乙酸。王悅［28］研究報道，使用谷物類飼糧飼喂湖羊時，隨著谷物類飼料比例的提高，結(jié)腸微生物中雙歧桿菌的數(shù)量也呈升高趨勢。牛鏈球菌具有很強(qiáng)的發(fā)酵淀粉產(chǎn)生乳酸的能力，一旦給反芻動物飼喂高精飼糧時易引起瘤胃pH的降低，發(fā)生SARA，致使胃腸道牛鏈球菌大量增殖［29］。在本試驗(yàn)中，酸中毒組提高了山羊盲腸菌群中雙歧菌屬、鏈球菌屬的相對豐度。這可能與山羊發(fā)生酸中毒后改變了腸道內(nèi)pH有關(guān)。在低pH情況下，一些對低pH敏感的細(xì)菌數(shù)量發(fā)生下降，反之適應(yīng)低pH的細(xì)菌數(shù)量增加。有報道指出，梭菌屬作為腸道致病菌，可能會誘導(dǎo)腸道發(fā)生炎癥［30］。而在本試驗(yàn)中，酸中毒確實(shí)使山羊盲腸內(nèi)容物梭菌屬的比例顯著增加，這可能進(jìn)一步加劇對腸道的損傷。

基于當(dāng)前研究的發(fā)現(xiàn)，考慮到反芻動物獨(dú)特的消化和吸收機(jī)制，增加精料在飼料中的比例可能會帶來雙刃劍的效果：一方面，這將有助于加快經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)出；另一方面，它可能會破壞消化系統(tǒng)的平衡。因此，尋找一個能夠最大化利益的平衡點(diǎn)，對于當(dāng)代的科研人員而言，仍然是一個重要的研究目標(biāo)。此外，開發(fā)出一種優(yōu)化的飼養(yǎng)模式或者進(jìn)行優(yōu)良育種至關(guān)重要，同時，選擇適當(dāng)?shù)囊嫔源龠M(jìn)其在胃腸道中的定殖，保持腸道微生物群的平衡，對于推動牛羊產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量增長也是必不可少的。

4 結(jié) 論

山羊在發(fā)生瘤胃酸中毒后，瘤胃和小腸的組織形態(tài)、蛋白功能、菌群結(jié)構(gòu)與組成產(chǎn)生了較大變化，具體表現(xiàn)為：酸中毒后瘤胃和小腸組織形態(tài)出現(xiàn)損傷，其結(jié)構(gòu)完整性被破壞；酸中毒后瘤胃內(nèi)環(huán)境蓄積大量SCFA，從而對具有轉(zhuǎn)運(yùn)吸收SCFA及其代謝產(chǎn)物乳酸、乙酸等相關(guān)蛋白的表達(dá)造成了影響，上調(diào)了瘤胃和十二指腸中MCT1的表達(dá)，降低了SLC5A8的表達(dá)；瘤胃酸中毒改變了瘤胃微生物菌群的組成結(jié)構(gòu)，使瘤胃微生物多樣性發(fā)生顯著下降，同時，降低了瘤胃微生物中與纖維降解菌有關(guān)細(xì)菌的相對豐度，升高了與發(fā)酵碳水化合物有關(guān)菌群的相對豐富度；使盲腸菌群多樣性和豐富性發(fā)生下降，降低了與纖維降解菌有關(guān)菌群相對豐富度，升高了與乳酸產(chǎn)生菌相關(guān)菌群的相對豐度。

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（編輯 范子娟）