摘 要： 旨在明確五味子醇甲對雞大腸桿菌病的預防作用，將180只1日齡蛋雞隨機分為6組：空白對照組、E. coli感染組、50 mg·kg-1五味子醇甲組、100 mg·kg-1五味子醇甲組、200 mg·kg-1五味子醇甲組和抗生素組（氟苯尼考）。飼養(yǎng)至14 d時，按分組劑量開始給藥，給藥5 d后，除空白對照組外其余各組均腹腔接種大腸桿菌菌液，檢測雛雞體重、免疫器官指數(shù)、脾病理變化和超微結構、血細胞數(shù)、血清炎癥因子、抗體水平和免疫球蛋白的變化。結果表明，五味子醇甲能夠提高患病雛雞體重，顯著降低脾指數(shù)，減輕由于大腸桿菌感染導致的脾組織結構以及細胞中細胞核和線粒體的損傷，顯著降低患病雞的白細胞數(shù)量以及血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平，并顯著升高IgM、IgG和NDV的抗體水平。綜上所述，五味子醇甲能夠通過調節(jié)免疫對雞大腸桿菌病起抗病作用。

關鍵詞： 五味子醇甲；雞大腸桿菌病；免疫

中圖分類號：S853.7

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4735-12

收稿日期：2023-10-31

基金項目：河北省重點研發(fā)計劃（21326602D）

作者簡介：包佳鷺（1994-），女，河北廊坊人， 博士生，主要從事中獸醫(yī)學研究，E-mail： 15383066910@163.com

*通信作者： 王曉丹， 主要從事中獸醫(yī)學研究，E-mail： wangxiaodan_wxd@126.com

The Preventive Effect of Schisandrin A on Chicken Colibacillosis and Its Impact on Immune

Function

BAO" Jialu， ZHANG" Yan， WANG" Xiaodan*

（College of Chinese Veterinary Medicine， Hebei Agricultural University， Baoding 071001，" China）

Abstract：" To investigate the preventive effect of schisandrin A against chicken colibacillosis， 180 one-day-old chicks were divided into the following groups： control group， Escherichia coli infection group， 50 mg·kg-1 schisandrin A group， 100 mg·kg-1 schisandrin A group， 200 mg·kg-1 schisandrin A group， and antibiotic group （florfenicol）. After 5 days of administration， except for the control group， all other groups were intraperitoneally inoculated with E. coli suspension. The chicks′ body weight， immune organ index， spleen histopathological and ultrastructural changes， blood cell count， serum inflammatory factors， antibody levels， and immunoglobulin changes were evaluated. The results demonstrated that pre-feeding schisandrin A improved the body weight of infected chicks， significantly reduced the spleen index， alleviated spleen tissue damage and cellular nuclear and mitochondrial injuries caused by E. coli infection. Furthermore， 200 mg·kg-1 schisandrin A significantly reduced the white blood cell count in infected chickens， while both 100 mg·kg-1 and 200 mg·kg-1 schisandrin A groups significantly decreased the levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， and IL-8 in the serum of infected chickens， and significantly increased the antibody levels of IgM， IgG， and NDV. In summary， schisandrin A exerted a disease-resistant effect against avian colibacillosis by modulating the immune response.

Key words： schisandrin A; chicken colibacillosis; immunity

*Corresponding author：" WANG Xiaodan， E-mail： wangxiaodan_wxd@126.com

雞大腸桿菌?。╟hicken colibacillosis）是臨床常見的家禽傳染病，雞感染大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）后免疫低下，往往繼發(fā)感染禽流感、法氏囊、新城疫等病毒性疾病，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失［1-5］。目前，大腸桿菌病的治療主要依靠抗生素進行，但由于監(jiān)管困難，抗生素被超量使用，導致動物源性食品出現(xiàn)嚴重的藥物殘留問題，不僅危害人類健康，還造成了獸藥殘留的環(huán)境污染［6-7］?？股卦谘杆贇⑺繣. coli的同時，釋放大量內毒素，而內毒素正是誘導炎癥性疾病發(fā)生的關鍵病因［8］。此外，在抗生素的高強度壓迫下，細菌開始進化出針對各種抗生素而產(chǎn)生的耐藥性，超級細菌接連出現(xiàn)使大腸桿菌病的防治難度日益增大［9-10］。因此，尋找安全有效的抗生素替代品是防治大腸桿菌病的關鍵所在。中藥具有抗菌、免疫調節(jié)等作用，還有不易產(chǎn)生耐藥性的特性，能夠在解決細菌耐藥性問題、大腸桿菌病防治及保障人畜禽健康方面發(fā)揮重要作用［11］。

五味子是一種臨床常見的中藥，藥理研究顯示，其發(fā)揮主要作用的成分包括木脂素、多糖、揮發(fā)油、黃酮和有機酸等［12-13］。木脂素是五味子提取物中的重要活性成分，主要包括五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲和五味子醇乙［14-17］。研究顯示，五味子醇甲（schisandrin A）能夠顯著提高免疫力低下小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，并對損傷的免疫器官具有修復作用［18］。依據(jù)五味子醇甲內部結構設計合成的HDAC6抑制劑能夠逆轉白細胞介素6介導的PD-L1上調，免疫調節(jié)能力突出，且口服生物利用度高，是一種潛在的治療惡性腫瘤的免疫調節(jié)治療劑［19］。五味子醇甲具有治療肝纖維化的作用，能夠對枯否細胞炎性因子的分泌起到抑制效果［20］，還能改善腸道菌群紊亂，減少黏液層缺陷，保護腸道內皮完整性［21］。五味子醇甲在調節(jié)免疫、抗菌抑炎方面具有顯著效果，然而，目前，尚不清楚它是否對抗E. coli感染具有免疫調節(jié)作用。為了進一步明確五味子醇甲的療效，本研究主要從免疫調節(jié)的角度探討其對E. coli感染的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

五味子醇甲購自成都植標化生有限公司，純度大于98%。E. coli菌株為河北保定某養(yǎng)殖場臨床分離株，由河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院預防獸醫(yī)實驗室提供。蛋雞（京白939）購自河北大午農牧集團食品有限公司。LB培養(yǎng)基購自索萊寶生物科技有限公司。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6， IL-6）、白細胞介素8（interleukin-8， IL-8）、免疫球蛋白A（immunoglobulin A， IgA）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M， IgM）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G， IgG）、雞傳染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus， IBDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus， IBV）和雞新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物有限公司。

1.2 菌液制備

使用接種環(huán)將E. coli凍存液于LB瓊脂培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，在37 ℃培養(yǎng)12 h。然后挑取單個菌落接種在3 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)12 h。最后，使用無菌磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline， PBS）將菌株濃度調節(jié)至1×108 cfu·mL-1。

1.3 試驗動物分組

選取180只1日齡蛋雞，隨機分為6組：空白對照組、E. coli感染組、50 mg·kg-1五味子醇甲組、100 mg·kg-1五味子醇甲組、200 mg·kg-1五味子醇甲組和抗生素治療組（氟苯尼考）。各組飼養(yǎng)溫度、濕度均為（35±3）℃、50%±10%。各組雞均在7日齡接種疫苗（新城疫和傳染性支氣管炎凍干苗采用滴鼻點眼方式免疫，傳染性法氏囊油苗采用皮下注射方式免疫）。飼養(yǎng)至14 d時按照分組劑量開始給藥，給藥5 d后，除空白對照組外，其余各組腹腔注射1×108 cfu·mL-1 E. coli 0.2 mL，空白對照組注射0.2 mL生理鹽水，觀察24 h，于第20日齡處死，采集血液、脾、胸腺和法氏囊組織，統(tǒng)計存活率。

1.4 體重和臟器指數(shù)的統(tǒng)計

于飼養(yǎng)的第14和20天早上8：00喂食前分別稱取各組雞體重，并處死，處死后，立刻采集脾、胸腺和法氏囊并稱重，計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)（%）=臟器重量（g）/體重（g）×100%

1.5 脾的組織病理學觀察

將采集的脾組織用4%多聚甲醛固定，24 h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后制成蠟塊，進行組織切片，然后用二甲苯脫蠟，乙醇復水，蘇木精-伊紅（H.E.）染色，中性樹脂封片。制作完成的玻片使用CKX41 型倒置顯微鏡觀察組織病理學變化［22］。

1.6 脾的超微結構觀察

將各組脾組織用2.5%戊二醛固定，24 h后取出，清洗，用1%的鋨酸溶液固定1.5 h。將脾組織酒精梯度脫水后，放入無水乙醇和丙酮中分別浸泡20 min。將包埋劑與丙酮按1∶1、1∶3的比例混合，組織塊浸泡1、3 h進行過渡，然后轉至包埋劑純品中過夜。將包埋好的組織用超薄切片機切片。用檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液分別染色15 min，通過透射電子顯微鏡拍照和分析［23］。

1.7 血細胞的分析

將血液采集于抗凝管中，并使血液充分接觸管壁上的抗凝劑，然后立刻使用血細胞分析儀檢測各組雞血白細胞（white blood cell ， WBC）和血小板壓積（plateletcrit， PCT）參數(shù)。

1.8 雞血清炎性因子、免疫球蛋白含量與抗體效價的檢測

將血液采集于促凝管中，并使血液充分接觸管壁上的促凝劑，3 000 r·min-1低溫離心10 min分離血清，采用IgA、IgM、IgG、IBDV、IBV和NDV ELISA試劑盒檢測，使用酶標儀在450 nm處測量每個孔的吸光度，并根據(jù)結果計算蛋雞血清中IgA、IgM、IgG含量和IBDV、IBV和NDV的抗體效價。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件中的方差分析法對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，試驗數(shù)據(jù)以“x-±s”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 五味子醇甲對雛雞體重、存活率和免疫器官指數(shù)的影響

如圖1a所示，與空白對照組相比，E. coli感染組雞體重顯著降低（P＜0.05）。而與E. coli感染組相比，各五味子醇甲組蛋雞體重均顯著升高（P＜0.05），且200 mg·kg-1五味子醇甲組與空白對照組無顯著差異（P＞0.05）。攻毒后，E. coli感染組蛋雞存活率為47%，50、100和200 mg·kg-1五味子醇甲組和氟苯尼考組存活率均有所增加，分別為63%、70%、73%和80%（圖1b）。E. coli感染組脾指數(shù)明顯高于空白對照組（P＜0.05）。100和200 mg·kg-1五味子醇甲組的脾指數(shù)顯著低于E. coli感染組（Plt;0.05）。與空白對照組相比，其余各組蛋雞胸腺指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），但各五味子醇甲組與E. coli感染組無顯著差異（P＞0.05）。各組間法氏囊指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）（圖1c）。

2.2 五味子醇甲對雛雞脾組織形態(tài)的影響

如圖2所示，空白對照組脾白髓與紅髓結構清晰可見，且分界較明顯。E. coli感染組中，白髓淋巴細胞減少，脾小結和動脈周圍淋巴鞘結構模糊。與E. coli感染組相比，各治療組脾損傷明顯改善，脾小結和動脈周圍淋巴鞘輪廓逐漸清晰，淋巴細胞間空泡顯著減少，白髓中淋巴細胞增多。

2.3 五味子醇甲對雛雞脾超微結構的影響

如圖3所示，空白對照組脾細胞結構完整，細胞膜無明顯破損，胞質未見腫脹，細胞核（N）呈卵圓形；線粒體（M）嵴結構清晰；粗面內質網(wǎng)（RER）輕微擴張，未見明顯脫顆粒；胞內可見少量脂滴（LD）與中心粒（Ct）（圖3A）。E. coli感染組脾細胞膜破損，胞質腫脹，細胞核染色質溶解；線粒體嚴重腫脹，出現(xiàn)空泡化，嵴結構模糊；粗面內質網(wǎng)中度擴張，脫顆粒（圖3B）。200 mg·kg-1五味子醇甲組脾細胞完整，細胞膜無明顯破損，胞質輕度腫脹，細胞核核膜間隙增寬；線粒體中度腫脹，基質不均，嵴結構清晰，少量斷裂；粗面內質網(wǎng)輕度擴張，部分脫顆粒（圖3C）。

2.4 五味子醇甲對雛雞血細胞的影響

如圖4所示，與空白對照組相比，E. coli感染組雛雞血液中白細胞數(shù)量顯著增加（P＜0.05）。而與E. coli組相比，200 mg·kg-1五味子醇甲組白細胞數(shù)顯著降低（P＜0.05），且與空白對照組無顯著差異（P＞0.05）。同時，大腸桿菌組的PCT較空白對照組顯著增加（P＜0.05），但其他組與空白對照組之間無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 五味子醇甲對雛雞血清中炎癥因子含量的影響

如圖5所示，與空白對照組相比，E. coli感染組血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平均顯著增加（P＜0.05）。各五味子醇甲組與E. coli感染組相比血清中TNF-α、IL-6和IL-8水平均顯著降低（P＜0.05），且與空白對照組無顯著差異（P＞0.05）。同時，100和200 mg·kg-1五味子醇甲組與E. coli感染組相比血清中IL-1β水平顯著降低（P＜0.05），且與空白對照組無顯著差異（P＞0.05）。

2.6 五味子醇甲對雛雞血清中免疫球蛋白含量的影響

如圖6所示，與空白對照組相比，E. coli感染組血清中IgM和IgG水平顯著減低（P＜0.05）。100和200 mg·kg-1五味子醇甲組和氟苯尼考組的IgM水平顯著高于E. coli感染組（P＜0.05）。100 mg·kg-1五味子醇甲組和氟苯尼考組的IgG水平也顯著高于大腸桿菌感染組（P＜0.05）。50、100和200 mg·kg-1五味子醇甲組及氟苯尼考組的血清IgA水平與空白對照組無顯著差異（P＞0.05）。

2.7 五味子醇甲對雛雞血清中抗體效價水平的影響

如圖7所示，與空白對照組相比，E. coli感染組血清中的NDV抗體效價水平顯著降低（P＜0.05），100 mg·kg-1五味子醇甲組和氟苯尼考組顯著高于E. coli感染組（P＜0.05），與空白對照組無顯著差異（P＞0.05）。E. coli感染組的IBV抗體效價顯著低于空白對照組（P＜0.05），而其他組與空白對照組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。與空白對照組相比，各五味子醇甲組及氟苯尼考組的IBDV抗體效價均顯著降低（P＜0.05）。

3 討 論

大腸桿菌病是影響雛雞生長發(fā)育的主要細菌性疾病之一，E. coli感染后雛雞會表現(xiàn)出精神沉郁和腹瀉等癥狀。此外，采食減少和腸道吸收能力減弱，均可導致雛雞體重下降，從而對生產(chǎn)性能產(chǎn)生不良影響。同時，E. coli還可侵害雛雞免疫器官，導致免疫功能下降，抗病能力降低，進而繼發(fā)其他疾病，增加死淘率。中草藥在提高動物生長性能方面作用顯著，研究顯示，迷迭香提取物可顯著增加E. coli攻毒肉雞平均日增重，提高生長性能［23］。黃連和蒲公英精油顯著改善E. coli攻毒仔豬日增重和飼料利用率［24］。本研究顯示，五味子醇甲能夠顯著改善E. coli感染導致的雛雞體重降低，并提升感染雛雞的存活率。

胸腺、脾和法氏囊是雞的主要免疫器官。免疫器官指數(shù)是反映免疫器官內淋巴細胞數(shù)量以及機體免疫情況的重要指標，雛雞的整體免疫能力與其中樞及外周的各免疫系統(tǒng)的發(fā)育狀況及功能的強度有關，免疫器官一旦受損，可直接影響免疫狀態(tài)，導致免疫能力降低［25］。脾作為淋巴細胞的主要儲存器官，承擔著淋巴細胞的發(fā)育、存儲和釋放等關鍵職能，其受損可能會對免疫應答產(chǎn)生長遠影響。本研究顯示，E. coli感染抑制雞的體重增長，顯著降低脾和胸腺指數(shù)，嚴重破壞脾結構，導致組織間隙的增加、線粒體腫脹和碎裂等病理損傷。中藥對動物的生產(chǎn)和免疫有良好的促進作用，許多研究表明中藥的有效成分有助于免疫器官發(fā)育，提高機體的免疫反應。山銀花和黃芩提取物能夠促進雞免疫器官的發(fā)育，尤其是胸腺和法氏囊［26］。由當歸、丹參、女貞子和黃芪等組成的復方中藥對肉雞具有免疫增強的作用［27］。本研究表明，五味子醇甲能夠降低大腸桿菌感染引發(fā)的雛雞脾指數(shù)升高，減輕脾損傷，并提高雛雞免疫功能。

血液在保障人體正常功能調節(jié)、新陳代謝和體內外環(huán)境的平衡方面扮演著重要的角色。白細胞數(shù)是臨床上細菌感染的鑒別診斷指標之一，在一定程度上可以反應細菌感染的嚴重程度［28］。E. coli入侵機體后，其主要成分脂多糖被釋放進入血液，與炎癥受體結合后產(chǎn)生炎癥因子，促進中性粒細胞浸潤，引發(fā)機體出現(xiàn)炎癥反應。E. coli感染時，血液中的白細胞數(shù)目會快速增多，觸發(fā)身體的非特異性免疫反應［29］。PCT是一種無激素活性降鈣素前肽物質，作為感染性疾病的早期生物標志物，其升高通常與細菌感染程度相關，PCT的增加表明炎癥反應增強［30］。研究表明，血液中WBC和PCT增高多見于細菌性炎癥反應、嚴重嘔吐、腹瀉等疾?。?1］。本研究顯示，感染E. coli后，雞血液中WBC和PCT顯著增加，五味子醇甲可顯著降低WBC和PCT水平，減輕炎癥反應。

炎癥因子參與調控炎癥免疫類疾病的發(fā)生發(fā)展［32］。機體的炎癥反應是一種受到外界刺激后防御性免疫反應，但炎癥因子的過度表達則可導致免疫系統(tǒng)失衡。E. coli入侵后，其細胞壁中的內毒素脂多糖被釋放進入血液，激活巨噬細胞，促進中性粒細胞浸潤，刺激機體產(chǎn)生炎癥反應，導致機體釋放大量促炎因子，最終發(fā)展為過度的炎癥反應。TNF-α和IL-1β是炎癥早期的主要促炎因子［33］。其中，TNF-α在炎癥反應早期發(fā)揮關鍵作用，是炎癥反應最重要的介質之一，激活中性粒細胞和淋巴細胞的作用， 增加血管內皮細胞通透性， 調節(jié)其他組織代謝活性，促進其他細胞因子的合成與釋放［34］。巨噬細胞被激活后，以前蛋白的形式產(chǎn)生IL-1β，對細胞分化、增生和凋亡等產(chǎn)生多方面的影響［35］。IL-6能促進其他炎癥因子的分泌，對B細胞具有調控功能，在免疫應答中發(fā)揮重要作用，是影響免疫系統(tǒng)的重要細胞因子［36］。IL-8能協(xié)助中性粒細胞和單核細胞進入炎癥部位，并調節(jié)白細胞黏附分子的表達，這與免疫炎癥和傳染病密切相關［37］。研究表明，感染E. coli后，促炎因子的表達增加［38-39］，而五味子醇甲具有顯著的抗炎作用［40］。Wang等［41］研究發(fā)現(xiàn)，E. coli會誘導機體產(chǎn)生免疫應激，血清中IL-1β含量顯著提高。本研究顯示，五味子醇甲可通過下調血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平，發(fā)揮其對雞大腸桿菌病的抗炎作用。

體液免疫主要由 B 淋巴細胞進行，能夠產(chǎn)生特異性抗體IgA、IgG和IgM。其中，IgG主要介導機體的抗感染免疫，具有凝集抗原、中和毒素和激活補體的功能［42］。IgM是體液免疫中最早出現(xiàn)的抗體之一，具有強大的殺菌功能［43］。許多中藥已被證實具有調節(jié)體液免疫的效果，研究表明，當歸、白芨、大青葉等煎制成的復方中藥對小鵝瘟感染導致的雛鵝免疫球蛋白 IgG、IgM和IgA 含量下降起到提升作用［44］。由黃芪、黨參、當歸等組成的中藥添加劑能夠提高藏雞IgG 和 IgM 含量［45］。當?shù)半r雞感染大腸桿菌時，甜葉菊綠原酸具有提高蛋雛雞血清中IgA和IgM含量的趨勢［46］。抗體效價是評價體液免疫的另一個重要指標。日糧中添加復方中藥能夠提高NDV的抗體效價，并誘導細胞因子的分泌［47］。雞日糧中添加靈芝多糖可以促進脾淋巴細胞增殖，顯著提高NDV抗體陽性水平［48］。本試驗結果顯示，五味子醇甲能提高雞血清中IgM和IgG的水平，并顯著提高NDV抗體水平，表明五味子醇甲通過提高雞的免疫水平來達到抗病的效果。

4 結 論

五味子醇甲能夠緩解E. coli感染導致的雞體重和存活率降低，抑制E. coli感染引起的血清炎癥因子升高，并通過減輕脾損傷、提高血清免疫球蛋白M和G水平調節(jié)免疫功能，緩解免疫功能低下導致的血清NDV水平降低。

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（編輯 白永平）