摘 要： 旨在探索硼暴露誘導(dǎo)雞肝細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。試驗選取30只AA肉雞隨機(jī)分為對照組（control group，CG）、低硼組（low boron group，LBG）和高硼組（high boron group，HBG），在基礎(chǔ)日糧中分別添加不同劑量硼進(jìn)行飼喂：基礎(chǔ)日糧（硼 0 mg · kg-1），低硼日糧（硼 120 mg · kg-1）、高硼日糧（硼 240 mg · kg-1），處理7及14 d后采集肝組織。使用ICP-MS測定肝組織中的硼含量，全自動血生化分析儀檢測ASL及ALT水平，HE染色觀察肝組織病理變化，透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，免疫組化和免疫熒光檢測肝細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3及IL-1β定位表達(dá)情況，RT-qPCR和Western blot 檢測NLRP3、Casapse-1、IL-1β、IL-18和GSDMD的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，蓄積于肝組織中的硼含量隨著硼暴露時間和劑量的增加而增加。此外，14 d-低硼組（14 d-LBG）和高硼組（14 d-HBG）的肝組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，并且細(xì)胞焦亡水平隨硼劑量的增加而加劇；與同時間的CG相比，14 d-LBG中NLRP3、Caspase-1、IL-18的mRNA表達(dá)水平顯著上升（Plt;0.05），14 d-HBG的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18及GSDMD的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上升（Plt;0.05）。高硼暴露可通過誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡進(jìn)而造成雞肝細(xì)胞損傷。

關(guān)鍵詞： 硼；細(xì)胞焦亡；雞；肝細(xì)胞

中圖分類號：S856.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4747-13

收稿日期：2023-11-22

基金項目：廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項目（2023A1515012811；2022A1515110090）

作者簡介：何 婷（1998-），女，廣西崇左人，碩士，主要從事畜禽代謝病研究，E-mail： hting1017@163.com

*通信作者：劉忠華，主要從事畜禽代謝病研究，E-mail：liuzh@scau.edu.cn;余文蘭，主要從事畜禽代謝病研究，E-mail：yuwenlan1989@scau.edu.cn

High Levels of Boron Exposure Aggravated Hepatocytes Damage in Broilers via Pyroptosis

HE" Ting1， LIU" Siying1， QUAN" Jinwen1， SU" Weiqian1， HUANG" Jiangli1， LI" Yumeng1， LIU" Zhonghua

1，2*， YU" Wenlan1，2*

（1.College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China;

2.Laboratory Animal Center， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China）

Abstract：" We aim to explore the mechanism of boron-induced hepatocytes damage in broilers. Thirty AA broiler chickens were randomly divided into control group （CG）， low boron group （LBG） and high boron group （HBG）. They were fed with different additional doses of boron in the basal diet： the basal diet （boron 0 mg · kg-1）， low boron diet （boron 120 mg · kg-1） and high boron diet （boron 240 mg · kg-1）， respectively. Liver tissues were collected 7 and 14 days after treatment. The content of boron in liver tissue was determined by ICP-MS， the ASL and ALT levels were tested by automatic blood biochemistry analyzer， the pathological changes in liver tissue were observed by Hamp;E staining， ultrastructural changes in liver tissue were observed by transmission electron microscopy， and the localized expressions of NLRP3 and IL-1β in liver tissue were detected by immunohistochemistry and immunofluorescence. The mRNA and protein expression levels of NLRP3， Casapse-1， IL-1β， IL-18， and GSDMD were detected by RT-qPCR and Western blot. The results showed that the amount of boron stored in the liver tissue as along dietary boron levels increased， with the duration and dosage of exposure. In addition， the structural integrity of the liver tissue of 14-day-low boron group （14 d-LBG） and 14-day-high boron group （14 d-HBG） was significantly compromised， with an increase in pyroptosis levels with an increase in boron dosage. Compared with CG at the same time， a significant upregulation of mRNA expression levels of NLRP3， Caspase-1 and IL-18 was observed in the 14 d-LBG（Plt;0.05）. Furthermore， a significant upregulation of both mRNA and protein expression levels of NLRP3， Caspase-1， IL-1β， IL-18 and GSDMD was observed in the 14 d-HBG （Plt;0.05）. High levels of boron exposure could induce hepatocytes damage in broilers through the pyroptosis pathway.

Key words： boron; pyroptosis; broiler; hepatocyte

*Corresponding authors：" LIU Zhonghua， E-mail： liuzh@scau.edu.cn; YU Wenlan， E-mail： yuwenlan1989@scau.edu.cn

硼（boron，B）是生物機(jī)體所需的關(guān)鍵微量元素之一，在增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高生長性能及促進(jìn)骨骼發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用［1-2］。畜禽飼料的原料中包含豆粕、玉米等作物，研究表明，在豆類作物種植過程中施用含硼的肥料能夠明顯促進(jìn)其生長及增產(chǎn)［3-4］。此外，有研究結(jié)果表明，在面制品及豆制品中加入硼砂可使其保持亮麗色澤及筋道的口感，但硼砂的過量攝入對人體同樣會產(chǎn)生不可逆的毒性作用［5］。硼的過量或不合理使用不僅會通過飼料原料或食品添加劑等方式被動物及人體攝入繼而產(chǎn)生毒性作用，還會通過污染土壤和水源進(jìn)入食物鏈中危害人類生命健康。肝作為機(jī)體內(nèi)金屬代謝和蓄積的主要靶器官，金屬一旦進(jìn)入體內(nèi)，必須經(jīng)過肝進(jìn)行代謝。過量或長期攝入硼可能會在肝中蓄積，但目前不同水平硼暴露對肝的損傷機(jī)制尚不明確。

細(xì)胞焦亡是一種促炎性的細(xì)胞死亡方式，也稱為繼發(fā)性壞死，它的發(fā)生依賴于半胱天冬酶家族的酶活性［6-7］。細(xì)胞焦亡發(fā)生時，細(xì)胞質(zhì)膜會形成1～2 nm的Caspase-1活性孔隙，進(jìn)而影響跨膜離子通量，促使細(xì)胞質(zhì)腫脹、膜破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)炎性細(xì)胞因子泄漏、細(xì)胞裂解死亡［8］。同時，大量研究表明，大多數(shù)的肝疾病常伴隨著細(xì)胞焦亡的發(fā)生及參與，細(xì)胞焦亡在不同方式誘導(dǎo)的肝損傷中具有重要且不同的作用［9-10］。此外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，一些重金屬或類金屬會誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，促進(jìn)細(xì)胞焦亡相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而造成組織損傷［11-13］。為進(jìn)一步探究高硼暴露對雞肝毒性的作用機(jī)制，本研究通過飼料添加不同濃度硼建立硼暴露模型，觀察硼暴露對雞肝細(xì)胞的功能及結(jié)構(gòu)的影響，利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞焦亡關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)水平，旨在為臨床硼中毒提供分子病理學(xué)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組與設(shè)計

本試驗經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（編號：2022A051）。30只1日齡健康A(chǔ)A肉品雞購自魯東禽業(yè)，肉雞進(jìn)行常規(guī)免疫后飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心［SYXK（粵）2022-0136］。肉雞均自由飲水和進(jìn)食，飲用水中的硼含量小于0.5 mg·L-1，符合國家《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB 5749—2002要求，基礎(chǔ)日糧中的硼含量為10 mg·kg-1。飼養(yǎng)環(huán)境要求符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB14925，溫度控制20～28℃，空氣相對濕度為50％～70％，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。經(jīng)過7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為3組（每組10只），硼酸為硼源，根據(jù)飼料中額外添加硼的劑量分組：對照組（硼 0 mg·kg-1，CG）， 低硼組（硼 120 mg·kg-1，LBG）、高硼組（硼 240 mg·kg-1，HBG），硼的劑量依據(jù)前期研究結(jié)果，最低劑量為LD50的1/20 ，最高劑量為LD50 的1/10［14-15］。各組肉雞自由飲水、采食，連續(xù)飼喂7和14 d，肉雞飼料符合國家實驗動物飼料營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)NRC（1994），日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗結(jié)束后，用1.5%戊巴比妥納靜脈注射安樂死，快速將肝組織從體內(nèi)分離并將其置于生理鹽水中進(jìn)行清洗。清洗完畢后用干凈的吸水紙吸凈組織表面多余的水分并將一部分肝組織放入4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行樣本固定，剩余組織放入凍存管中并置于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

硼酸購自上海美妮生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司；TRIzol購自TaKaRa公司；Prime ScriptRT Master Mix、蛋白定量劑試盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒以及2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；GAPDH、 Caspase1、IL-1β及NLRP3一抗（均為兔源抗體），購自由艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；預(yù)染Marker、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自廣州凱閣生物科技有限公司；多聚甲醛購自廣州維寧生物科技有限公司；切片石蠟、中性樹膠購自國藥集團(tuán)公司。除此之外，其他所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）購自美國熱電公司；LightCycler 480型熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；Unique-R10型超純水儀購自廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司；DM1000型光學(xué)顯微鏡購自廣州德真科學(xué)儀器有限公司。

1.3 肝系數(shù)

試驗結(jié)束后，將所有肉雞進(jìn)行稱重并安樂死。將肝迅速從體內(nèi)取出后進(jìn)行稱重并記錄數(shù)值，按照公式計算肝系數(shù)：肝系數(shù)=肝質(zhì)量（g）×100% /體重（g）。

1.4 肝組織硼含量的測定

按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》第一法，使用Agilent 7700系列ICP-MS電感耦合等離子體系譜儀測定硼信號強(qiáng)度并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線分析樣品中的硼含量［16］。

1.5 血清中轉(zhuǎn)氨酶的測定

將肉雞保定，通過翅下靜脈取血5 mL，靜置30 min，3 000 r·min-1離心15 min，收集上層血清100 μL置于血液生化檢測杯中，利用全自動血生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase， ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase， AST）水平。

1.6 肝組織病理學(xué)觀察

將肝組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，將組織塊形狀修整至接近正方體后移入包埋盒中，自來水流水過夜。組織塊經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，放入融化的石蠟中進(jìn)行石蠟包埋。將包埋塊切至5 μm厚的組織切片，并固定于載玻片上，置于37℃展片臺上過夜。切片用蘇木精核染12 min，接著進(jìn)行20 s的鹽酸酒精分色，隨后用自來水流水返藍(lán)，最后用伊紅復(fù)染；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。最后，通過光學(xué)顯微鏡觀察肝組織的病理學(xué)變化并拍照記錄。

1.7 透射電鏡觀察

將肝組織切碎至1 mm3 ，并置于2.5%戊二醛中48 h進(jìn)行樣本前固定，用0.1 mol·L-1 PBS 緩沖液漂洗4次，15 min·次-1；酒精梯度脫水（30%、50%、70%、80%、90%、100%），過渡到丙酮中處理2次，15 min·次-1。以樹脂為包埋劑，將包埋劑與丙酮的混合液（V/V=1/3）、（V/V=1/1）分別滲透4.5及12 h后，樹脂和丙酮的混合液（3/1）滲透7 h。再用100%純樹脂包埋過夜，70 ℃聚合樹脂24 h。最后，用修塊機(jī)將包埋塊修至1 mm3的大小，用超薄切片機(jī)切片，用醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛溶液對切片進(jìn)行雙重染色。染色切片晾干后，使用美國FEI公司TalosL120C型透射電鏡進(jìn)行觀察并拍照記錄。

1.8 實時熒光定量PCR

使用TRIzol法提取肝組織總RNA，并通過Nanodrop-2000超微量分光光度計檢測其濃度和純度。在逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用DEPC水進(jìn)行10倍稀釋，采用染料法進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。RT-qPCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL ，引物F/R各0.4 μL，DEPC水 3.2 μL。擴(kuò)增程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。檢測GSDMD、NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的相對表達(dá)量?；蛐蛄袕腉enBank獲取，本試驗選擇管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，使用Primer Express 5.0軟件設(shè)計引物序列，基因序列如表2所示。

1.9 免疫印跡分析

取50 mg肝組織，加入400 μL RIPA 裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）進(jìn)行組織勻漿，4 ℃離心后，抽取上清液，得到肝組織總蛋白原液，使用BCA試劑盒測定蛋白量。加入RIPA裂解液對蛋白原液進(jìn)行定量稀釋，將蛋白稀釋液與5×Loading Buffer（體積比=4∶1）混勻并于95 ℃水浴使蛋白充分變性。利用SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)對蛋白進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上方，使用快速封閉液在室溫下封閉15 min，隨后用TBST溶液清洗膜3次，每次清洗時間均為5 min。在此之后，將膜置于一抗中在4 ℃過夜孵育，然后使用二抗在26℃下孵育2 h，TBST溶液清洗膜4次，每次清洗時間均為5 min。最后，使用發(fā)光液顯影條帶，并通過凝膠成像系統(tǒng)成像并記錄結(jié)果。

1.10 免疫組織化學(xué)染色

將石蠟切片在55℃烘片40 min，在室溫下放涼，并使用二甲苯透明、梯度酒精復(fù)水，使用10 mmol·L-1檸檬酸鈉緩沖液（pH=6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS洗滌3次，用10%馬血清于37℃封閉1 h，用NLRP3一抗4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，按照DAB試劑盒使用說明在顯微鏡下孵育顯色，顯色完全后置于PBS中終止顯色反應(yīng)。將切片樣本置于蘇木精核染液中染色8 min，隨后，自來水流水返藍(lán)，梯度酒精脫水，使用二甲苯透明處理進(jìn)一步增強(qiáng)染色效果。最后，使用中性樹膠封片將樣本固定在玻璃切片上便于光學(xué)顯微鏡的觀察，并通過ImageJ分析試驗結(jié)果的光密度值。

1.11 免疫熒光試驗

與免疫組織化學(xué)相似，將組織烘片、透明、復(fù)水后進(jìn)行抗原修復(fù)。用PBS洗滌3次，0.5% Triton X-100透化20 min，1% BSA封閉1 h，IL-1β兔源抗體（一抗）在濕盒中4℃過夜孵育，增加抗體與抗原的結(jié)合機(jī)會，提高試驗的準(zhǔn)確性和可靠性。次日，滴加已稀釋好的熒光羊抗兔二抗，在37 ℃避光孵育1.5 h，以確保標(biāo)記物與抗原的充分結(jié)合。隨后，使用PBS洗滌3次以去除可能存在的非特異性結(jié)合。接著，滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑減少背景噪音，提高圖像的質(zhì)量。最后，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖片，通過Image-J分析軟件對熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.12 統(tǒng)計分析

使用Excel 2021對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理。處理后的數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x-±sx-）”的形式表示，其中，n=5。使用SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗，并使用Graphpad Prism 9.0軟件制作圖表，利用Image J軟件對免疫組化及免疫熒光結(jié)果進(jìn)行量化分析。在顯著性檢驗中，與對照組相比較，*.Plt;0.05，**.Plt;0.01，***.Plt;0.001，****.Plt;0.000 1；高硼組間的差異分析，#.Plt;0.05，##.Plt;0.01，###.Plt;0.001。當(dāng)Plt;0.05時，表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) "果

2.1 肝系數(shù)

肝系數(shù)分析結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，與7 d-CG（7 d，0 mg·kg-1）及14 d-CG（14 d，0 mg·kg-1）相比，7 d-HBG（7 d，240 mg·kg-1）與14 d-LBG肝系數(shù)顯著升高（Plt;0.05或Plt;0.01）。相比于14 d-CG，14 d-HBG肝系數(shù)顯著升高（Plt;0.001）。

2.2 肝組織中硼含量

如圖2所示，7 d-CG與14 d-CG肝中的硼含量無明顯差異，隨著添加在飼料中硼含量的增多，肉雞肝組織中的硼含量隨劑量的增加而升高。經(jīng)過7 d的硼暴露處理后，7 d-LBG（7 d，120 mg·kg-1）和7 d-HBG肝中的硼含量顯著增多（Plt;0.01或Plt;0.001）。同時，在14 d-LBG及HBG中，肝組織中的硼含量較14 d-CG顯著提高（Plt;0.001）。值得注意的是，在高硼組中，14 d肝中的硼含量相比7 d顯著升高（Plt;0.001）。

2.3 肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果

結(jié)果如表3所示。硼處理7 d時，與對照組相比，7 d-LBG肉雞的血清ALT水平顯著升高（Plt;0.05），7 d-HBG血清中的ALT及AST水平顯著升高（Plt;0.05）。同時，在14 d-LBG及HBG中，血清中的AST及ALT較14 d-CG顯著提高（Plt;0.05）。值得注意的是，在HBG中，14 d血清中的AST、ALT相比7 d顯著升高（Plt;0.05）。

2.4 肝組織病理學(xué)觀察

肝組織Hamp;E染色切片結(jié)果如圖3。根據(jù)圖3A和3D所示，7 d-CG與14 d-CG的肝細(xì)胞呈放射狀排列，以中央靜脈為中心，排列整齊，胞核明顯可見，門管區(qū)結(jié)構(gòu)完整。從圖3B及3E可以看出，隨著硼含量的增加，14 d的低硼組及高硼組肝細(xì)胞出現(xiàn)了炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞水腫變性等變化。如圖3C及3F所示，高硼處理的肝細(xì)胞損傷進(jìn)一步加劇，隨著暴露時間的延長，14 d-HBG相較7 d-HBG不僅出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫，且進(jìn)一步發(fā)生了細(xì)胞核溶解。結(jié)果表明，高硼暴露會影響肝組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡等病理學(xué)改變。

2.5 肝超微結(jié)構(gòu)觀察

不同劑量硼暴露處理的肝超微結(jié)構(gòu)變化見圖4。根據(jù)圖4發(fā)現(xiàn)硼處理組均出現(xiàn)不同程度的線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及核周間隙變寬。7 d-LBG、14 d-LBG出現(xiàn)線粒體腫脹現(xiàn)象，7 d-CG及14 d-CG的線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)較為正常，而7 d-HBG和14 d-LBG的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)明顯擴(kuò)張，線粒體腫脹、空泡，14 d-HBG核周間隙明顯增寬，糖原蓄積增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)消失。

2.6 硼暴露對肝細(xì)胞焦亡相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

如圖5所示，高硼處理下細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)量與對照組相比呈劑量依賴性增加。相對于對照組，高硼組焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、 IL-18和GSDMD的mRNA相對表達(dá)量顯著增加（Plt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.001），而NLRP3、Caspase-1和IL-1β在高硼組中的蛋白表達(dá)量顯著高于對照組（Plt;0.001，Plt;0.000 1）。在高硼組中，與7 d-HBG相比，14 d-HBG中Caspase-1和IL-18的mRNA相對表達(dá)量顯著升高，同時，14 d-HBG的NLRP3和IL-1β蛋白表達(dá)量顯著高于7 d-HBG（Plt;0.001）。

2.7 免疫組織化學(xué)結(jié)果

通過免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白NLRP3在肝中的定位表達(dá)，結(jié)果如圖6I所示。NLRP3在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，且陽性細(xì)胞呈現(xiàn)為黃棕色。在圖6Ⅰ-A和6I-D觀察到7 d-CG和14 d-CG僅含有少量黃棕色顆粒；然而，當(dāng)飼料中的硼含量增加時，肝中的NLRP3陽性顆粒數(shù)量呈現(xiàn)出隨劑量性增加的趨勢。通過Image-J對圖像進(jìn)行平均光密度（IOD）分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖6II），硼處理組肝細(xì)胞中NLRP3蛋白的定位表達(dá)水平與對照組相比有顯著增加，且這種增強(qiáng)效果與硼的劑量呈依賴性（Plt;0.05），在高硼處理組中，14 d-HBG相較于7 d-HBG，NLRP3陽性表達(dá)率顯著增多（Plt;0.01）。結(jié)果表明，高濃度的硼導(dǎo)致受損肝細(xì)胞中NLRP3蛋白的異常表達(dá)和活化，從而加劇肝損傷。

2.8 免疫熒光結(jié)果

使用免疫熒光法檢測細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白IL-1β在肝細(xì)胞中的定位及定性表達(dá)，結(jié)果如圖7Ⅰ所示，IL-1β的蛋白表達(dá)量呈劑量依賴性上升；同時，在高硼處理組中，相較7 d-HBG，14 d-HBG的IL-1β蛋白表達(dá)量增多。通過Image-J分析軟件對熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖7Ⅱ，可以觀察到硼處理組與對照組之間的平均光密度存在顯著差異，硼處理組的陽性表達(dá)量顯著增加（Plt;0.01）。

3 討 論

硼是在自然環(huán)境廣泛存在的非金屬元素［17］。在自然環(huán)境中，植物通過土壤吸收水溶性的硼，動物則通過飼料及飲水等方式攝取［18］。一旦攝入過量的硼，則會打破其在生物體內(nèi)的代謝平衡，導(dǎo)致硼在體內(nèi)蓄積并造成組織損傷，最終對人和動物的健康造成威脅［19-20］。硼進(jìn)入體內(nèi)后，可以通過血液循環(huán)至全身臟器組織，長期暴露于過量的硼會對機(jī)體的肝、脾和胸腺等器官產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的毒性作用［21-22］。本試驗結(jié)果表明，肝系數(shù)和硼暴露劑量之間存在正相關(guān)關(guān)系，特別在高硼暴露14 d時，肝系數(shù)明顯升高。同時，隨著硼暴露劑量的增加，各組肉雞肝中的硼含量也隨之增加。在正常生理耐受范圍內(nèi)，機(jī)體可通過正常的代謝可把多余的硼排出體外，但當(dāng)添加含量達(dá)到240 mg·kg-1時，過量的硼會大量蓄積在肝中，影響肝正常生理功能，并造成肝細(xì)胞病變，導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生大面積空泡變性，胞核濃縮甚至消失。有研究發(fā)現(xiàn)，BEAS-2B細(xì)胞經(jīng)過環(huán)境污染物暴露后，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)不同程度的腫脹并發(fā)生細(xì)胞焦亡［23-24］。本試驗結(jié)果表明，隨著硼處理的劑量升高，肝細(xì)胞出現(xiàn)線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及核周間隙增寬的發(fā)生。結(jié)果表明，高水平硼暴露會在肝中蓄積，并造成肝細(xì)胞損傷。

細(xì)胞焦亡是一種近來被發(fā)現(xiàn)的新型細(xì)胞死亡方式，其本質(zhì)為一種依賴于Caspase-1的病理性細(xì)胞死亡過程，在細(xì)胞焦亡過程中，Caspase-1起著至關(guān)重要的角色［25-26］。Caspase-1是由一種特殊的炎癥相關(guān)受體（如NLRP1或NLRP3）活化而來，能夠感知并識別損傷信號，例如ATP、PAMP（pathogen-associated molecular patterns）、胞質(zhì)成分等［27］。當(dāng)Caspase-1被活化后，可以形成炎癥復(fù)合體并接觸到相應(yīng)的細(xì)胞膜底物并導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生穿孔，從而使胞內(nèi)物質(zhì)借助穿孔的細(xì)胞膜釋放到胞外，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)［28］。此外，Caspase-1切割底物，進(jìn)而激活一系列的下游效應(yīng)蛋白，這些下游效應(yīng)蛋白協(xié)同作用，引發(fā)細(xì)胞焦亡［29］。Zhang等［30］發(fā)現(xiàn)鎘和鉬可引起鴨腎小管上皮細(xì)胞穿孔，細(xì)胞空泡化，細(xì)胞活力降低，Caspase-1基因及蛋白表達(dá)量增多，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞焦亡。由此可見，重金屬可通過活化Caspase-1產(chǎn)生細(xì)胞毒性，并可誘導(dǎo)發(fā)生依賴于Caspase-1的細(xì)胞焦亡。從本試驗的RT-qPCR和Western blot研究結(jié)果也表明，隨著硼暴露劑量的增加，Caspase-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢，且Caspase-1的表達(dá)水平隨著暴露時間的增加而升高。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡除了由Caspase-1主導(dǎo)之外，細(xì)胞中許多炎癥體同樣參與了細(xì)胞焦亡過程，如NLRP3（NOD樣受體裂解蛋白3）。NLRP3是免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵作用蛋白，它在炎癥小體復(fù)合物中起重要作用。當(dāng)NLRP3受到刺激時，它能夠激活炎癥小體，炎性小體通過激活Caspase-1釋放炎癥介質(zhì)，如IL-1β和IL-18，從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡［24，31］。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同金屬暴露后肝細(xì)胞中的NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)，下游焦亡關(guān)鍵基因IL-1β和IL-18的mRNA及蛋白表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢［32］。在本試驗中，隨著硼暴露濃度的增加，肝細(xì)胞中NLRP3和IL-1β的蛋白表達(dá)水平及分布明顯增加，RT-qPCR和Western blot結(jié)果同樣顯示，NLRP3、IL-1β及IL-18基因及蛋白表達(dá)呈劑量性上調(diào)，隨著硼暴露時間的增加，焦亡相關(guān)mRNA及蛋白水平上調(diào)趨勢更為顯著。本試驗結(jié)果表明，高硼暴露通過觸發(fā)NLRP3炎性小體的生成，進(jìn)而激活Caspase-1，并促進(jìn)IL-1β和IL-18的釋放，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生焦亡，進(jìn)而對肝造成損傷。

4 結(jié) 論

高水平硼暴露會在肝中蓄積，影響肝功能和肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并可通過誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡進(jìn)而造成雞肝細(xì)胞損傷。

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（編輯 白永平）