摘 要： 旨在探究絲膠蛋白對承德無角黑山羊精液冷凍保存效果的影響。本試驗采用假陰道法采集3只健康狀態(tài)良好的承德無角黑山羊精液，隨機分為6組，分別為對照組和在OptiXcell 2稀釋液中添加不同濃度的（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%）絲膠蛋白試驗組，每組設置5個重復，精液稀釋完后進行細管分裝、平衡、冷凍；精液冷凍-解凍后檢測精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整率、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量、線粒體膜電位、ATP含量等指標，并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。結果顯示，承德無角黑山羊精液冷凍稀釋液中添加不同濃度絲膠蛋白均能夠提高凍融后精子質(zhì)量。其中，添加濃度為0.6%絲膠蛋白與其他各濃度相比，可顯著提高精子冷凍-解凍后的精子活力、頂體完整率、質(zhì)膜完整率以及線粒體膜電位和ATP含量，并且使抗氧化酶T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT活性分別提高至（13.61±0.39） mmol·g-1、（26.52±1.30） U·mg-1、（165.45±11.10） U·mg-1、（13.76±0.30） U·mg-1，降低MDA值至（3.15±0.20） μmol·mg-1。綜上，在冷凍稀釋液中添加不同濃度的絲膠蛋白均可提高承德無角黑山羊冷凍精液品質(zhì)，且最適添加濃度為0.6%。

關鍵詞： 絲膠蛋白；承德無角黑山羊；抗氧化劑；精液冷凍

中圖分類號：S827.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4466-09

收稿日期：2024-03-18

基金項目：“十四五”國家重點研發(fā)計劃（2021YFD1200401）；河北省科技計劃資助項目（17226613D）

作者簡介：張文濤（1999-），男，河北邢臺人，碩士生，主要從事動物繁殖調(diào)控研究，E-mail：1165055735@qq.com

*通信作者：李俊杰，主要從事動物繁殖調(diào)控研究，E-mail：lijunjie816@163.com

Effect of Sericin on Cryopreservation of Semen of Chengde Hornless Black Goat

ZHANG" Wentao1， YU" Yang1， QI" Yatian1， ZHAO" Wei2， ZHANG" Hongjun3， TAO" Chenyu1，4， XIA" Wei

1，4， LI" Junjie1，4*

（1.College of Animal Science and Technology， Hebei Agricultural University， Baoding 071000，

China;

2.Agriculture and Rural Bureau of Fengning Manchu Autonomous County， Fengning 068350，

China;

3.Agriculture and Rural Bureau of Weichang Manchu and Mongolian Autonomous County， Weichang

068450，" China;

4.Hebei Technology Innovation Center of Cattle and Sheep Embryo， Baoding 071000，

China）

Abstract：" The aim of this study was to explore the effect of sericin on cryopreservation of semen of Chengde hornless black goat. Semen samples of 3 healthy Chengde hornless black goats were collected by the sham vaginal method and randomly divided into 6 groups： control group and experimental groups with different" sericin concentrations （0.2%， 0.4%， 0.6%， 0.8%， 1%） added to the OptiXcell 2 dilution. Each group was set up with 5 replicates. Sperm motility， acrosome integrity rate， plasma membrane integrity rate， total antioxidant capacity （T-AOC）， glutathione peroxidase （GSH-Px）， superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT） activity， malondialdehyde （MDA） content， mitochondrial membrane potential （MMP） and ATP content were detected after freezing and thawing. The results showed that the addition of different concentrations of sericin to the semen frozen dilution of Chengde hornless black goat could improve the quality of sperm after freezing and thawing. Compared with other concentrations， the addition of 0.6% sericin significantly increased sperm motility， acrosome integrity rate， plasma membrane integrity rate， mitochondrial membrane potential and ATP content after sperm freezing and thawing， and increased the activities of antioxidant enzymes T-AOC， GSH-Px， SOD and CAT to （13.61±0.39） mmol·g-1， （26.52±1.30） U·mg-1， （165.45±11.10） U·mg-1 and （13.76 ±0.30） U·mg-1， respectively. Meanwhile， the MDA value was reduced to （3.15±0.20） μmol·mg-1. In summary， sericin at different concentrations can improve the quality of frozen semen of Chengde hornless black goat， and the most suitable concentration is 0.6%.

Key words： sericin; Chengde hornless black goat; antioxidants; semen freezing

*Corresponding author： LI Junjie， E-mail：lijunjie816@163.com

隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)的快速發(fā)展，人工授精技術已成為一項重要的家畜繁育手段，而精子保存時間和精子質(zhì)量是影響人工授精效率的重要因素［1-2］。精液冷凍保存技術具有保護優(yōu)秀種公畜遺傳資源、加速育種進程、提高種公畜利用效率等優(yōu)點［3-4］。我國對山羊精液冷凍保存技術的研究是從20世紀80年代開始的［5］，然而到目前為止，在大多數(shù)試驗中，山羊精液解凍后的精子活率都不能穩(wěn)定地超過50%［6］。與牛凍精技術相比，山羊凍精技術發(fā)展較慢，技術體系尚未成熟，有待進一步研究。山羊精子在冷凍過程中極易受到氧化應激、冷休克、冰晶等不同因素的影響，這些因素會對精子造成不可逆轉的損害［7-9］。

絲膠蛋白（sericin，SER）是蠶產(chǎn)生的一種富含天冬氨酸和絲氨酸的天然聚合物，其氨基酸側鏈的極性基團使SER具有抗氧化性［10］。研究表明，SER還具有抑制脂質(zhì)過氧化、防止細胞死亡、保護各種類型氧化應激等有益作用［11］。此外，SER已成功應用于多種哺乳動物生殖細胞的低溫保存［12-15］。Yangngam等［16］發(fā)現(xiàn)，在精液冷凍保存中添加0.25%的SER會顯著提高解凍后奶牛精子質(zhì)量并降低脂質(zhì)過氧化對精子的影響，Ratchamak等［17］和Devangana等［18］發(fā)現(xiàn)在冷凍液中添加5 mg·mL-1的SER，可以降低解凍后精液的氧化損傷，從而提高牛凍后精子活力和獲能狀態(tài)。但截至目前SER對山羊精子冷凍保存的研究尚未見報道。因此，本試驗旨在評價SER對山羊精子冷凍-解凍后的質(zhì)量影響，以及探究SER在山羊精液冷凍保存中的抗氧化作用，為生產(chǎn)實踐提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗選取2～3歲，健康、體況相近，且繁殖性能優(yōu)良的種公羊3只；要求飼養(yǎng)條件和采精頻率保持一致，試驗所用的種公羊均由承德市豐寧滿族自治區(qū)元熙牧業(yè)有限公司提供。

1.2 主要試劑及溶液配制

絲膠蛋白（Macklin，60650-88-6）；OptiXcell 2（IMV，026218）；FITC-PNA花生凝集素（Merck，L7381）；DAPI染液（碧云天，C1005）；檸檬酸鈉（Sigma，25114-1 KG）；果糖（Sigma，PHR1002-1 G）；T-AOC檢測試劑盒（碧云天，S0116）；GSH-Px檢測試劑盒（碧云天，S0056）；SOD檢測試劑盒（碧云天，S0109）；CAT活性檢測試劑盒（碧云天，S0051）；MDA檢測試劑盒（碧云天，S0131S）；ATP檢測試劑盒（碧云天，S0026）；線粒體膜電位檢測試劑盒（碧云天，C2006）。

1.2.1 絲膠蛋白濃儲配制

用電子分析天平稱取1 g絲膠蛋白粉，溶解于10 mL OptiXcell 2（冷凍稀釋液，一種基于合成脂質(zhì)體不含動物蛋白的精液填充劑），用磁力攪拌器攪拌5 min后封口，制備成10%的絲膠蛋白作為濃儲，4℃冷藏保存?zhèn)溆?。通過預試驗篩選濃度，最終配制成濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的絲膠蛋白冷凍稀釋工作液。

1.2.2 低滲腫脹液配制

稱取0.25 g檸檬酸鈉、0.45 g果糖，溶于50 mL雙蒸水配制低滲液。

1.2.3 Hancock’s solution試劑的配制

取37%甲醛700 μL于15 mL滅菌離心管中，加入生理鹽水3.5 mL，超純水5.8 mL，震蕩混勻后4 ℃密封冷藏，可保存15 d。

1.3 試驗設計

試驗分為6組，冷凍稀釋液為對照組，設置5個試驗組，即冷凍稀釋液中分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%絲膠蛋白，每組設置5個重復。絲膠蛋白濃度范圍參考牛精液冷凍保存研究結果［13，19］。

1.4 精液采集及處理

以假陰道法采集種公羊精液。隨即對鮮精進行質(zhì)量鑒定，選擇顏色為乳白色、射精量≥0.7 mL、精子活力≥75%、精子密度≥6×108個·mL-1的精液進行后續(xù)試驗。將每次采集的精液混合均勻以消除個體差異。精液稀釋前，冷凍稀釋液提前在38 ℃水浴鍋中恒溫10 min后。再與鑒定合格的鮮精進行等溫稀釋，鮮精與冷凍稀釋液稀釋比例為1∶10。

1.5 精液的冷凍與解凍

將稀釋好的精液裝入0.25 mL的凍精細管中，封口粉封口，做好標記，用紗布包裹放入4 ℃冰箱，平衡2 h，將其平鋪在金屬架上，在距液氮面4 cm處，液氮熏蒸10 min，解凍精液時快速將其從液氮罐中取出，置于38 ℃的溫水中解凍30 s，取出后擦干水珠，將精液移至離心管中38 ℃孵育5 min后進行檢測。

1.6 精子活力檢測

預先把載玻片和蓋玻片放在38℃加熱板上預熱10 min，用移液槍從離心管取15 μL精液滴在載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，選擇壓片均勻的樣品區(qū)域，每個樣品觀察3個視野，注意不同液層的精子狀態(tài)，分別計算呈直線前進運動精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比，并計算精子活力。精子活力=呈直線前進運動精子數(shù)/總精子數(shù)的百分比。

1.7 精子頂體完整率檢測

精子頂體完整率測定采用異硫氰酸熒光素標記的花生凝集素（FITC-PNA）染色法進行測定。同時用DAPI熒光染料對精子細胞核進行染色。取0.5 mL解凍精液于離心管中，300 r·min-1離心5 min，棄上清液；用PBS洗滌2次，每次均需300 r·min-1離心5 min，棄上清液；吸取100 μL PBS重懸精子細胞，加入2 μL（1 mg·mL-1）FITC-PNA避光4 ℃反應10 min；加入2 μL（1 mg·mL-1） DAPI，輕輕混勻，避光、4 ℃反應5 min。樣品放置于冰上，在1 h內(nèi)用熒光顯微鏡檢測。頂體前部呈現(xiàn)出完整的明亮綠色熒光的即為頂體完整的精子；而頂體前部熒光殘缺或無熒光的則為頂體破損的精子。熒光顯微鏡下觀察5個視野，每個視野200個精子以上，計算出頂體完整精子比率，試驗全程避光操作。

1.8 精子質(zhì)膜完整率檢測

采用低滲腫脹（HOST）法檢測精子質(zhì)膜完整率，首先吸取1 mL解凍精液加入9 mL低滲液37 ℃孵育30 min。其次待孵育結束后，取30 μL樣品置于400倍光學顯微鏡下進行觀察，觀察5個視野，每個視野精子數(shù)200以上，最后統(tǒng)計尾部彎曲精子所占總精子數(shù)目的比例。

1.9 抗氧化性檢測指標

T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT活性及MDA含量均使用碧云天有限公司提供的試劑盒測定，具體操作參照試劑盒使用說明。

1.10 ATP含量測定

依照ATP含量檢測試劑盒說明，取適量ATP檢測試劑和ATP檢測試劑稀釋液，按照1∶9的比例進行稀釋配制ATP檢測工作液用于后續(xù)試驗，冰浴上暫時保存；將精液處理后加入適量PBS洗滌2遍，再添加ATP裂解液，冰上裂解后12 000 g、4 ℃離心10 min，取上清待測；在96孔板中加入100 μL ATP檢測工作液，室溫放置3～5 min；在檢測孔中加20 μL樣本或標準品，迅速使用移液器混勻，間隔2 s后使用酶標儀測定Luminometer發(fā)光值。

1.11 線粒體膜電位測定

采用JC-1與PI （Propidium iodide）雙標熒光染色法對精子線粒體膜電位（MMP，Mitochondrial membrane potential）進行檢測分析。提前預熱離心管，用移液槍吸取稀釋好的精液80 μL，迅速加入4 μL JC-1及4 μL PI，將離心管封閉后迅速搖勻，37 ℃避光染色30 min，染色結束后加入8 μL Hancock′s solution溶液終止反應，搖勻后吸取5 μL的混合精液滴于載玻片，熒光倒置顯微鏡下鏡檢，隨機選取四角及中部視野，計數(shù)400個精子，計算高線粒體活性精子占精子總數(shù)的比例。JC-1/PI雙熒光染色結果為：精子尾部前段線粒體鞘呈橙色熒光的精子為高線粒體膜電位精子；呈綠色熒光的為低線粒體膜電位精子。

精子高線粒體膜電位（%）=高線粒體膜電位精子/計算總精子數(shù)×100%。

1.12 數(shù)據(jù)分析

本試驗采用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析，并采用Duncan法進行多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，Plt;0.05表示差異顯著，Pgt;0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 絲膠蛋白對冷凍-解凍后精子活力的影響

分析精液冷凍稀釋液中添加不同濃度絲膠蛋白對凍后精子活力的影響。由表1可知，在承德無角黑山羊精液稀釋液中添加絲膠蛋白的試驗組與對照組相比，精液冷凍-解凍后試驗組的精子活力均高于對照組。添加絲膠蛋白濃度為0.6%時，精液冷凍-解凍后的精子活力可達到54.42%，顯著高于其它試驗組（P＜0.05）。然而，在冷凍稀釋液中添加0.2%和0.8%絲膠蛋白組之間的精子活力差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 絲膠蛋白對冷凍-解凍后精子頂體完整率的影響

精液冷凍稀釋液中添加不同濃度絲膠蛋白對凍后精子頂體完整率的影響見圖1、圖2。結果顯示，在承德無角黑山羊精液稀釋液中添加不同濃度的絲膠蛋白能夠提高精液冷凍-解凍后精子頂體完整率。在冷凍稀釋液中添加絲膠蛋白的試驗組與對照組相比，均可顯著提高精子冷凍-解凍后精子頂體完整率（P＜0.05）。其中，在稀釋液中添加0.6%的絲膠蛋白可以顯著提高精子冷凍-解凍后頂體完整率，顯著高于其它試驗組（P＜0.05）。然而，在冷凍稀釋液中添加0.4%與0.8%的絲膠蛋白比較，精子冷凍-解凍后頂體完整率差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 絲膠蛋白對冷凍-解凍后精子質(zhì)膜完整率的影響

用HOST法檢測冷凍-解凍后的精子質(zhì)膜完整率。紅色箭頭表示質(zhì)膜完整的精子，黃色箭頭表示質(zhì)膜不完整的精子。精液冷凍稀釋液中添加不同濃度絲膠蛋白對凍后精子頂體完整率的影響見圖3、圖4。結果顯示，在承德無角黑山羊精液稀釋液中添加不同濃度的絲膠蛋白均能夠提高精液冷凍-解凍后頂體完整率。其中，在稀釋液中添加0.6%的絲膠蛋白可以顯著提高精子冷凍-解凍后頂體完整率，顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.4 絲膠蛋白對冷凍-解凍后精子抗氧化能力的影響

由表2可知，當絲膠蛋白添加濃度為0.6%時，精子冷凍-解凍后的抗氧化能力效果最佳，其T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT值分別為（13.61±0.39） mmol·g-1、（26.52±1.30） U·mg-1、（165.45±11.10） U·mg-1、（13.76±0.30） U·mg-1，與對照組相比差異顯著（Plt;0.05）；MDA值最低為（3.15±0.20） μmol·mg-1，顯著低于對照組（Plt;0.05）。

2.5 絲膠蛋白對冷凍-解凍后精子ATP含量的影響

在承德無角黑山羊精液冷凍稀釋液中添加不同濃度絲膠蛋白均能夠有效提高冷凍-解凍后精子ATP含量，且精液冷凍-解凍后ATP含量均顯著高于對照組（P＜0.05），其中0.6%絲膠蛋白試驗組的精子冷凍-解凍后ATP含量最高，顯著高于其他組（P＜0.05）；0.4%與0.8%絲膠蛋白處理組的精子冷凍-解凍后ATP含量差異不顯著（P＞0.05）；另外，0.2%與1%絲膠蛋白組的精子冷凍-解凍后ATP含量差異不顯著（P＞0.05）（表3）。

2.6 絲膠蛋白對冷凍-解凍后精子線粒體膜電位的影響

用JC-1與PI雙標熒光染色法檢測精子線粒體膜電位，如圖5所示。紅色箭頭表示高線粒體膜電位精子，黃色箭頭表示低線粒體膜電位精子。根據(jù)圖6可知，在承德無角黑山羊精液冷凍稀釋液中添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%絲膠蛋白均能夠有效提高冷凍-解凍后線粒體膜電位，其中0.6%絲膠蛋白試驗組的精子冷凍-解凍后線粒體膜電位最高，顯著高于其余各組（P＜0.05）；0.4%與0.8%絲膠蛋白處理組的精子冷凍-解凍后線粒體膜電位差異不顯著（P＞0.05）。

3 討 論

精液冷凍解凍-過程中受到氧化應激會產(chǎn)生ROS，引起精子質(zhì)膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，導致精子質(zhì)量下降并影響受胎率［20］。尤其是山羊精子質(zhì)膜因含有高濃度的不飽和脂肪酸，極易受到ROS傷害，導致脂質(zhì)過氧化，質(zhì)量下降［21-22］。而精液冷凍稀釋液中的抗氧化能力不足，無法有效地抵御冷凍過程中的氧化應激［23］。為解決這些問題，研究人員對精液冷凍稀釋液成分進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)向冷凍稀釋液中添加外源抗氧化劑能夠抵御氧化應激，同時還能提高解凍后精液的質(zhì)量，改善精液冷凍保存效果［24-26］。Zou等［27］發(fā)現(xiàn)，在山羊精液保存過程中添加2 mmol·L-1 GSH，不僅能夠提高冷凍-解凍后精子質(zhì)量，還能增強精子的抗氧化能力。此外，Yi等［28］在精液冷凍稀釋液中分別添加5種抗氧化劑（GLP、Mito Q、NAC、SLS、SDS）均能夠提山羊精液冷凍保存效果。

絲膠蛋白作為一種天然的蛋白纖維，具有較強的抗氧化活性及抗凋亡效果，不僅能清除超氧陰離子自由基和羥基自由基，而且能夠激活多種抗氧化系統(tǒng)，保護精子質(zhì)膜免受脂質(zhì)過氧化損害，延長精子存活時間，提高精子質(zhì)量［29-30］。本試驗結果表明，添加0.6%絲膠蛋白更有利于精子保存，提高精子活力，維持精子結構完整性。張達等［13］在公牛精液冷凍保存過程中，將精子保存于添加0.5%絲膠蛋白的冷凍稀釋液中，冷凍-解凍后精子活力及結構完整性顯著高于其它組別。Fan等［31］驗證了絲膠蛋白對羥基、超氧化物和DPPH自由基具有較強的清除能力。MDA是生物膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可以間接反映機體受過氧化的損傷程度，而T-AOC、GSH-Px、SOD和CAT酶活性均可直接反映精子抗氧化能力［32-33］。Kumar等［34］研究發(fā)現(xiàn)，在水牛精液冷凍保存過程中，添加0.25%和0.5%的絲膠蛋白到冷凍稀釋液中，能夠提高精子抗氧化水平。本試驗結果表明，山羊精液在冷凍-解凍后的抗氧化能力T-AOC、GSH-Px、SOD和CAT活性與對照組相比顯著升高（Plt;0.05），MDA水平與對照組相比顯著降低（Plt;0.05）。但隨著絲膠蛋白濃度的增加，山羊精液在冷凍-解凍后的抗氧化能力呈先上升后下降趨勢，其原因可能是過度的抗氧化劑會破壞自由基和抗氧化劑之間的平衡，這種平衡的絮亂可能還會進一步影響到精子細胞獲能和頂體反應［35-36］。

精子的能量代謝需要通過線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生大量的ATP，才能維持精子的正常能量代謝。但是，在精液冷凍保存過程中，由于精子線粒體膜電位的下降，會使精卵結合過程中產(chǎn)生ATP所需要的能量不足，導致受精能力下降［37-38］。Poali等［39］研究表明，精子高線粒體膜電位代表精子的正常能量代謝，而精子能量代謝需要ATP來維持，進而使精子活力保持較高水平，因此線粒體膜電位與ATP含量和精子活力呈正相關。Ampawong等［40］研究發(fā)現(xiàn)，絲膠蛋白能夠通過線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP調(diào)節(jié)DRP1和caspase-3活性，改善線粒體結構。本試驗結果表明，在冷凍稀釋液中添加0.6%絲膠蛋可顯著提高精液中精子ATP水平及增加精子高線粒體膜電位比例。但在冷凍稀釋液中添加濃度0.8%和1%絲膠蛋白后線粒體膜電位和ATP呈下降趨勢。其原因可能是絲膠蛋白粘稠度的增加，會導致精子細胞內(nèi)外液之間滲透壓增大，細胞膜的滲透平衡受到破壞，從而導致精子細胞高滲性脫水［41］。

4 結 論

綜上所述，在承德無角黑山羊精液的冷凍稀釋液中添加絲膠蛋白能夠顯著提高精子活力，維持細胞結構的完整性，并增強其抗氧化能力和能量代謝水平，可為精子冷凍保存提供一種有效的方法，并在動物繁殖和生殖技術領域具有重要的應用價值。在本試驗條件下，冷凍稀釋液中添加0.6%的絲膠蛋白對精液冷凍保存有更好的保護作用。

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（編輯 郭云雁）