摘 要： 塞內(nèi)卡病毒A （Senecavirus A， SVA）在復(fù)制過程中可形成完整病毒和空衣殼，它們的分離條件和抗體應(yīng)答差異目前還是未知的。本研究利用鹽酸胍形成SVA空衣殼，通過優(yōu)化不同的密度梯度、介質(zhì)、轉(zhuǎn)速、時(shí)間條件進(jìn)行超速離心，獲得分離SVA完整病毒和空衣殼的最佳條件，并按 SVA完整病毒12.5 μg·只-1，空衣殼12.5 μg·只-1肌肉注射免疫BALB/c小鼠，免疫后1～7周檢測特異性抗體和中和抗體。結(jié)果顯示，SVA的MOI=1時(shí)感染細(xì)胞2 h加入100 mmol·L-1鹽酸胍可以使SVA完整病毒全部形成空衣殼；在10%～50%氯化銫，36 000 r·min-1，離心2.5 h是區(qū)分SVA完整病毒和空衣殼的最佳條件；而且SVA完整病毒與空衣殼誘導(dǎo)小鼠的特異性抗體和中和抗體水平無顯著差異（P=ns）。本研究為塞內(nèi)卡病毒A完整病毒和空衣殼的分離純化、重組SVA 病毒樣顆粒疫苗的開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞： 塞內(nèi)卡病毒A；完整病毒；空衣殼；分離條件優(yōu)化；免疫原性

中圖分類號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4562-09

收稿日期：2023-12-06

基金項(xiàng)目：國家成都農(nóng)業(yè)科技中心地方財(cái)政專項(xiàng)（NASC2024KR06）；蘭州市人才創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目（2023-RC-3）

作者簡介：李 梅（1996-），女，河南信陽人，碩士生，主要從事動(dòng)物病毒病研究，E-mail： 1532373974@qq.com

*通信作者：孫世琪，主要從事動(dòng)物病毒病研究，E-mail： sunshiqi@caas.cn

Isolation， Purification and Immunogenicity Evaluation of Senecavirus A Intact Particle

and Empty Capsid

LI" Mei， MU" Suyu， DONG" Hu， LI" Shuo， PAN" Songjia， GUO" Huichen， SUN" Shiqi*

（State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， Lanzhou Institute of Veterinary

Medicine， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730046，" China）

Abstract：" Senecavirus A （SVA） has the ability to form intact virions and empty capsids during replication; however， the conditions for isolating them and their differences in antibody response are still unknown. In this study， we utilized guanidine hydrochloride to generate SVA empty capsids and determined the optimal conditions for separating SVA intact virions and empty capsids. This was achieved through ultracentrifugation using different density gradients， media， rotation rates， and durations. Subsequently， SVA intact virions and empty capsids were intramuscularly immunized into BALB/c mice at a dosage of 12.5 μg per mouse. Specific and neutralizing antibodies were then monitored 1-7 weeks post-immunization. The findings indicated that the addition of 100 mmol·L-1 guanidine HCl for 2 hours in infected cells at MOI=1 of SVA resulted in the complete formation of empty capsids. The most effective method for distinguishing SVA intact virions from empty capsids was centrifugation at 36 000 r·min-1 for 2.5 hours， using a cesium chloride gradient ranging from 10% to 50%. Furthermore， the specific and neutralizing antibody levels for SVA intact virions were comparable to those of empty capsids. This study provides a new reference for the isolation and purification of the complete and empty capsid of Seneca virus A， as well as for the development of recombinant SVA virus-like particle vaccines.

Key words： Senecavirus A; intact particle; empty capsid; separation conditions; immunogenicity

*Corresponding author：" SUN Shiqi， E-mail： sunshiqi@caas.cn

塞內(nèi)卡病毒A（Senecavirus A， SVA）是小RNA病毒科塞內(nèi)卡病毒屬的單股正鏈RNA病毒［1］。它與口蹄疫、豬水皰病和豬水皰性口炎引起的豬臨床癥狀相似，自2008年以來，SVA的感染病例已被多個(gè)國家報(bào)道［2-7］，引起養(yǎng)豬業(yè)高度關(guān)注。

目前，SVA的滅活［8］和病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）疫苗［9］已被報(bào)道，50 μg的VLPs和2 μg滅活SVA均可提供100%的保護(hù)。但是滅活的SVA在使用蔗糖密度梯度離心時(shí)可發(fā)現(xiàn)完整病毒和空衣殼并存的現(xiàn)象，這和其他小RNA病毒科成員一樣，例如口蹄疫病毒［10］、甲肝病毒［11］、腸道病毒［12］。在FMDV中，由于75S（低于pH 6.3）相對(duì)于146S（低于pH 6.0）更容易裂解為12S，從而導(dǎo)致免疫失敗，因此146S的含量是其疫苗效力評(píng)價(jià)中最關(guān)鍵的成分［13］。而在SVA中，Strauss等［14］發(fā)現(xiàn)SVA完整病毒（低于pH 5.5裂解為五聚體）相比空衣殼（低于pH 6.0裂解為五聚體）具有更高的酸穩(wěn)定性，但SVA完整病毒和空衣殼作為疫苗抗原的免疫差異還未被研究。病毒純化是病毒學(xué)中的一項(xiàng)重要技術(shù)，而密度梯度離心技術(shù)是目前最常用的一種［15］。病毒不同成分的最佳分離條件需要探索合適的介質(zhì)、轉(zhuǎn)速、時(shí)間和梯度［16］。而SVA完整病毒和空衣殼合適的分離條件還未被探索。

鹽酸胍在脊髓灰質(zhì)炎病毒和FMDV中已被證明可以促進(jìn)空衣殼形成［17-18］。Brown等［10］發(fā)現(xiàn)鹽酸胍對(duì)口蹄疫病毒的復(fù)制具有抑制作用。Jacobson和Baltimore［17］發(fā)現(xiàn)鹽酸胍抑制新合成的RNA進(jìn)入脊髓灰質(zhì)炎病毒內(nèi)部。陳晶等［18］發(fā)現(xiàn)適宜的鹽酸胍濃度會(huì)促進(jìn)產(chǎn)生口蹄疫病毒75S含量。

因此，本研究通過鹽酸胍處理SVA感染的IBRS-2細(xì)胞制備空衣殼，未處理制備完整病毒。隨后探索最佳的介質(zhì)、轉(zhuǎn)速、時(shí)間和介質(zhì)梯度，以期為SVA病毒不同成分的分離純化提供技術(shù)指導(dǎo)，同時(shí)研究天然SVA完整病毒和空衣殼在小鼠免疫后的抗體應(yīng)答差異，為重組SVA VLPs疫苗的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒培養(yǎng)、細(xì)胞及試驗(yàn)動(dòng)物

SVA病毒株CH-HB-2017（GenBank 登錄號(hào)：MN922286［19］和豬腎細(xì)胞系（IBRS-2）在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫防控技術(shù)團(tuán)隊(duì)保存。IBRS-2細(xì)胞用10%胎牛血清和1%雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%時(shí)，按MOI=1接種SVA病毒，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生90%的病變效應(yīng)（cytopathic effect， CPE）時(shí)將其凍于-80℃冰箱。BALB/c小鼠由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑

蔗糖、脫脂奶粉、抗生素和G418粉末購自Amresco公司。磷鎢酸、氯化銫購自索萊寶公司。蛋白Marker購自Fermentas公司。高糖DMEM購自Sigma公司。300目銅網(wǎng)購自中科鏡儀。Fetal Bovine Serum（FBS）購自Biological Industries公司。

1.3 鹽酸胍處理IBRS-2細(xì)胞制備SVA空衣殼

1.3.1 鹽酸胍對(duì)IBRS-2細(xì)胞毒性檢測

按照100 μL（106 cell·mL-1）細(xì)胞懸液加入96孔板中，在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將鹽酸胍按照100、50、20、10、5 mmol·L-1的終濃度加入板中，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h；分別加入10 μL·孔-1的四氮咪藍(lán)鹽化合物，繼續(xù)放置在培養(yǎng)箱中3.5 h，酶標(biāo)儀檢測490 nm的吸光值。

1.3.2 SVA空衣殼的制備

按照先前的研究［17］，SVA感染IBRS-2細(xì)胞后2 h加入100 mmol·L-1的鹽酸胍。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組未加鹽酸胍的SVA，感染至10 h后收獲病毒。

1.4 TCID50檢測

SVA病毒在1.5 mL離心管中依次稀釋10-1～10-9，按照100 μL·孔-1的量加到96孔板中，每個(gè)稀釋度做8個(gè)重復(fù)；待稀釋的病毒液均勻分散在96孔板之后，按照100 μL·孔-1的量加入豬腎細(xì)胞IBRS-2（約1.5×106·mL-1）；混勻后將96孔板置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，期間判定細(xì)胞病變的程度及病變的孔數(shù)，并用Reed-Muench法計(jì)算SVA TCID50。

1.5 SVA的滅活、檢測和濃縮

在上述制備的完整病毒和空衣殼中加入二乙烯亞胺滅活劑，30℃，150 r·min-1，滅活28 h后，添加50%硫代硫酸鈉終止，隨后將完全失活的抗原在IBRS-2細(xì)胞中孵育并傳代3次，并觀察CPE確定滅活完全。此外，將獲取的滅活后200 mL病毒液通過6 000 r·min-1離心30 min，取上清在Vivaflow?200 MWCO 100kDa （Sartorius， German）中濃縮至40 mL，10 000 r·min-1離心30 min，取上清并使用超速離心機(jī)XPN-100（Beakman， USA）36 000 r·min-1離心2 h，在PBS緩沖液中重懸沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 BCA法檢測SVA抗原濃度

BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司（貨號(hào)：A55864），按照其說明進(jìn)行完整病毒和空衣殼抗原的蛋白濃度測定。

1.7 蔗糖、酒石酸鉀和氯化銫密度梯度離心純化SVA

利用Gradient StationTM梯度制備儀（BioComp，Canada）制成15%～50%、10%～50%、15%～45%連續(xù)蔗糖、酒石酸鉀和氯化銫密度梯度，總體積為10 mL。使用超速冷凍離心機(jī)4℃下29 600、34 200、36 000或38 000 r·min-1離心2、2.5、3或3.5 h，從超離管中由上至下取樣至1.5 mL EP 管中，每管0.5 mL，分為20個(gè)管的樣本，4 ℃保存。

1.8 透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy， TEM）觀察

為了觀察顆粒形態(tài)，將來自峰部分的樣品吸附到300目的銅網(wǎng)中（中晶科儀），并用2%磷鎢酸（pH 7.4）染色1 min。通過透射電子顯微鏡（H-7100FA，Hitachi）在100 kV的加速電壓下觀察網(wǎng)格。

1.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

將峰值管樣品變性制樣，10 μL·孔-1加入SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，并使用考馬斯亮藍(lán)染色檢測病毒條帶。

1.10 動(dòng)物免疫試驗(yàn)

將15只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，按SVA完整病毒組12.5 μg·只-1、SVA空衣殼組12.5 μg·只-1和PBS陰性對(duì)照組進(jìn)行肌肉注射免疫。免疫前及免疫后1～7周采集小鼠血清。

1.11 特異性抗體試驗(yàn)

用pH 9.6的碳酸鹽包被溶液將SVA稀釋至1 μg·mL-1，并在4℃下以每孔100 μL包被在96孔ELISA板（Corning?，USA）上過夜。PBST洗滌3次，用PBS稀釋的4%脫脂奶粉封閉，200 μL·孔-1，37℃孵育1 h。PBST洗滌3次，加入連續(xù)2倍稀釋的血清（100 μL·孔-1）作為試驗(yàn)組，加入FMDV血清或培養(yǎng)基作為對(duì)照組，在37 ℃下孵育1 h。PBST清洗3次后，用PBS按照1∶10 000稀釋抗小鼠IgG-HRP抗體（Sigma，USA）并加入試驗(yàn)孔中，在37℃下孵育1 h。PBST洗滌3次后，添加3，3′，5′，5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物（Sigma，USA），并使用50 μL的2 mol·L-1硫酸終止反應(yīng)。通過酶標(biāo)儀（Biotek，USA）讀取OD450 nm吸光值

1.12 細(xì)胞中和試驗(yàn)

血清樣品在56 ℃下滅活，從1∶4開始連續(xù)稀釋2倍，然后與100 TCID50 CH-HuB-2017病毒在37 ℃下混合1 h。之后，將血清病毒混合物轉(zhuǎn)移到接種有IBRS-2細(xì)胞的96孔板中。在37 ℃下孵育1 h后，棄去上清液，用新鮮的2%FBS-DMEM培養(yǎng)基代替。培養(yǎng)72 h后，觀察、記錄CPE，并用于計(jì)算每個(gè)樣品的中和抗體滴度。

2 結(jié) 果

2.1 鹽酸胍對(duì)細(xì)胞毒性測定

將PBS設(shè)成100%，在5、10、20、50、100 mmol·L-1鹽酸胍處理IBRS-2細(xì)胞24、48、72 h時(shí)，細(xì)胞存活率大約在100%，均無差異（圖1）。這些結(jié)果說明5～100 mmol·L-1鹽酸胍對(duì)IBRS-2無毒性。

2.2 鹽酸胍處理細(xì)胞后感染性分析

空衣殼是不含有病毒核酸的結(jié)構(gòu)蛋白，不具備感染IBRS-2細(xì)胞的能力。通過對(duì)SVA感染細(xì)胞2 h時(shí)進(jìn)行100 mmol·L-1鹽酸胍處理，在感染后10 h時(shí)，作者進(jìn)一步檢測了其TCID50以反映鹽酸胍處理和未處理的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸胍處理后產(chǎn)生的TCID50=10-7.79、10-7.73、10-7.53；而空衣殼對(duì)應(yīng)的TCID50=10-2.24、10-2.33、10-2.28。以上結(jié)果說明制備的空衣殼中只含有少量完整病毒，大部分為不具備感染性的空衣殼結(jié)構(gòu)。

2.3 鹽酸胍未處理的SVA病毒的純化及電鏡觀察

通過15%～45%蔗糖密度梯度離心后，在13管處出現(xiàn)OD 260 nm和OD 280 nm峰值（圖2A），峰管樣品電鏡觀察SVA呈整齊的晶格狀排列，圓形，大小" 約25 nm（圖2 B），而且SDS-PAGE結(jié)果與SVA VP2、VP3、VP1大小一致（圖2 C）。這些結(jié)果說明成功獲取SVA完整病毒。

2.4 鹽酸胍處理后的SVA純化及電鏡觀察

通過對(duì)SVA感染細(xì)胞2 h時(shí)經(jīng)100 mmol·L-1鹽酸胍處理的純化樣品進(jìn)行透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在13管處出現(xiàn)OD280 nm峰值（圖3A），并通過TEM觀察到病毒的空衣殼（圖3B）。進(jìn)一步進(jìn)行SDS-PAGE鑒定（圖3C），與 SVA VP2、VP3、VP1大小一致。結(jié)果說明SVA感染2 h加入100 mmol·L-1鹽酸胍可以使大多數(shù)病毒形成空衣殼結(jié)構(gòu)，但殘留小部分具有核酸的病毒顆粒（圖3B），這和“2.2”中具備微弱感染性相一致。

2.5 SVA完整病毒及空衣殼最佳分離方法建立結(jié)果

2.5.1 不同密度梯度條件下超速離心的結(jié)果

在使用蔗糖密度梯度為15%～45%時(shí)，不能分離病毒的完整病毒和空衣殼（圖4A）。而蔗糖密度梯度為10%～50%相比15%～50%分離SVA完整病毒和空衣殼更好（圖4B和C），分別在13管和14管處出現(xiàn)峰值（圖4B）。

2.5.2 不同介質(zhì)條件下超速離心的結(jié)果

通過氯化銫、酒石酸鉀、蔗糖等介質(zhì)進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，氯化銫可以更好地分離SVA完整病毒及空衣殼，分別在13和16管處出現(xiàn)峰值（圖5A）。酒石酸鉀分離SVA完整病毒及空衣殼均在17管處（圖5B），蔗糖密度梯度下分離完整病毒及空衣殼分別在13和14管處（圖5C）。結(jié)果表明氯化銫是分離SVA完整病毒及空衣殼的最佳介質(zhì)。

2.5.3 不同轉(zhuǎn)速條件下超速離心的結(jié)果

通過設(shè)置29 600、34 200、36 000、38 000 r·min-1 4個(gè)轉(zhuǎn)速，結(jié)果顯示36 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下分離SVA完整病毒及空衣殼效果最好，分別在13和16管處出現(xiàn)峰值（圖6C），在29 600、34 200 r·min-1轉(zhuǎn)速下，SVA完整病毒及空衣殼分離程度相對(duì)較小（圖6A和B），38 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下，SVA空衣殼在19管處出現(xiàn)峰值，而SVA完整病毒OD280 nm一直處于上升趨勢，無法確定SVA完整病毒及空衣殼的具體位置（圖6D）。說明分離SVA完整病毒及空衣殼的最佳轉(zhuǎn)速為36 000 r·min-1（圖6C）。

2.5.4 不同離心時(shí)間條件下超速離心的結(jié)果

通過設(shè)置2、2.5、3和3.5 h 4個(gè)離心時(shí)間（圖7），發(fā)現(xiàn)在10%～50%氯化銫 36 000 r·min-1條件下，離心2.5 h 時(shí)SVA完整病毒和空衣殼即可完全分離，分別在13 管和16管處出現(xiàn)峰值（圖7B），在離心2 h后區(qū)分度低于2.5 h（圖7A），峰值分別在15和16管，在離心3 h時(shí)，SVA完整病毒及空衣殼峰值出現(xiàn)在同一處第18管（圖7C），離心3.5 h時(shí)，SVA空衣殼在18管處出現(xiàn)峰值，但完整病毒OD值一直趨于上升，完整病毒峰值不確定（圖7D）。說明分離SVA完整病毒及空衣殼的最佳離心時(shí)間為2.5 h。

2.6 SVA完整病毒和空衣殼的免疫原性評(píng)價(jià)

將純化并滅活后的SVA完整病毒及空衣殼分別免疫小鼠。檢測1～7周小鼠血清的特異性抗體和中和抗體，結(jié)果顯示SVA完整病毒與空衣殼免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體和中和抗體均無明顯差異（圖8A、B），至少可維持7周的高抗體水平。說明SVA完整病毒與空衣殼在抗體應(yīng)答水平上無差異。

3 討 論

SVA是新發(fā)病毒，疫苗是防控該疾病的最佳武器，但疫苗質(zhì)量控制和免疫原性研究相對(duì)滯后，本文利用鹽酸胍制備了空衣殼，作為超速離心技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，從而篩選出最佳的分離完整病毒和空衣殼的條件，并將二者免疫小鼠研究其免疫原性的差異，該研究將對(duì)SVA滅活疫苗的質(zhì)量控制提供更精確的標(biāo)準(zhǔn)。

SVA在感染細(xì)胞過程中形成完整的病毒及空衣殼，但空衣殼含量較低難以實(shí)現(xiàn)分離純化，故引用陳晶等［18］對(duì)鹽酸胍對(duì)口蹄疫病毒75S的形成具有促進(jìn)作用作為背景，進(jìn)行條件優(yōu)化后，當(dāng)SVA感染2 h時(shí)加入100 mmol·L-1的鹽酸胍形成全部空衣殼（圖3）。目前小RNA病毒純化方式有離子交換色譜法［20］、PEG沉淀法［21］、超濾補(bǔ)液法［22］、GEM-PA表面展示系統(tǒng)［23］和密度梯度超速離心［24］等。密度梯度離心具有適用范圍廣，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等特征而被廣泛使用，其中氯化銫與蔗糖和酒石酸鉀相比具有非常高的密度［25-26］。而本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在SVA完整病毒和空衣殼的分離中氯化銫具有良好的區(qū)分度（圖4）。

目前尚無商品化疫苗，但油佐劑滅活候選疫苗和SVA VLPs疫苗已被報(bào)道［8，9，27］。而Mu等［9］研究發(fā)現(xiàn)SVA VLPs疫苗免疫后中和抗體和特異性抗體水平與滅活苗相當(dāng)，同樣，作者也發(fā)現(xiàn)完整病毒和空衣殼免疫小鼠可以產(chǎn)生特異性抗體和中和抗體滴度水平一致（圖5）。但滅活疫苗相比于VLPs疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的IFN-γ應(yīng)答。而細(xì)胞免疫的產(chǎn)生可能會(huì)影響疫苗的早期和持久性保護(hù)［28］。這可能和完整病毒中更高的酸穩(wěn)定性有關(guān)，更容易發(fā)揮溶酶體逃逸從而啟動(dòng)交叉遞呈誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的產(chǎn)生［29］，因此SVA完整病毒可能更有利于提升疫苗的質(zhì)量。

4 結(jié) 論

本研究通過鹽酸胍處理形成SVA空衣殼，并經(jīng)超速離心技術(shù)篩選出在10%～50%氯化銫，36 000 r·min-1，離心2.5 h是區(qū)分SVA完整病毒和空衣殼的最佳條件，得到的兩種顆粒以同劑量免疫小鼠后，發(fā)現(xiàn)完整病毒顆粒具有更好的免疫原性，尤其在細(xì)胞免疫中。這些結(jié)果為重組SVA VLPs疫苗的開發(fā)提供參考。

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（編輯 白永平）