摘 要：通過環(huán)境DNA技術(shù)來研究長江江津段魚類資源分布，為長江江津段河流管理提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。于2021年6月在該江段布設(shè)6個斷面，通過水樣采集、環(huán)境DNA捕獲及注釋分析來檢測魚類的多樣性組成。研究結(jié)果顯示：長江江津段共檢測出魚類37種，分屬于4目10科32屬，包括2種國家級保護(hù)魚類、14種長江上游特有魚類、2種重慶市重點保護(hù)魚類、3種外來魚類。通過物種相對序列豐度分析發(fā)現(xiàn)，吻鮈（Rhinogobio typus）、子陵吻鰕虎魚（Rhinogobius giurinus）和銅魚（Coreius heterodon）的相對豐度較高；基于序列豐度的α和β多樣性分析結(jié)果表明，各斷面魚類組成和多樣性呈現(xiàn)出一定的差異。與最近的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)相比，環(huán)境DNA技術(shù)與傳統(tǒng)方法得到的結(jié)果相似，表明環(huán)境DNA技術(shù)可以被作為一項有效的輔助手段，用以迅速了解長江魚種的種類數(shù)量及其地理分布情況。

關(guān)鍵詞：環(huán)境DNA；魚類多樣性；魚類監(jiān)測；魚類資源分布；長江江津段

中圖分類號：S932.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-5072（2024）06-0579-08

魚類資源多樣性作為河流生物多樣性必不可少的部分，對保持水生態(tài)系統(tǒng)平衡與社會可持續(xù)發(fā)展具有極其重要的意義［1］。近年來，由于人類過度地開發(fā)和利用自然資源，導(dǎo)致魚類資源多樣性嚴(yán)重降低［2］。2005年，為保護(hù)長江上游珍稀特有魚類多樣性，國務(wù)院批準(zhǔn)設(shè)立了長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護(hù)區(qū)（以下簡稱“保護(hù)區(qū)”）［3］。江津段位于保護(hù)區(qū)下游江段，擁有顯著的生態(tài)功能，不僅是保護(hù)區(qū)內(nèi)珍稀特有魚類的關(guān)鍵棲息地，同時也是長江下游漁業(yè)資源增殖的重要通道。江津段的重要性不僅體現(xiàn)在維護(hù)我國淡水魚類的遺傳資源上，同時對促進(jìn)魚類多樣性具有重要意義［4］。

為保護(hù)長江流域魚類資源多樣性，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2020年對長江流域開展“十年禁漁”。漁業(yè)資源的恢復(fù)及多樣性評價需要常年持續(xù)性的監(jiān)測，在當(dāng)前長江大保護(hù)的背景下，傳統(tǒng)的漁獲物調(diào)查監(jiān)測不僅對漁業(yè)資源有一定的干擾和損害，而且客觀條件受限也難以開展［5-6］。環(huán)境DNA宏條形碼（Environmental DNA Metabarcoding）技術(shù)是一種從環(huán)境樣本中直接提取總DNA，利用特異性或通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），通過高通量測序和生物信息學(xué)分析，實現(xiàn)對生物多樣性的群落水平鑒定［7-8］。2008年，F(xiàn)icetola等［9］首次將環(huán)境DNA技術(shù)應(yīng)用于淡水水生生物種群研究tAVAUVC+yHyy3NDod1mpgQ==；趙夢迪［10］通過使用Miya等［11］設(shè)計出了12S rRNA作為探針，深入探討了黃海近海區(qū)域內(nèi)的魚類群體結(jié)構(gòu)，總計發(fā)現(xiàn)了超過571種魚類，其中包括許多常見的或者有歷史記載的品種；為了建立一套針對長江魚類的環(huán)境DNA檢測系統(tǒng)，徐念和常劍波［12］在長江的中下游河段設(shè)立了共計24個取樣站點，并成功識別出了15種不同類型的魚類。這些研究不斷推動著環(huán)境DNA技術(shù)在水生生態(tài)系統(tǒng)生物監(jiān)測中的應(yīng)用［13-14］，為水生生物多樣性研究和監(jiān)測提供了一種新思路。

近年來，通過刺網(wǎng)、撒網(wǎng)等傳統(tǒng)捕撈監(jiān)測的結(jié)果表明［3-4，15-17］，長江江津段漁業(yè)資源已嚴(yán)重衰退，一些珍稀特有魚類種群數(shù)量急劇下降，部分經(jīng)濟(jì)魚類資源趨于枯竭［18-19］。相較于傳統(tǒng)調(diào)查方法，環(huán)境DNA宏條形碼具有檢測靈敏度高和對生態(tài)系統(tǒng)干擾低等優(yōu)勢，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)監(jiān)測的缺陷，在生物多樣性評估方面具有極大的應(yīng)用潛力［20］。本研究以長江江津段為調(diào)查區(qū)域，運(yùn)用環(huán)境DNA技術(shù)對長江魚類資源的多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行評估，探索適用于長江魚類資源監(jiān)測和保護(hù)的新方法，為后續(xù)評估長江“十年禁漁”效果提供相關(guān)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣斷面設(shè)置與水樣采集

長江江津段位于重慶市江津區(qū)石蟆鎮(zhèn)與珞璜鎮(zhèn)之間。綜合長江江津段地理環(huán)境和魚類分布的歷史資料，本研究于2021年6月在該江段的三拋河、松溉、高占灘、丁家沱、綦江口和馬夫沱共6個采樣斷面（圖1）進(jìn)行了1次采樣。水樣采集過程中，利用采水器從每個采樣斷面的左、中、右江段的水體共采集6 L混合后，平均分裝于3個用10%漂白粉溶液消毒的聚乙烯瓶中［21］。將收集到的水樣立即冷藏儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 環(huán)境DNA的提取及測序

1.2.1 環(huán)境DNA的富集

在24 h內(nèi)，使用真空泵將采集的水樣抽濾到0.45 μm的混合纖維素濾膜（Whatman，UK）上，以富集環(huán)境DNA。每個樣品在抽濾前后都需要對器材進(jìn)行消毒，以防止樣品之間的交叉污染。在每個樣品抽濾時，同時設(shè)置一個陰性對照以評估是否存在外源DNA污染［22］。最后，將濾膜放置在-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 環(huán)境DNA的提取

使用Qiagen PowerWater DNA Isolation Kits從水樣濾膜提取總DNA，然后通過1%凝膠電泳質(zhì)檢［22］。提取的DNA樣品保存在-20 ℃。

1.2.3 環(huán)境DNA擴(kuò)增及建庫測序

使用引物mlCOIintF［23］對樣品線粒體CO I基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度約為313 bp。PCR的擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)［24］，樣本檢測采用舒璐等［25］的方法，純化后的最終產(chǎn)物通過Illumina NovaSeq 6000測序平臺進(jìn)行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過文獻(xiàn)資料整理出長江上游淡水魚類名錄［26-27］。從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）和BOLD（http：//www.boldsystems.org）下載長江魚類的CO I基因序列（約3000條），構(gòu)建自建數(shù)據(jù)庫用于后續(xù)物種注釋，然后深入研究各個樣品間的種群結(jié)構(gòu)差異或相似性［28］。本研究基于OTU聚類結(jié)果，進(jìn)行了物種組成、α多樣性和β多樣性分析。在物種組成分析中，去除非魚類數(shù)據(jù)后，篩選出identity值≥97%、E-value≤10-5的魚類OTU，再將同一物種的OTU進(jìn)行合并。在Excel中統(tǒng)計各樣本中每種魚的有效序列數(shù)，并完善分類學(xué)信息，最后通過R語言繪制魚類組成柱狀圖。α多樣性分析中，選取Chao1指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)及覆蓋度指數(shù)，分別反映群落豐富度、群落多樣性及群落覆蓋度。β多樣性分析基于Bray-Curtis距離矩陣進(jìn)行PCoA分析，探索樣本間的群落組成差異性或相似性。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增及測序

對所有樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示條帶清晰，空白對照未出現(xiàn)目的條帶（圖2）。將18個樣本進(jìn)行高通量測序，共得到10 847 274條有效序列，各樣本有效序列數(shù)為502 363～741 454條，平均長度為314 bp。

2.2 OTU聚類和物種注釋

按序列相似性≥97%聚類，6個斷面共獲得33 567個代表性O(shè)TU序列。將獲得的OTU在自建數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對。

2.3 魚類物種組成

本研究基于環(huán)境DNA技術(shù)共檢測出魚類37種，隸屬于4目10科32屬（表1），其中包括達(dá)氏鱘（Acipenser dabryanus）和巖原鯉（Procypris rabaudi）2種國家級保護(hù)魚類，14種長江上游特有魚類，2種重慶市重點保護(hù)魚類。所有魚類的分類里，以鯉形目（Cypriniformes）的數(shù)量最為豐富，共有24種，占總數(shù)的64.5%；其次是鲇形目（Siluriformes），有7種，占18.9%；鱸形目（Perciformes）有4種，占10.8%。從科的角度來看，鯉科（Cyprinidae）魚類最多，達(dá)19種，占51.3%；其次是鲿科（Bagridae），共6種，占16.2%；鰍科（Cobitidae）僅有3種，占8.1%；其他各個科的物種數(shù)量都相對較低（1～2種）。另外，本次調(diào)查檢測出3種外來魚類，分別是尼羅羅非魚（O.niloticus）、莫桑比克羅非魚（O.mossambicu）和施氏鱘（A.schrenckii）。

此外，通過表1中的物種序列數(shù)數(shù)據(jù)可知，本次調(diào)查從6個斷面共獲得已知物種序列45 023條，其中綦江口獲得的已知物種序列數(shù)最少，為166條；而松溉獲得的已知物種序列數(shù)最多，為30 892條。草魚（Ctenopharyngodon idellus）和擬緣（Liobagrus marginatoides）在各個斷面均被檢測到，而其余35種魚類僅在個別斷面中被檢測到。

各斷面相對序列豐度的分析結(jié)果顯示（圖3），在屬水平上，不同斷面的魚類組成結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一定的差異，其中高占灘、馬夫沱和三拋河斷面均為吻鮈屬（Rhinogobio）相對序列豐度最高，而綦江口、松溉和丁家沱分別以吻鰕虎魚屬（Rhinogobius）、羅非魚屬（Oreochromis）和直口鯪屬（Rectoris）的相對序列豐度最高。種水平上，吻鮈（Rhinogobio typus）、子陵吻鰕虎魚（Rhinogobius giurinus）和銅魚（Coreius heterodon）在整個研究江段呈現(xiàn)出較高的物種序列豐度。

2.4 魚類多樣性分析

α多樣性分析結(jié)果顯示，Chao1指數(shù)范圍為13～65，Simpson指數(shù)范圍為0.1986～0.4201，Shannon-Wiener指數(shù)范圍為1.49～2.14（表2）。各斷面魚類物種α多樣性指數(shù)存在一定差異，三拋河和松溉斷面具有較高的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，而高占灘斷面具有較高的Simpson指數(shù)。此外，各樣本的覆蓋度在0.981 9～1.000 0，表明測序基本上涵蓋了所有的OTU數(shù)據(jù)。

基于序列豐度的PCoA分析表明，各斷面間魚類群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一定差異性（圖4）。其中高占灘和三拋河、馬夫沱和丁家沱分別具有相似的魚類多樣性，而綦江口和松溉具有明顯不同于其他斷面的魚類組成。

3 討 論

3.1 基于環(huán)境DNA技術(shù)的長江江津段魚類組成

基于文獻(xiàn)資料整理，近十年來在江津段通過刺網(wǎng)、撒網(wǎng)等傳統(tǒng)方法共調(diào)查到魚類103種［3-4，15-17］，其中4種國家級保護(hù)魚類，21種長江上游特有魚類，5種重慶市重點保護(hù)魚類。從魚類種類數(shù)上看，鯉科魚類最多，共計56種，占魚類總數(shù)的54.4%；從優(yōu)勢種群上看，銅魚屬（Coreius）和吻鮈屬為該江段的優(yōu)勢屬；銅魚、圓口銅魚（Coreius guichenonti）和長鰭吻鮈（Rhinogobio ventralis）為該江段的優(yōu)勢種［28］。

本研究運(yùn)用環(huán)境DNA技術(shù)在長江江津段共檢測出魚類37種，因為本次環(huán)境DNA技術(shù)使用的是CO I引物，該引物的長度較長，但環(huán)境中游離的DNA大部分的片段很短，進(jìn)而導(dǎo)致了檢出率偏低［29］。同時，根據(jù)該分子標(biāo)記自身特點設(shè)計的通用引物難以覆蓋比較全面的物種。而且，這些引物具有一定的選擇性，可能導(dǎo)致對特定優(yōu)勢種的過度擴(kuò)增，從而使一些低豐度或非首選種難以被檢測到［30］。與近十年來通過傳統(tǒng)方法監(jiān)測的結(jié)果相比，

優(yōu)勢種群相似，均顯示出該江段吻鮈屬為優(yōu)勢屬。但在魚類組成上具有一定差異，歷史文獻(xiàn)表明該江段銅魚、圓口銅魚和長鰭吻鮈為優(yōu)勢種；而本次調(diào)查中以吻鮈、子陵吻鰕虎魚和銅魚的相對序列豐度最高。這可能是由于文獻(xiàn)資料調(diào)研時間跨度較長（7～10年），魚類資源在此期間不斷發(fā)生變化［3-4］；也可能與調(diào)查季節(jié)有關(guān)，單季節(jié)調(diào)查無法全面反映整個江段的真實情況。

此外，本次調(diào)查檢測出尼羅羅非魚、莫桑比克羅非魚和施氏鱘3種外來魚類，其中尼羅羅非魚具有較高的物種序列豐度。這可能與保護(hù)區(qū)周邊養(yǎng)殖場缺乏必要的物種防逃設(shè)施有關(guān)［26］。尼羅羅非魚適應(yīng)能力強(qiáng)，生長迅速，繁殖力強(qiáng)，有強(qiáng)烈的領(lǐng)域和護(hù)幼行為［31］，可能對保護(hù)區(qū)土著魚類資源造成一定的生態(tài)脅迫。因此，有必要針對保護(hù)區(qū)流域的外來魚類物種開展連續(xù)性監(jiān)測以掌握其種群動態(tài)和對本地土著魚類的影響［21］。

3.2 基于環(huán)境DNA技術(shù)的長江江津段魚類多樣性

本研究發(fā)現(xiàn)，長江江津段不同斷面間魚類多樣性和群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一定的差異。綦江口斷面Chao1指數(shù)值明顯低于其他斷面，表明其群落豐富度最低，這可能與該斷面的地理環(huán)境有密切關(guān)系。吳昀晟等［32］研究表明，環(huán)境DNA得率受到水樣泥沙含量和抽提操作等多種因素影響。石睿杰等［33］的相關(guān)研究表明，河流中氮質(zhì)量濃度的變化可能對魚類獲取營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生影響，進(jìn)而對魚類群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。本研究中綦江口處于長江干流與綦江的交匯口，泥沙含量較高，水樣較為渾濁，且支流上方有城鎮(zhèn)污水排入，這些自然和人為因素可能導(dǎo)致綦江口的群落豐富度相對較低［34-36］。其他斷面的Chao1指數(shù)較為均衡，表明長江江津段魚類群落結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定［37］。Simpson指數(shù)與Shannon-Wiener指數(shù)表明，三拋河和松溉魚類多樣性較高，這可能與樣品中的鲇（Silurus asotus）、尼羅羅非魚等個別魚類的高序列豐富度相關(guān)。β多樣性分析表明，高占灘和三拋河及馬夫沱和丁家沱具有相似的魚類多樣性，而綦江口具有明顯不同于其他斷面的魚類組成。這可能是因為綦江口受到自然因素和人為因素的影響，其檢測出的魚類種數(shù)明顯低于其他樣點。整體而言，長江江津段的各個采樣區(qū)域物種分布較為聚集，這或許與采樣區(qū)域之間距離較近，魚類能夠頻繁進(jìn)行交流有關(guān)。

3.3 環(huán)境DNA技術(shù)檢測魚類種類的適用性及局限性

已有研究表明，環(huán)境DNA技術(shù)檢測到的魚類組成和多樣性與傳統(tǒng)調(diào)查方法的結(jié)果基本一致［38-39］。與最近的傳統(tǒng)方法調(diào)查結(jié)果相比（2018年，25種）［4］，本研究檢測出的魚類雖未覆蓋該江段所有魚類種類，但檢測到的魚類組成和群落結(jié)構(gòu)存在一定的相似性，表明環(huán)境DNA技術(shù)作為一種重要的補(bǔ)充工具在魚類資源調(diào)查中具有一定的適用性。此外，本次調(diào)查還檢測到了傳統(tǒng)采樣方法難以發(fā)現(xiàn)的物種，例如巖原鯉和達(dá)氏鱘等珍稀特有魚類，這證實了環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)應(yīng)用于水生態(tài)監(jiān)測的可行性。

由于環(huán)境DNA的產(chǎn)生和降解受到水動力條件、紫外線、水溫、pH和水域底質(zhì)等多種因素的影響［40-41］，因而監(jiān)測結(jié)果與實際情況可能存在一定的誤差。目前對環(huán)境DNA序列豐度的評價方法仍需深入探討以確定其與物種數(shù)量及生物量的關(guān)系等方面的內(nèi)容。所以，有必要繼續(xù)探索可能影響環(huán)境DNA生成速度和分解效率的外部環(huán)境變量，以便為其作為生物量估算等任務(wù)的基礎(chǔ)理論提供更全面的支持［42］。另外，由于受到樣本采集地點、區(qū)域規(guī)模、檢測對象種類以及實驗條件的多方面制約，現(xiàn)階段尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的環(huán)境DNA技術(shù)操作規(guī)范。所以，為了環(huán)境DNA技術(shù)能更廣泛地應(yīng)用于水生生態(tài)監(jiān)測中，未來需要對環(huán)境DNA技術(shù)的整個操作流程進(jìn)行優(yōu)化，建立規(guī)范統(tǒng)一的操作方案與流程。盡管環(huán)境DNA方法無法替代常規(guī)的戶外工作及專業(yè)的分類專家所做的事務(wù)，然而它具備著高度敏感性的優(yōu)點并且能以較小的影響來評估生態(tài)環(huán)境，這有助于填補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)監(jiān)控手段的缺陷，因而可以被視為一項有效的輔助手段，用以迅速了解長江魚種的種類數(shù)量及其地理分布情況［8，43］。

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Application of Environmental DNA Technologyin Monitoring Fish Diversity in the Jiangjin Section of the Yangtze River

ZHANG Jia-ming1，ZHOU Xin-xin1，WANG Wei2，DUAN Cong2，

LI Ying-wen1，SHEN Yan-jun1

（1.School of Life Sciences，Chongqing Normal University，Chongqing 401331，China;

2.Chongqing Rare and Unique Fish National Nature Reserve Management Office，Chongqing 402260，China）

Abstract：Utilizing environmental DNA technology to investigate fish species distribution in the Jiangjin section of the Yangtze River provides essential fundamental data for effective river management.In June 2021，6 sampling sites were strategically positioned along this segment，employing a comprehensive approach that involved water sample collection，eDNA capture，and annotation analysis to assess fish diversity.The study identified a total of 37 fish species in the Jiangjin section，representing 4 orders，10 families，and 32 genera.Notably，the findings included 2 nationally protected fish species，14 endemic species in the upper reaches of the Yangtze River，2 key protected species in Chongqing Municipality，and 3 invasive species.Rhinogobio typus，R.giurinus，and Coreius heterodon exhibited notably higher relative abundances in this region.Furthermore，Alpha and Beta diversity analyses，based on sequence abundance，presented variations in fish composition and diversity at different sampling sites.Compared with recent traditional morphological survey data，a remarkable resemblance can be found between eDNA technology’s detection results and the traditional findings for fish species.This underscores the efficacy of eDNA technology as a valuable supplementary tool for rapidly comprehending the amounts and geographical distribution of fish species in the Yangtze River.

Keywords：environmental DNA；fish diversity；fish monitoring；distribution of fish resources；Jiangjin section of the Yangtze River