摘要：為了探索茄子Solanum melongena L.的基因表達(dá)模式，利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20個(gè)候選內(nèi)參基因mRNA的表達(dá)差異情況，并運(yùn)用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3種計(jì)算方法評(píng)價(jià)茄子20個(gè)候選內(nèi)參基因在低溫、弱光、低溫弱光葉片樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明：茄子20個(gè)候選內(nèi)參基因熒光定量引物擴(kuò)增效率（E）數(shù)值在96.8%～117.6%，相關(guān)系數(shù)（R2）介于0.968 8～0.999 9，擴(kuò)增效率良好，擴(kuò)增反應(yīng)具有高度的專一性，引物能特異性擴(kuò)增，特異性好，均為單峰，樣品間擴(kuò)增曲線重復(fù)性強(qiáng)，可用于qRT-PCR擴(kuò)增。茄子20個(gè)候選內(nèi)參基因CT值表達(dá)豐度分析，發(fā)現(xiàn)茄子20個(gè)候選內(nèi)參基因平均CT值在19.76～31.20。3種計(jì)算方法的綜合評(píng)價(jià)分析結(jié)果顯示，TBP基因在所有樣本中為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。研究可為茄子低溫、弱光和低溫弱光脅迫下基因特異性表達(dá)研究提供了合適的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞：茄子；內(nèi)參基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；標(biāo)準(zhǔn)化；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S641.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：0253?2301（2024）08?0001?15

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.08.001

林琿，裘波音，朱海生，等.低溫弱光脅迫下茄子幼苗實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選與評(píng)價(jià)[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2024，55（8）：01?15.

優(yōu)秀學(xué)者論壇

溫慶放，1965年生，二級(jí)研究員，福建省百千萬人才，福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所黨支部書記、所長(zhǎng)，主要從事蔬菜育種與栽培研究。主持或參與了多項(xiàng)國家科技計(jì)劃、福建省重大科技專項(xiàng)、福建省種業(yè)產(chǎn)業(yè)化工程項(xiàng)目等蔬菜重大科技項(xiàng)目；獲福建省科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)2項(xiàng)（排名第1）、三等獎(jiǎng)1項(xiàng)（排名第1），參與獲得福建省科技進(jìn)步獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)1項(xiàng)（排名第5）、二等獎(jiǎng)3項(xiàng)（排名分列為2、3、6名）；主持或參與育成蔬菜品種20多個(gè)通過國家品種登記或省認(rèn)（鑒）定；授權(quán)國家發(fā)明專利5件；發(fā)表論文130多篇，其中SCI收錄8篇；編著出版蔬菜專著7部?，F(xiàn)任或兼任國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系福州綜合試驗(yàn)站站長(zhǎng)、福建省蔬菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心主任、福建省園藝學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)。

Screening and Evaluation of Reference Genes in Eggplant Seedlings by Real-time Fluorescence Quantitative PCR Under Low Temperature and Weak Light Stress

LIN Hui，QIU Bo-yin，ZHU Hai-sheng＊，WEN Qing-fang*

（Fujian Key Laboratory of Vegetable Genetics and Breeding/Fujian Engineering Research Center for Vegetables/Crops Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China）

Abstract：In order to explore the gene expression pattern of Solanum melongena L.，the qRT-PCR method was used to analyze the expression differences of mRNA in the 20 candidate reference genes of eggplant，including ACT，EF1α，TUA，TUB，GAPDH，eIF，UBQ，UBI3，PP2A，CYP，RPL28，L25，SAND，TBP，DNAJ，APRT，EXP，CAC，HSP20 and CysPro.The three calculation methods，including GeNorm，NormFinder and BestKeeper，were used to evaluate the expression stability of 20 candidate reference genes in eggplant samples at low temperature，weak light and low temperature and weak light stress.The results showed that the fluorescence quantitative primer amplification efficiency（E）values of 20 candidate reference genes in eggplant ranged from 96.8%to 117.6%，and the correlation coefficient（R2）was between 0.968 8?0.999 9，indicating that the amplification efficiency was good，and the amplified reaction was highly specific.The primers could be specifically amplified，with good specificity，all of which were unimodal.The amplification curves among the samples had strong repeatability，which could be used for qRT-PCR amplification.By analyzing the expression abundance of CT values of 20 candidate reference genes in eggplant，it was found that the average CT values of 20 candidate reference genes in eggplant ranged from 19.76 to 31.20.The comprehensive evaluation results of the three calculation methods showed that the TBP gene was the most stable reference gene in all the samples.The study could provide a suitable reference gene for the study of gene-specific expression in eggplant under low temperature stress，weak light stress and low temperature and weak light stress.

Key words：Eggplant（Solanum melongena L.）；Reference gene；Quantitative real-time PCR；Standardization；Gene expression

茄子作為茄科茄屬的一種重要蔬菜，深受消費(fèi)者喜愛，在我國各地廣泛種植[1]。它不僅富含多種膳食纖維、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、酚類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有豐富的維生素P和高水平抗氧化的有效成分[2?3]。茄子是喜溫蔬菜，而福建地處亞熱帶地區(qū)，熱量豐富，氣候溫暖，十分適宜茄子生長(zhǎng)。近年來，隨著交通運(yùn)輸和設(shè)施大棚的發(fā)展，茄子憑借其高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和簡(jiǎn)單的栽培管理，已經(jīng)成為福建省蔬菜的支柱產(chǎn)業(yè)之一[4]。溫度和光照是綠色植物生長(zhǎng)發(fā)育中重要的環(huán)境因素[5]。然而，福建冬季和初春，茄子在生產(chǎn)過程中極易受到低溫和連續(xù)陰雨天氣的影響，導(dǎo)致落花、落果、畸形果等現(xiàn)象頻發(fā)，造成大面積減產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)損失巨大[1]。因此，深入探究茄子對(duì)低溫弱光脅迫的響應(yīng)，制定一套適用于低溫弱光環(huán)境的茄子栽培管理技術(shù)，并培育耐低溫弱光的茄子品種，對(duì)福建茄子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。目前，盡管學(xué)者對(duì)茄子低溫弱光脅迫的研究已取得一定進(jìn)展，但大多停留在生理水平，其在分子層面上的發(fā)生機(jī)理仍有待進(jìn)一步闡明。挖掘耐寒關(guān)鍵基因，闡明其調(diào)控機(jī)制，對(duì)于茄子的安全高效生產(chǎn)以及耐寒種質(zhì)創(chuàng)制具有重要意義。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)茄子在低溫弱光脅迫下的基因表達(dá)量，成為當(dāng)下亟待開展的研究。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR）是分析茄子幼苗低溫、弱光、低溫弱光非生物脅迫下功能基因表達(dá)量的一種有效的試驗(yàn)方法，具有重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、對(duì)靶基因有高通量等特性[6?9]。為了獲得準(zhǔn)確的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，在試驗(yàn)過程中要盡量避免由于引物設(shè)計(jì)、cDNA轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增等因素造成表達(dá)水平的偏差[10?13]。使用內(nèi)參基因?qū)δ康幕虮磉_(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，是矯正偏差的重要手段[14]。理想的內(nèi)參基因是在不同試驗(yàn)處理、不同組織、不同發(fā)育階段等條件下都能一致表達(dá)的基因。

看家基因在維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)過程中保守性高，受到環(huán)境的影響較小[15]。因此，看家基因GAPDH[16]、UBQ[17]、TUB[18]、ACT[19]等被廣泛的應(yīng)用于不同植物在各種試驗(yàn)條件下的基因表達(dá)分析。然而，這些基因作為內(nèi)參基因的適用性并非絕對(duì)，其穩(wěn)定性在不同植物和試驗(yàn)條件下有所差異。在單子葉植物短柄厥內(nèi)參基因篩選中，GAPDH基因被認(rèn)為不適合作為內(nèi)參基因[20]，但在虎耳草激素處理的試驗(yàn)中，GAPDH基因卻是表達(dá)最為穩(wěn)定的基因[16]；在雙子葉植物中，UBQ10基因在珊瑚菜中表達(dá)最為活躍[21]，而在大青楊中卻被鑒定為最佳內(nèi)參基因[17]；在管狀花目植物中，TUB基因在芝麻不同發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)穩(wěn)定性最高[18]，但在番茄的TOCMOV致病系統(tǒng)研究中則不建議被作為內(nèi)參基因使用[22]；在茄科植物夜香樹（夜來香）中，ACT基因在花和葉的內(nèi)參基因的評(píng)價(jià)中表達(dá)最為穩(wěn)定[19]，但在辣椒的非生物脅迫和激素處理試驗(yàn)中，ACT則為最不穩(wěn)定的基因之一[23]。此外，一些編碼細(xì)胞分化的基因，如PP2A[24]、CYP[25]、EXP[21]等，也常常被作為內(nèi)參基因使用[26]。在茄屬植物的內(nèi)參基因評(píng)價(jià)中，PP2A基因在番茄的氮脅迫、低溫和光脅迫下是最穩(wěn)定基因[24]，而在病毒侵染煙草基因表達(dá)變化的研究中，PP2A基因的表達(dá)穩(wěn)定性是最差的基因之一[27]。因此，針對(duì)不同植物的不同試驗(yàn)條件，篩選合適的內(nèi)參基因尤為重要。

茄子內(nèi)參基因的篩選已取得了一些初步的進(jìn)展[28?32]。在茄子花芽、花、成熟葉、嫩葉、莖和根等組織的內(nèi)參基因的篩選研究中，18S rRNA被鑒定為最適合內(nèi)參基因[28]；在茄子不同組織以及不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、生物脅迫、干旱、鹽處理下，TUA基因表達(dá)穩(wěn)定性最好[29]；在茄子果實(shí)的不同發(fā)育階段及不同品種研究中，SAND基因被認(rèn)為是最佳內(nèi)參基因[30]；在茄子高溫脅迫下，EF1α基因表達(dá)穩(wěn)定性最高[29]。可見，內(nèi)參基因的表達(dá)水平在不同的試驗(yàn)條件下不是穩(wěn)定不變的。茄子在低溫、弱光、低溫弱光脅迫下內(nèi)參基因的研究尚待深入。在特定的試驗(yàn)條件下，篩選合適的內(nèi)參基因是試驗(yàn)順利進(jìn)行的先決條件。為了在低溫、弱光、低溫弱光處理下研究參與3個(gè)脅迫的功能基因及轉(zhuǎn)錄因子，有必要篩選對(duì)各個(gè)具體試驗(yàn)條件下最佳的內(nèi)參基因來對(duì)熒光定量PCR試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，這將促進(jìn)茄子在基因表達(dá)水平的研究。

本研究選擇了茄子在低溫脅迫、弱光脅迫、低溫弱光脅迫下的樣品，利用qRT-PCR方法分析了ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro這20個(gè)植物常用的候選基因mRNA的表達(dá)差異情況，并運(yùn)用GeNorm[31]、NormFinder[32]和Best-Keeper[33]3種計(jì)算方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果中候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在篩選適宜低溫弱光脅迫下茄子基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因，為茄子相關(guān)基因表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選用對(duì)低溫弱光反應(yīng)不同的兩個(gè)茄子材料：耐低溫弱光品系epl008和低溫弱光敏感品系eplck。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在福建省蔬菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。飽滿的種子用3%次氯酸鈉表面滅菌10 min，用蒸餾水清洗3次，再用蒸餾水浸泡12 h，用濕紗布包起然后放入帶濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在28℃黑暗中發(fā)芽。3 d后，將萌發(fā)的種子播種在裝有育苗基質(zhì)的干凈穴盤中，轉(zhuǎn)移到16h光照（28℃）/8 h暗周期、光合光子通量密度為300μmol·m?2·s?1、相對(duì)濕度為80%的條件下的氣候室中[30，35]。

本試驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)處理：（1）采集耐低溫弱光材料epl008在低溫處理下0、3、6、12、24和48 h的葉片。（2）采集耐低溫弱光材料epl008在弱光處理下0、3、6、12、24和48 h的葉片。（3）采集耐低溫弱光材料epl008在低溫弱光處理下0、3、6、12、24和48 h的葉片。（4）采集低溫弱光敏感材料eplck在低溫處理下0、3、6、12、24和48 h的葉片。（5）采集低溫弱光敏感材料eplck在弱光處理下0、3、6、12、24和48 h的葉片。（6）采集低溫弱光敏感材料eplck在低溫弱光處理下0、3、6、12、24和48 h的葉片。收集的茄子樣品用錫箔紙包裹液氮速凍置于超低溫冰箱存放，備用。每個(gè)樣品來自3株植物處理作為生物復(fù)制處理，試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3總RNA提取和cDNA的獲得

RNA提取按照通用植物總RNA提取試劑盒中的試驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行（中國北京，百泰克）。用1%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的完整性，用美國Thermo Fisher Science公司的Nano-Drop?8 000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。A260/A280比值在1.9～2.1和A260/A230大于1.80的RNA樣品才用于cDNA合成。cDNA根據(jù)制造商（Takara）的說明，在20μL的反應(yīng)系統(tǒng)中，使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Takara）合成cDNA。每個(gè)樣品所需的RNA用量，根據(jù)所提取的RNA濃度確定其比例，以確保每個(gè)組織樣品的mRNA含量保持一致。

1.4內(nèi)參基因篩選和引物設(shè)計(jì)

茄子20個(gè)候選內(nèi)參基因ACT、EF1-α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20.2和CysPro的篩選，參考前人在茄科茄屬蔬菜和其他作物研究成果[28?49]（表1）。根據(jù)已有的茄子全基因組RNA-seq數(shù)據(jù)庫（http：//eggplant.kazusa.or.jp/index.html），篩選得到20條基因全長(zhǎng)序列。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，利用軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量試驗(yàn)所需引物（表1）。引物檢測(cè)反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，2℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。反應(yīng)體系20.0μL：包括10×PCR buffer（含Mg2+）2.0μL、Primer F（10μmol·L?1）1.0μL、Primer R（10μmol·L?1）1.0μL、dNTP（10 mmol·L?1）1.0μL、Taq（5 U）0.2μL、cDNA 2.0μL、ddH2O 12.8μL。

1.5內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增

用稀釋10倍的cDNA模板生成標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（slope），用E=（10-1/slope–1）×100%計(jì)算每個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率，以R2預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的可靠性，進(jìn)行3次重復(fù)。采用SYBR Green染料法，熒光定量PCR試驗(yàn)按照SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒TaKaRa公司操作說明書進(jìn)行，在7 500 Real Time System儀[ABI（美國）公司]上完成，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。反應(yīng)體系10μL，包括2×SYBR Premix EXTaqTM 5μL、Primer F（10μmol·L?1）0.4μL、Primer R（10μmol·L?1）0.4μL、ROX Reference Dye（10μmol·L?1）0.2μL、cDNA 2.0μL、ddH2O 2.0μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后進(jìn)行溶解曲線分析，溶解曲線程序：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。分析溶解曲線確定每對(duì)擴(kuò)增引物的特異性。

1.6數(shù)據(jù)分析

利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper法分析20個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性。將qRT-PCR獲得數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Microsoft Excel 2003中，并根據(jù)軟件要求對(duì)循環(huán)閾值（cycle threshold，CT）進(jìn)行轉(zhuǎn)換。每個(gè)軟件產(chǎn)生候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的度量值，可用于對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序。最后，用幾何平均值綜合評(píng)價(jià)3種計(jì)算方法，生成最終排序表。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)參基因引物檢測(cè)

茄子20個(gè)候選內(nèi)參基因熒光定量引物擴(kuò)增效率（E）數(shù)值在96.8%～117.6%，相關(guān)系數(shù)（R2）介于0.968 8～0.999 9（表2），表明引物擴(kuò)增效率良好，可用于qRT-PCR試驗(yàn)。利用普通PCR對(duì)內(nèi)參基因特異性進(jìn)行檢測(cè)（圖1），結(jié)果表明20個(gè)內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物在100～250 bp，條帶單一，大小與目標(biāo)片段相同，說明擴(kuò)增反應(yīng)具有高度的專一性，引物能特異性擴(kuò)增，未出現(xiàn)引物二聚體，適用于qRT-PCR研究。以茄子葉片cDNA為模板，經(jīng)qRT-PCR擴(kuò)增，對(duì)候選內(nèi)參基因的引物溶解曲線分析（圖2），結(jié)果表明20個(gè)候選內(nèi)參基因引物特異性好，均為單峰，樣品間擴(kuò)增曲線重復(fù)性強(qiáng)，說明CDNA模板可進(jìn)行差異性擴(kuò)增，qRT-PCR結(jié)果可信度高。

2.2茄子20個(gè)候選內(nèi)參基因CT值表達(dá)豐度分析

茄子20個(gè)候選內(nèi)參基因平均CT值在19.76～31.20（圖3）。根據(jù)CT值計(jì)算候選內(nèi)參基因表達(dá)水平，候選內(nèi)參基因在耐低溫弱光品系epl008和低溫弱光敏感品系eplck低溫脅迫、弱光脅迫和低溫弱光脅迫處理?xiàng)l件下基因表達(dá)水平不同。內(nèi)參基因的表達(dá)豐度通過CT值來體現(xiàn)，一般來說，CT值越低表達(dá)豐度越高。由圖3可知，內(nèi)參基因CYP的表達(dá)豐度（19.76±4.02）較其他內(nèi)參基因高，其次是TUA基因的表達(dá)豐度，為20.46±3.53。20個(gè)內(nèi)參基因中，GAPDH基因在耐低溫弱光品系epl008和低溫弱光敏感品系eplck低溫脅迫、弱光脅迫和低溫弱光脅迫處理?xiàng)l件下的變化范圍最大為31.20±4.07，SAND基因變化范圍最小，范圍為25.61±0.12。

2.3茄子內(nèi)參基因的篩選

2.3.1 GeNorm軟件分析在GeNorm軟件分析中，通常以平均變異度（M）作為衡量?jī)?nèi)參基因穩(wěn)定與否的標(biāo)準(zhǔn)，M越小，穩(wěn)定性越好；反之，M越大，穩(wěn)定性越差。學(xué)者們?cè)诜治鲋心J(rèn)的M閾值為1.5。GeNorm軟件的分析結(jié)果（表3）表明，20個(gè)內(nèi)參基因不同處理中的表達(dá)穩(wěn)定性不同。以低溫脅迫的茄子epl008葉片為材料時(shí)，內(nèi)參基因的M由低到高依次為PP2A=CysPr<APRT＜EXP＜CAC＜DNAJ＜L25＜EF-1α＜UBQ<GAPDH＜ACT＜TBP＜TUA＜CYP＜RPL8<HSP20＜UBI3＜SAND＜eIF＜TUB；以低溫脅迫的茄子eplck葉片為供試材料時(shí)，內(nèi)參基因的M由低到高依次為RPL8=TBP＜UBI3＜CAC＜UBQ<PP2A＜L25＜APRT＜DNAJ＜SAND＜GAPDH<TUA＜EXP＜EF-1α＜eIF＜CysPr＜HSP20＜TUB；以弱光脅迫的茄子epl008葉片為材料時(shí)，內(nèi)參基因的M由低到高依次為APRT=CAC＜CysPr<UBQ＜PP2A＜TBP＜RPL8＜UBI3＜DNAJ＜TUB<TUA＜EXP＜L25＜HSP20＜SAND＜CYP＜eIF<ACT＜GAPAH＜EF-1α;以弱光脅迫的茄子eplck葉片為材料時(shí)，內(nèi)參基因的M由低到高依次為RPL8=SAND＜TBP＜UBI3＜CYP＜CAC<EXP＜TUA＜PP2A＜TUB＜APRT＜DNAJ＜L25＜ACT<eIF＜CysPr＜EF-1α＜GAPAH＜UBQ＜HSP20。以低溫弱光雙重脅迫的茄子epl008葉片為材料時(shí)，內(nèi)參基因的M由低到高依次為DNAJ=APRT<CysPr＜PP2A＜L25＜ACT＜UBQ＜EF-1α<EXP＜CAC＜HSP20＜TUB＜CYP＜TUA＜RPL8<TBP＜eIF＜UBI3＜GAPDH＜SAND；以低溫弱光雙重脅迫的茄子eplck葉片為材料時(shí)，內(nèi)參基因的M由低到高依次為EF-1α=DNAJ＜HSP20<UBQ＜L25＜APRT＜UBI3＜eIF＜ACT＜SAND<PP2A＜CAC＜TBP＜CYP＜TUA＜CysPr＜EXP＜R PL8＜TUB＜GAPDH；在茄子所有樣本脅迫中，內(nèi)參基因的M由低到高依次為UBI3=SAND<TBP＜TUA＜RPL8＜eIF＜ACT＜PP2A＜APRT<EXP＜L25＜DNAJ＜UBQ＜CysPr＜TUB＜CAC＜G APDH＜HSP20＜CYP＜EF-1α。茄子epl008葉片在低溫脅迫下，PP2A和CysPr的M最小，穩(wěn)定性最高，TUB的M最大，穩(wěn)定性最差；茄子eplck葉片在低溫脅迫下，RPL8和TBP的M最小，穩(wěn)定性最高，TUB的M最大，穩(wěn)定性最差；茄子epl008葉片在弱光脅迫下，APRT和CAC的M最小，穩(wěn)定性最好，其次是CysPr，EF-1α的M最大，穩(wěn)定性最差；茄子eplck葉片在弱光脅迫下，RPL8和SAND的M最小，穩(wěn)定性最高，其次是TBP，HSP20的M最大，穩(wěn)定性最差；茄子epl008葉片在低溫弱光雙重脅迫下，DNAJ和APRT的M最小，穩(wěn)定性最高，SAND的M最大，穩(wěn)定性最差；茄子eplck葉片在低溫弱光雙重脅迫下，EF-1α和DNAJ的M最小，穩(wěn)定性最高，GAPDH的M最大，穩(wěn)定性最差；在所有樣品脅迫下，UBI3和SAND的M最小，穩(wěn)定性最高，EF-1α的M最大，穩(wěn)定性最差。

根據(jù)GeNorm軟件得到的默認(rèn)變異系數(shù)（VN/VN+1）確認(rèn)最適內(nèi)參基因數(shù)目。0.15為程序默認(rèn)的閾值，VN/VN+1＜0.15時(shí)，則認(rèn)為最佳的內(nèi)參基因數(shù)為N個(gè)。茄子epl008葉片在低溫脅迫，茄子eplck葉片在低溫脅迫，茄子epl008葉片在弱光脅迫，茄子eplck葉片在弱光脅迫，茄子epl008葉片在低溫弱光脅迫、茄子eplck葉片在低溫弱光脅迫和在所有樣本處理下，V2/V3均低于0.15，表明在這些處理中，2個(gè)參考基因即可獲得準(zhǔn)確的結(jié)果（圖4）。

2.3.2 NormFinder軟件分析NormFinder軟件是通過計(jì)算基因表達(dá)穩(wěn)定性（S）來分析內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，S越大穩(wěn)定性越差，S越小穩(wěn)定性越好，穩(wěn)定性和S呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。從NormFinder軟件分析結(jié)果（表4）發(fā)現(xiàn)，茄子epl008葉片在低溫脅迫下，UBQ的S最小，為0.056，穩(wěn)定性最好，其次是EF1α，為0.133，TUB的S最大為0.924，穩(wěn)定性最差；茄子eplck葉片在低溫脅迫下，UBQ的S最小，穩(wěn)定性最好，其次是PP2A，TUB的S最大，穩(wěn)定性最差；茄子epl008葉片在弱光脅迫下，APRT的S最好，其次是CAC，EF1α的S最大，穩(wěn)定性最差；茄子eplck葉片在弱光脅迫下，TBP的S最小，穩(wěn)定性最好，HSP20的S最大，穩(wěn)定性最差；茄子epl008葉片在低溫弱光脅迫下，EF1α的S最小，穩(wěn)定性最好，其次是ACT，SAND的S最大，穩(wěn)定性最差；茄子eplck葉片在低溫弱光脅迫下，UBQ在試驗(yàn)中波動(dòng)不明顯，表達(dá)穩(wěn)定性最高，其次是HSP20，GAPDH的S最大，說明它在試驗(yàn)中表現(xiàn)很活躍。在所有樣本處理下，DNAJ的S最小，穩(wěn)定性最好，其次是PP2A，EF1α的S最大，穩(wěn)定性最差；這和GeNorm軟件分析的結(jié)果基本一致。

2.3.3 BestKeeper軟件分析BestKeeper軟件主要通過運(yùn)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）和變異系數(shù)（coefficients of variance，CV）通過比較各個(gè)值的大小，來確定20個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小，內(nèi)參基因越穩(wěn)定。運(yùn)用BestKeeper軟件進(jìn)行運(yùn)算結(jié)果表明（表5），當(dāng)以低溫脅迫的茄子epl008葉片為材料時(shí)，EXP的SD為0.122，CV為0.036，均小于1，穩(wěn)定性最好，eIF的SD最大，為4.816，CV為1.461，穩(wěn)定性最差。當(dāng)以低溫脅迫的茄子eplck葉片為材料時(shí)，CysPr的SD為0.700，CV為0.156，均小于1，穩(wěn)定性好，ACT的SD最大，且SD為3.881，CV為0.878，穩(wěn)定性最差；當(dāng)以弱光脅迫的茄子epl008葉片為材料時(shí)，GAPDH的SD為0.983，CV為0.316，穩(wěn)定性最好，EF1α的SD大于1，為10.335，CV為2.447，穩(wěn)定性最差；當(dāng)以弱光脅迫的茄子eplck葉片為材料時(shí)，GAPDH的SD為0.757，CV為0.227，穩(wěn)定性最好，EF1α的SD大于1，穩(wěn)定性最差；當(dāng)以低溫弱光脅迫的茄子epl008葉片為材料時(shí)，EF1α的SD為0.608，CV為0.140時(shí)，穩(wěn)定性最好，SAND的SD為5.206，CV為1.376，穩(wěn)定性最差。在所有樣品處理下，TBP的SD為1.83，CV為0.485，穩(wěn)定性最好，CYP的SD為8.709，CV為1.721，穩(wěn)定性最差。這與GeNorm和NormFinder軟件的分析結(jié)果基本一致。

2.3.4綜合評(píng)價(jià)茄子20個(gè)內(nèi)參基因在所有樣品處理下，軟件GeNorm的分析結(jié)果為，UBI3和SAND為表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，EF1α為表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因；軟件NormFinder計(jì)算結(jié)果如下，DNAJ為表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，EF1α為表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因；軟件BestKeeper給出的結(jié)果表明，TBP為表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，CYP為表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因；3種不同的統(tǒng)計(jì)方法得到的結(jié)果各不相同，通過幾何均值統(tǒng)計(jì)法綜合分析GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件3種計(jì)算方法的結(jié)果，并結(jié)合geNorm軟件的對(duì)不同處理下最佳內(nèi)參基因數(shù)量的分析結(jié)果（表6）：茄子epl008葉片在低溫脅迫下，PP2A和APRT表達(dá)穩(wěn)定性最好，eIF表達(dá)穩(wěn)定性最差；茄子eplck葉片在低溫脅迫下，RPL8和TBP表達(dá)穩(wěn)定性最好，HSP20表達(dá)穩(wěn)定性最差；茄子epl008葉片在弱光脅迫下，APRT和CAC表達(dá)穩(wěn)定性最好，EF1α表達(dá)穩(wěn)定性最差；茄子eplck葉片在弱光脅迫下，TBP和UBI3表達(dá)穩(wěn)定性最好，EF1α表達(dá)穩(wěn)定性最差；茄子epl008葉片在低溫弱光脅迫下，EF1α和DNAJ表達(dá)穩(wěn)定性最好，SAND穩(wěn)定性最差；茄子eplck葉片在低溫弱光脅迫下，EF1α和DNAJ表達(dá)穩(wěn)定性最好，GAPDH穩(wěn)定性最差。在所有的樣品處理下，TBP和UBI3基因表達(dá)穩(wěn)定性最好，CYP表達(dá)穩(wěn)定性最差。

3討論與結(jié)論

茄子富含對(duì)人體有益的維生素P，是全球排名前十的健康蔬菜之一[50]。南方冬季初春，茄子的生長(zhǎng)常常受到低溫弱光等惡劣環(huán)境條件的影響，茄子抗逆基因的挖掘、抗逆品種的培育等已成為科研工作者們的研究熱點(diǎn)[51?55]。qRT-PCR是確定抗逆基因表達(dá)最常用的手段之一，而表達(dá)量數(shù)據(jù)的精確性取決814bd4b4b5ebc8561f8a0037d0c7e00e于使用內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。在針對(duì)茄子不同抗性品種的研究中，篩選出在低溫、弱光及低溫弱光等脅迫下表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，對(duì)于深入探究茄子應(yīng)對(duì)低溫弱光逆境的機(jī)制具有重大意義[51]。本研究總結(jié)前人內(nèi)參基因研究結(jié)果，結(jié)合茄子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)挖掘候選內(nèi)參基因，qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示每個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)量都存在變化，這個(gè)結(jié)論和Wu等[56]的研究結(jié)果類似。在特定條件下看家基因表達(dá)量變化較小，但如果將之作為內(nèi)參基因，還需要進(jìn)一步對(duì)這些候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。

不同的統(tǒng)計(jì)方法可能獲得截然相反的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，究竟哪個(gè)軟件評(píng)價(jià)的結(jié)果更可靠，目前沒有定論[57]。根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)，本研究使用了GeNorm、NormFinder和BestKeeper3個(gè)軟件統(tǒng)計(jì)計(jì)算，分析20個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[58]，發(fā)現(xiàn)每種軟件的候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序存在差異。3種計(jì)算方法的分析結(jié)果相似，但由于分析方式和計(jì)算方法不同，候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序上略有不同。GeNorm和NormFinder統(tǒng)計(jì)方法獲得相同的最活躍基因EF1α。BestKeeper軟件和獲得和綜合3種統(tǒng)計(jì)方法排序獲得了相同最穩(wěn)定基因TBP和最不穩(wěn)定基因CYP。這樣的結(jié)果是隨機(jī)的呢，還是說明BestKeeper軟件的統(tǒng)計(jì)方法優(yōu)于其他兩種方法還有待進(jìn)一步確定。本研究采用多種算法進(jìn)行內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性統(tǒng)計(jì)，最大程度上降低因不同的計(jì)算方法而造成的數(shù)據(jù)偏差，并根據(jù)幾何平均值綜合評(píng)價(jià)分析，結(jié)果表明，在這項(xiàng)研究中TBP在所有樣本中為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，而鄧嘉碩等[51]在冷脅迫等多種逆境處理下，篩選出的ACT基因則表現(xiàn)相對(duì)活躍。

肌動(dòng)蛋白ACT作為細(xì)胞骨架形成的重要蛋白，常常被認(rèn)為是表現(xiàn)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因之一[59?60]。鄧嘉碩等[51]對(duì)不同組織與冷脅迫等逆境下茄子qRT-PCR內(nèi)參基因篩選，ACT均為最穩(wěn)定內(nèi)參基因。為驗(yàn)證ACT基因的穩(wěn)定性，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)在低溫脅迫、弱光脅迫、低溫弱光脅迫處理下，采集低溫弱光敏感eplck和耐低溫弱光epl008品系0、3、6、12、24和48h的葉片為樣本，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘包括ACT基因的20個(gè)候選內(nèi)參基因中，篩選茄子在這3種非生物因素下的最佳內(nèi)參基因。本研究對(duì)篩選的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析，TBP在所有樣本中表達(dá)穩(wěn)定性最佳。但在特定的試驗(yàn)條件下，例如epl008品系低溫脅迫下PP2A基因穩(wěn)定性最好，ACT穩(wěn)定性排名第8；eplck品系低溫脅迫下，RPL8基因表達(dá)穩(wěn)定性最佳，ACT排名第19。epl008品系弱光脅迫下，ACT基因穩(wěn)定性排名第16；eplck品系低溫脅迫下，ACT基因穩(wěn)定性排名第18。在低溫弱光脅迫下，epl008品系的樣本，ACT基因穩(wěn)定性排名第5，在epl008品系樣本中，ACT基因穩(wěn)定性排名第8。在所有的茄子樣本中，ACT基因穩(wěn)定性排名第9。即使在相同的冷脅迫條件下，針對(duì)不同茄子品系，使用不同試驗(yàn)設(shè)備，也可能得出不同的結(jié)果，ACT基因在茄子研究中沒有通用性。為了順利研究低溫弱光等脅迫下功能基因的表達(dá)水平，篩選茄子內(nèi)參基因是關(guān)鍵步驟。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）