摘 要：應用《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5—2016）第一法凱氏定氮法測定蛋白粉中蛋白質的含量，參考《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006：2019）及《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）進行蛋白質測量的不確定度評價。結果表明，蛋白粉中蛋白質的含量為86.90 g/100 g，擴展不確定度為2.64 g/100 g，因此蛋白質含量測定結果報告為（86.90±2.64）g/100 g。影響蛋白粉中蛋白質測定不確定度的主要因素為定氮過程，其次是樣品的稱量、前處理、測量及鹽酸標準溶液滴定濃度。

關鍵詞：蛋白粉；蛋白質；不確定度；凱氏定氮法

Uncertainty Evaluation for Determination of Protein in Protein Powder

SU Junmei， HUANG Ling， LI Junwei， LIN Zhanhao， XIE Xiaohao， LIU Chunli*

（Access （Guangzhou） Testing Technology Service Co.， Ltd.， Guangzhou 510730， China）

Abstract： The protein content in protein powder is determined using the first method of GB 5009.5—2016 automatic Kjeldahl nitrogen analyzer， with reference to CNAS-GL006：2019 and JJF 1059.1—2012 for protein measurement uncertainty evaluation. The results showed that the protein content in protein powder was determined to be 86.90 g/100 g using the Kjeldahl nitrogen analyzer method， with an expanded uncertainty of 2.64 g/100 g. Therefore， the protein content determination result was reported as （86.90±2.64） g/100 g. The main factor affecting the uncertainty of protein determination in protein powder is the nitrogen determination process， followed by sample weighing， pretreatment， sample measurement， and hydrochloric acid standard solution drop concentration.

Keywords： protein powder; protein; uncertainty; Kjeldahl nitrogen determination method

測量不確定度是評估檢測結果質量的重要指標，它反映了檢測結果與被測量真實值的接近程度，以及檢測數(shù)據(jù)的可信度[1-4]?！稒z測和校準實驗室能力認可準則》（CNAS-CL001：2018）由中國合格評定國家認可委員會編制，其中明確規(guī)定實驗室要對測量不確定度進行評估[5-6]。中國合格評定國家認可委員會還發(fā)布了《測量不確定度的要求》（CNAS CL01-G003：2021），進一步規(guī)范了實驗室的不確定度評定過程[7-8]。

蛋白質作為蛋白粉中最主要的營養(yǎng)物質，是判斷產品質量是否符合標準的關鍵依據(jù)[9]。當?shù)鞍踪|含量檢測結果接近規(guī)定的標準臨界值時，基于測量不確定度的符合性聲明成為評判產品合規(guī)性的重要手段[10]。本文參考《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006：2019）[11]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[12]的規(guī)定和要求，對使用自動凱氏定氮儀法測量蛋白粉中蛋白質含量的不確定度進行了分析，評估了不確定度的來源以及各因素對測量不確定度的貢獻，并對關鍵的影響因素進行了深入的討論與分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋白粉，市售；無水碳酸鈉純度標準物質，編號GBW（E）060023c，中國計量科學研究院；95%乙醇、硫酸鉀、硫酸銅、濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、硼酸（分析純），廣州化學試劑廠；甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍指示劑（分析純），廣州光華科技股份有限公司；水為符合《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》（GB/T 6682—2008）規(guī)定要求的一級水。

1.2 儀器與設備

XS204-分析天平，梅特勒-托利多國際股份有限公司；DIGESTOR消化爐、Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀，F(xiàn)OSS公司。

1.3 方法

依據(jù)《食品安全國家標準 食品中蛋白質含量的測定》（GB 5009.5—2016）[13]第一法凱氏定氮法測定蛋白粉中蛋白質的含量。蛋白粉產品的主要營養(yǎng)成分蛋白質經過加熱催化被分解，產生的氨氣可以與硫酸反應生成硫酸銨，經過堿化蒸餾，將游離出來的氨氣用硼酸吸收，最后用鹽酸標準溶液滴定，根據(jù)鹽酸的消耗量來計算產品中蛋白質的含量。

1.3.1 試劑配制

40%氫氧化鈉溶液：往燒杯中加入2.5 L水，邊攪拌邊倒入1 000 g氫氧化鈉，冷卻后倒入相應儲液桶。

1%溴甲酚綠-95%乙醇溶液：稱量0.2 g溴甲酚綠指示劑于200 mL棕色容量瓶中，加入約100 mL 95%乙醇，超聲至完全溶解后定容。

0.1%甲基紅-95%乙醇溶液：稱量0.2 g甲基紅指示劑于200 mL棕色容量瓶中，加入約100 mL 95%乙醇，超聲至完全溶解后定容。

Foss全自動凱氏定氮儀1%硼酸溶液：稱量40 g硼酸，加4 L水攪拌溶解后，加入40 mL 0.1%溴甲酚綠-95%乙醇溶液及28 mL 0.1%甲基紅-95%乙醇溶液，攪拌均勻后倒入相應儲液桶。

1.3.2 標準滴定溶液配制與標定

0.100 0 mol·L-1標準鹽酸溶液制備：移取9 mL濃度為36%～38%的濃鹽酸于1 000 mL容量瓶，定容搖勻，用基準試劑無水碳酸鈉對鹽酸濃度進行標定。

稱取適量的無水碳酸鈉基準試劑，于300 ℃馬弗爐中灼燒，灼燒至恒重后置于50 mL水中溶解，滴加10滴溴甲酚綠-甲基紅指示液。用配制好的鹽酸溶液滴定，當溶液的顏色從綠色變?yōu)榘导t色后，煮沸溶液，維持2 min，蓋上橡膠塞待其冷卻。等溶液冷卻至室溫后繼續(xù)滴定直到溶液再次呈現(xiàn)暗紅色，記錄消耗鹽酸的體積。為確保結果的準確性，需進行一次空白試驗。

1.3.3 蛋白粉蛋白質含量測定

稱取0.10～0.15 g（精確到0.001 g）經過充分混勻的蛋白粉樣品，置于消化管中，往消化管添加0.8 g硫酸銅、7 g硫酸鉀和10 mL硫酸溶液后，置于消化爐中進行消化，設置消化溫度為420 ℃，消化時間為1 h，觀察到消化管中液體呈綠色透明狀時，取出冷卻后，放置在自動凱氏定氮儀上（使用前將水、濃度為40%的氫氧化鈉溶液、鹽酸的標準溶液、甲基紅乙醇溶液-溴甲酚綠乙醇溶液混合指示劑的硼酸溶液分別加入自動凱氏定氮儀的不同儲液罐中），自動進行加液、蒸餾、滴定等步驟，并記錄滴定數(shù)據(jù)，從而實現(xiàn)對蛋白粉含量的精確測定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

鹽酸標準滴定溶液濃度的計算公式為

（1）

式中：m為無水碳酸鈉的質量，g；V1為鹽酸溶液的體積，mL；V2為空白試驗中鹽酸溶液消耗體積，mL；M為無水碳酸鈉的摩爾質量，1/2M（Na2CO3）=52.994 g·mol-1。

蛋白粉中蛋白質含量的計算公式為

（2）

式中：X為蛋白粉中蛋白質含量，g/100 g；V1為試樣在滴定過程中消耗的鹽酸標準滴定液的體積，mL；V2為試劑空白在滴定過程中消耗的鹽酸標準滴定液的體積，mL；c為鹽酸標準滴定溶液的濃度，mol·L-1；0.014 0為1.0 mL濃度為1.000 mol·L-1的鹽酸標準滴定溶液相當?shù)牡馁|量，g；m為試樣的質量，g；F為氮折算為蛋白質的系數(shù)，對于大豆蛋白制品，折算系數(shù)為6.25；100為換算系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

依據(jù)CNAS-GL006：2019和JJF 1059.1—2012的相關要求，對測量過程和數(shù)學模型進行深入分析，得到蛋白粉測定過程中不確定度的主要來源：試樣測量過程中重復性產生的不確定度u（）、鹽酸標準滴定溶液濃度引入的不確定度u（C）、試樣稱量過程中產生的不確定度u（m）、試樣前處理環(huán)節(jié)產生的不確定度u（x2）、試樣定氮環(huán)節(jié)產生的不確定度u（x3）。

2.2 不確定度分量評估

2.2.1 試樣測量重復性產生的不確定度

在評估測量重復性產生的不確定度時，要考慮操作人員和儀器設備穩(wěn)定性對不確定度的影響。采用同一樣品進行重復實驗，蛋白粉中蛋白質含量的測定結果見表1。

同一人員、相同設備重復測定蛋白粉中蛋白質含量的標準不確定度和相對標準不確定度分別為

2.2.2 鹽酸標準滴定溶液濃度引入的不確定度

鹽酸標準滴定溶液濃度引入的不確定度包括鹽酸標準滴定溶液濃度測量重復性產生的不確定度u（CHC1）、工作基準試劑無水碳酸鈉本身產生的不確定度u（CRS）、工作基準試劑無水碳酸鈉稱量產生的不確定度u（mRS）以及鹽酸標準滴定溶液滴定過程產生的不確定度u（V）。

（1）鹽酸標準滴定溶液濃度測量重復性產生的不確定度。鹽酸標準滴定溶液濃度測定的重復實驗結果如表2所示。

鹽酸標準滴定溶液第1次滴定濃度測量重復性產生的標準不確定度和相對標準不確定度分別為

鹽酸標準滴定溶液第2次滴定濃度測量重復性產生的標準不確定度和相對標準不確定度分別為

2次測量鹽酸標準滴定溶液濃度時，重復性產生的相對標準不確定度為

（2）工作基準試劑無水碳酸鈉本身產生的不確定度。工作基準試劑無水碳酸鈉本身產生的不確定度從含量和摩爾質量兩方面考慮?；鶞试噭o水碳酸鈉的含量為99.95%～100.05%，最大允許誤差為0.05%，干燥過程按國標要求，于300 ℃高溫爐中灼燒至恒重，得到基準試劑無水碳酸鈉的含量P為99.98%，認定為無其他不確定度來源。取矩形分布，則基準試劑無水碳酸鈉含量引入的標準不確定度和相對標準不確定度分別為

依據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）現(xiàn)行有效的原子量表，可知碳酸鈉（Na2CO3）各組成元素的原子量以及相對應元素的不確定度，如表3所示。對于每一個元素而言，標準不確定度是將IUPAC給出的不確定度作為矩形分布的邊界計算得出，因此對應的標準不確定度等于查得數(shù)值除以。

通過表3數(shù)據(jù)，可以計算出碳酸鈉的摩爾質量，即M（Na2CO3）=105.99 g·mol-1。同時，將各元素的原子量、標準不確定度數(shù)值與其對應的原子數(shù)相乘，得到Na2CO3中各元素對摩爾質量的貢獻以及相對應的不確定度分量，如表4所示。

基準試劑無水碳酸鈉摩爾質量引入的標準不確定度和相對標準不確定度分別為

工作基準試劑無水碳酸鈉自身產生的相對標準不確定度為

（3）工作基準試劑無水碳酸鈉稱量產生的不確定度。天平計量檢定證書（LE202125088）給出的測量結果的不確定度為U=0.3 mg，k=2。則其標準不確定度為U/k=0.000 15 g。線形分量需分別計算空盤和毛重，兩者的線形影響互不相關，故空盤的標準不確定度u（MRS1）=0.000 15 g，毛重的標準不確定度u（MRS2）=0.000 15 g。稱樣量m=0.1 g，則基準試劑無水碳酸鈉稱量產生的不確定度和相對標準不確定度為

（4）鹽酸標準滴定溶液滴定過程產生的不確定度。鹽酸標準滴定溶液滴定過程產生的不確定度包括滴定儀引入的不確定度、滴定單元引入的不確定度以及溫度效應引入的不確定度。自動電位滴定儀計量檢定證書（NW202107238）給出測量結果的相對擴展不確定度是U=0.02%，k=2。參考工作基準試劑無水碳酸鈉稱量產生的不確定度的計算公式，滴定儀的相對標準不確定度為urel（滴定儀）=0.000 1。同理，滴定單元計量檢定證書（NW202107299）給出測量結果的擴展不確定度是U=0.020 mL，k=2。滴定體積約37 mL，滴定單元的相對標準不確定度為urel（滴定單元）=0.000 270。20 ℃水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4 ℃-1，實驗室操作溫度變化不超過±3 ℃，按矩形分布處理，k=，溫度效應引起的相對標準不確定度urel（T）=0.000 363 7。因此，鹽酸標準滴定溶液濃度產生相對標準不確定度為

綜上，鹽酸標準滴定溶液濃度引入的相對標準不確定度為

2.2.3 蛋白粉試樣稱量產生的不確定度

天平計量檢定證書（LE202125088）給出測量結果的不確定度是U=0.3 mg，k=2。參考工作基準試劑無水碳酸鈉稱量產生的不確定度的計算公式，蛋白粉試樣稱量產生的標準不確定度u（m）=0.000 212 1 g。試樣稱重m=0.13 g，相對標準不確定度urel（m）=0.001 632。

2.2.4 蛋白粉前處理環(huán)節(jié)產生的不確定度

消化爐計量校準證書（RT202023831）給出測量結果的擴展不確定度是U=1.2 ℃，k=2。消化溫度420 ℃，換算成相對標準不確定度為。

2.2.5 蛋白粉定氮環(huán)節(jié)產生的不確定度

自動凱氏定氮儀計量校準證書（NW202102681）給出測量結果的相對擴展不確定度是U=3%，k=2。換算成相對標準不確定度為。

N的原子量為14.006 7，不確定度為0.000 2，

參考Na2CO3摩爾質量的相對標準不確定度計算方式得到N的相對標準不確定度為。故蛋白粉定氮過程中產生的相對標準不確定度為

2.2.6 合成標準不確定度和擴展不確定度評定

各項相對標準不確定度匯總如表5所示。從表中數(shù)據(jù)可知，蛋白粉中蛋白質含量測定不確定度的主要影響因素依次為定氮過程中產生的不確定度（占比75.86%）、樣品稱量產生的不確定度（占比8.25%）、樣品的前處理產生的不確定度（占比7.23%）、樣品測量重復性產生的不確定度（占比5.13%）和鹽酸標準滴定溶液濃度產生的不確定度（占比3.52%）。

蛋白粉中蛋白質含量測定的合成標準不確定度由表5中的各項相對標準不確定度合成，其結果為

置信概率為95%，包含因子k=2，則蛋白粉中蛋白質含量測定的相對擴展不確定度為Urel=urel（X）×k=0.030 42。蛋白質含量的平均值為86.90 g/100 g，則擴展不確定度為U=x×Urel=2.64 g/100 g。綜上，蛋白粉中蛋白質的測量結果為（86.90±2.64）g/100 g，k=2。

3 結論與討論

本研究依據(jù)GB 5009.5—2016中的第一法凱氏定氮法測定蛋白粉產品中蛋白質含量，參考CNAS-GL006：2019及JJF 1059.1—2012對測量不確定度進行評定。結果表明，蛋白粉產品中蛋白質含量測定結果為86.90 g/100 g，擴展不確定度為2.64 g/100 g。因此，該蛋白粉的蛋白質含量表示為（86.90±2.64）g/100 g。影響蛋白粉中蛋白質含量測定不確定度的主要因素為樣品測量重復性、鹽酸標準滴定溶液濃度、樣品稱量、樣品前處理及定氮過程。其中定氮過程的不確定度分量占比較大，其次是樣品的稱量、前處理、測量及鹽酸標準溶液滴定濃度。因此，要定期對自動凱氏定氮儀進行維護保養(yǎng)，保持儀器的檢測精度。在實驗的各個環(huán)節(jié)，包括樣品稱量、前處理以及滴定等過程中，操作條件和技能都應被嚴格加以控制，從而達到不斷降低不確定度，提高實驗數(shù)據(jù)準確性的目的。

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[13]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定：GB 5009.5—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

作者簡介：蘇君梅（1996—），女，湖北石首人，碩士，工程師。研究方向：食品和保健食品質量管理。

通信作者：劉春麗（1971—），女，江西臨汾人，碩士，工程師。研究方向：食品和保健食品質量管理。E-mail： 1040760028@qq.com。