關(guān)鍵詞 超臨界流體色譜；質(zhì)譜；接口；評(píng)述

20世紀(jì)80年代初， Peaden 等將超臨界CO₂作為新的流動(dòng)相引入到色譜分析中[1-2]，盡管其存在流動(dòng)相無毒、粘度低和易揮發(fā)等優(yōu)點(diǎn)，但基于超臨界流體的超臨界色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法（Supercritical fluidchromatography and mass spectrometry， SFC-MS）并未得到足夠的關(guān)注。自2012 年以來，儀器公司相繼推出了多款商業(yè)化SFC 分析系統(tǒng)，提高了SFC 在實(shí)驗(yàn)室和實(shí)際應(yīng)用場景的普及程度，有關(guān)SFC-MS 的研究論文數(shù)量也明顯增加。在Web of Science 中以“Supercritical fluid chromatography and mass spectrometry”與“SFC-MS”為關(guān)鍵詞，共檢索到3085 篇相關(guān)文章，內(nèi)容主要包括SFC 與質(zhì)譜的接口設(shè)計(jì)與應(yīng)用（圖1）。其中，質(zhì)譜電離方法除了常用的電噴霧離子源（Electrospray ionization， ESI）、大氣壓化學(xué)電離源（Atmospheric pressure chemical ionization， APCI）、大氣壓光電離（Atmospheric pressure photoionizationionization， APPI）外，還有UniSpary[3]、電感耦合等離子質(zhì)譜法（Inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）[4]以及質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜（Proton transfer reaction-mass spectrometry， PTR-MS）[5]等具有發(fā)展和應(yīng)用潛力的方法，應(yīng)用領(lǐng)域主要包括手性分離[6]、脂質(zhì)組學(xué)[7]、代謝組學(xué)[8]、興奮劑檢測(cè)[9-10]和毒品檢測(cè)[11-12]等。

本文介紹了SFC-MS 接口的設(shè)計(jì)原理以及其在應(yīng)用方面的發(fā)展歷程和現(xiàn)狀，歸納了不同類型接口的適用性，重點(diǎn)分析了接口設(shè)計(jì)中不同因素對(duì)檢測(cè)性能的影響，并總結(jié)了近年來SFC-MS 在不同領(lǐng)域中的應(yīng)用研究進(jìn)展。

1 SFC-MS 接口的分類

超臨界CO₂是SFC 最常用的流動(dòng)相，具有無毒、環(huán)境友好和易獲取等優(yōu)點(diǎn)，其臨界點(diǎn)為31.2 ℃、7.38 MPa，較易在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中實(shí)現(xiàn)。CO₂在電離過程中沒有直接作用，進(jìn)入大氣環(huán)境時(shí)會(huì)直接逸散，相比于液體流動(dòng)相，超臨界CO₂流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)更有利。SFC 需要在高壓條件（15～25 MPa）下進(jìn)行，而質(zhì)譜是在真空條件下工作的檢測(cè)裝置，因此，從SFC 色譜柱洗脫的分析物在進(jìn)入質(zhì)譜入口之前必須減壓。由于SFC 流動(dòng)相的可壓縮性較高，流動(dòng)相在接口內(nèi)部壓力下降時(shí)極易出現(xiàn)相分離，導(dǎo)致已經(jīng)溶解的化合物在管壁上析出，無法轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜裝置中，甚至發(fā)生堵塞[13]，這是SFC-MS 接口設(shè)計(jì)需要解決的最主要的問題。因此， SFC-MS 不能像LC-MS 那樣直接將液體從色譜柱出口轉(zhuǎn)移到電離源，必須采用特殊設(shè)計(jì)的接口保持色譜的完整性，并保證質(zhì)譜端有足夠的離子化強(qiáng)度。

目前，主流的儀器廠商已經(jīng)給出了SFC-MS 接口的完整解決方案，經(jīng)適當(dāng)調(diào)整，可以滿足大多數(shù)使用場景。然而，深入理解其內(nèi)在的運(yùn)作原理及優(yōu)缺點(diǎn)非常必要，這可使分析系統(tǒng)在更穩(wěn)定的狀態(tài)下運(yùn)行。目前， SFC-MS 接口所采用的設(shè)計(jì)方案可以分為全流式接口和分流式接口兩大類。

1.1 全流式接口

全流式接口將色譜流出的分析物全部或大部分引入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，因此適合APCI 等質(zhì)量敏感型的電離方法。如圖2 所示，全流式接口主要通過以下方式實(shí)現(xiàn)：（1）使用節(jié)流器直接引入；（2）使用液體泵控制壓力；（3）使用小體積自動(dòng)背壓調(diào)節(jié)器（Automated back-pressure regulator， ABPR）。

1.1.1 直接引入

Smith 等[14]在1982年首次提出了使用節(jié)流器進(jìn)行全流量引入的方法，其中，節(jié)流器起到了被動(dòng)壓力調(diào)節(jié)器的作用。如圖2A 所示，加熱節(jié)流器的出口或加熱整個(gè)節(jié)流器，可以緩解由于快速減壓而導(dǎo)致的SFC流動(dòng)相冷卻以及分析物沉淀的問題[15]。使用節(jié)流器的主要優(yōu)點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡單、柱外死體積小，缺點(diǎn)是操作靈活性降低、穩(wěn)定性差。通過節(jié)流器的壓降受內(nèi)部液體的密度、黏度和質(zhì)量流量的影響，因此，當(dāng)流動(dòng)相組分或流量發(fā)生變化時(shí)，接口兩端之間的壓降都會(huì)發(fā)生變化。在這種情況下，電離源電離性能受到內(nèi)部液體組成及其流量的影響較大。因此，在流動(dòng)相流量和組分方式變化的情況下，采用已設(shè)計(jì)好的節(jié)流器難以達(dá)到預(yù)期效果。然而， Pinkston[16]指出，如果使用低壓縮性的SFC 流動(dòng)相，采用節(jié)流器同樣能夠達(dá)到令人滿意的分析結(jié)果，因?yàn)榇藭r(shí)SFC 流動(dòng)相更像“液體”，壓力變化不會(huì)對(duì)流動(dòng)相產(chǎn)生較大影響。Hoke 等[17]使用CO₂-甲醇（35∶65， V/V）流動(dòng)相將SFC 流出的液體在送至節(jié)流器前進(jìn)行預(yù)熱（圖2A 虛線位置），通過控制溫度調(diào)節(jié)內(nèi)部液體的密度和黏度，從而保證通過節(jié)流器的壓降被限制在一定范圍內(nèi)。

1.1.2 壓力流控制的全流式接口

壓力流控制的全流式接口方案由Chester 和Pinkston[18]提出，整個(gè)方案未采用幾何結(jié)構(gòu)控制系統(tǒng)的壓力。如圖2B所示，從色譜柱流出的所有成分通過紫外（Ultraviolet， UV）檢測(cè)器后，液泵送入可與CO₂混溶的調(diào)壓流體，在零死體積三通中與流動(dòng)相混合后流向電離源。該調(diào)壓流可以添加與流動(dòng)相完全不同的組分，在不影響SFC分離過程的前提下，可通過引入不同溶劑和添加劑增強(qiáng)質(zhì)譜信號(hào)。盡管有這些優(yōu)點(diǎn)，但壓力流控制接口仍不夠靈活，原因在于傳輸管路的內(nèi)徑?jīng)Q定了兼容的流量/壓力組合范圍，在不同條件下需要選擇不同的管路。此外，該方法需要一個(gè)能夠提供無脈沖流的液泵與三通，增加了柱外死體積，并且額外的液流量還會(huì)增加電離源中的溶劑負(fù)荷。根據(jù)目標(biāo)壓力的不同，所需要的溶劑添加量也會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而改變分析物的濃度，影響定量分析結(jié)果。

1.1.3 帶補(bǔ)充液的ABPR控制接口

隨著小體積ABPR 的實(shí)際應(yīng)用，在接口中引入ABPR 成為可能。標(biāo)準(zhǔn)尺寸的ABPR 通常會(huì)顯著增加死體積，導(dǎo)致色譜峰展寬，造成色譜分辨率損失，使用小體積ABPR 可有效解決此問題。然而，該策略卻引發(fā)了另一個(gè)問題：從ABPR 流出的是完全減壓的CO₂流動(dòng)相，其溶解度可能無法保證將所有分析物傳輸?shù)劫|(zhì)譜。如果管路過長，該問題會(huì)更加嚴(yán)重。如圖2C 所示，該方案通過增加補(bǔ)充液泵解決分析物析出的問題。補(bǔ)充液可以在ABPR 之前或之后添加， Duval 等[19]以APCI 為電離源，比較了在ABPR 前后添加補(bǔ)充液的情況，得到了相近的定量分析結(jié)果。

1.2 分流式接口

兩種分流式接口方案如圖3 所示。在分流式接口中，只有少部分SFC 流動(dòng)相轉(zhuǎn)移到電離源，大部分SFC 流動(dòng)相通過ABPR 流出，其主要優(yōu)點(diǎn)是對(duì)ABPR 的限制較少。但是，流向電離源的流動(dòng)相減少，可能會(huì)影響質(zhì)譜響應(yīng)，這對(duì)于APCI 這類質(zhì)量敏感的電離方法影響很大。對(duì)于ESI 這類濃度敏感的技術(shù)[20]，流量損失并不會(huì)使質(zhì)譜響應(yīng)顯著降低，故此類接口通常與ESI 聯(lián)用，可得到更佳的分析性能。另外，流動(dòng)相減少可能會(huì)影響定量分析的準(zhǔn)確性，這是因?yàn)榱鲃?dòng)相壓力或其它環(huán)境條件的細(xì)小變化都會(huì)改變分流比。對(duì)此， Perrenoud 等[21]考察了操作參數(shù)對(duì)分流比及質(zhì)譜輸出信號(hào)的影響。

1.2.1 預(yù)分流接口

Zhao 等[22-23]在SFC 色譜柱出口采用零死體積三通將少部分（1%～20%）流動(dòng)相轉(zhuǎn)移到電離源入口，其余的流動(dòng)相通過UV 檢測(cè)器進(jìn)入ABPR（圖3A）。為了確保流向質(zhì)譜的流量較小，流向質(zhì)譜的流道的流動(dòng)阻力應(yīng)高于ABPR。由于分流裝置處于ABPR 控制下，因此該接口具有較好的靈活性，可通過ABPR 調(diào)節(jié)接口內(nèi)壓力以適應(yīng)不同條件。在限制管路長度與保證接口死體積最小的前提下，使用該接口可將色譜的分離結(jié)果完整地從SFC 轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜。但是，這種設(shè)置使得UV 和MS 兩個(gè)檢測(cè)器都未檢測(cè)到從色譜柱中流出的全部流動(dòng)相，這可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確和不全面。

1.2.2 后分流接口

圖3B 是目前SFC-MS 儀器廠商所提供的主流接口方案。該接口由兩個(gè)串聯(lián)的零死體積三通組成，在第一個(gè)三通添加由液泵輸送的補(bǔ)充液，在第二個(gè)三通將少部分流動(dòng)相轉(zhuǎn)移到電離源，剩余的流動(dòng)相通過ABPR 流出。該接口充分利用ABPR 和補(bǔ)充液泵，靈活調(diào)節(jié)輸送到電離源的液體流量和組分，減少樣品在接口內(nèi)的析出，從而獲得較高的靈敏度。

2 影響SFC-MS 接口性能的因素

2.1 接口幾何形狀的影響

接口的幾何形狀在減壓過程中起著關(guān)鍵作用。長徑比大的接口的效果最差，會(huì)導(dǎo)致接口內(nèi)部的壓力連續(xù)、漸進(jìn)、線性地降低。樣品通過此類接口減壓時(shí)在某點(diǎn)可能發(fā)生相分離，影響其在隨后的管路上繼續(xù)傳遞。Pinkston 指出[16]，對(duì)于長度≥1 m 的長接口，相變會(huì)導(dǎo)致CO₂"相和有機(jī)溶劑相分段流動(dòng)，產(chǎn)生“不穩(wěn)定、脈動(dòng)的ESI 噴射和鋸齒狀色譜峰”。相對(duì)地，長度較短且管徑較寬，但末端呈錐形或夾緊的管路結(jié)構(gòu)更加適用。

Smith 等[24]總結(jié)了用于SFC-MS 全流引入的出口幾何形狀（圖4）?；趯?shí)現(xiàn)可控減壓的設(shè)計(jì)初衷，這些幾何形狀仍然是現(xiàn)代SFC-MS 接口設(shè)計(jì)的重要參考依據(jù)。圖4A 的設(shè)計(jì)有兩段管路，第一段的直徑大于第二段。在確保第二段管路不過長且第一段管路不會(huì)引入顯著的流體阻力的前提下，這種接口設(shè)計(jì)優(yōu)于直徑較小且長度較長的接口設(shè)計(jì)。圖4B 是一個(gè)通過熔融和拉伸形成的錐形出口。毛細(xì)管未拉伸的部分便于在減壓膨脹之前對(duì)流體進(jìn)行有效加熱，但是拉伸也會(huì)降低接口的耐壓性能。此外，還可采用將熔融石英毛細(xì)管的封閉端打磨至所需直徑（圖4C）、在毛細(xì)管末端沉積材料進(jìn)行塑形（圖4D）、快速拉伸毛細(xì)管使其收縮（圖4E）或者在出口固定含小孔的膜片（圖4F）等方式制備接口。圖4G所示的出口與圖4D一樣采用了額外的填充材料。但是圖4G的出口填充更類似于構(gòu)成了一個(gè)亞微米尺寸顆粒的柱，形成了多個(gè)具有大長徑比的流體路徑。這種幾何結(jié)構(gòu)改善了揮發(fā)性化合物的運(yùn)輸，但對(duì)難揮發(fā)化合物會(huì)產(chǎn)生相反效果，因此難揮發(fā)的分析物在該結(jié)構(gòu)下極易發(fā)生堵塞。通過壓接毛細(xì)管與鉑銥管的末端制造約1 mm 長的接口（圖4H），可用于更高溫度和更多極性流體。

根據(jù)Smith 等[24]的研究，選擇接口幾何形狀的首要依據(jù)應(yīng)是分析物的揮發(fā)性。揮發(fā)性化合物能夠在較高的溫度下保證溶解性，因此首要選擇堅(jiān)固耐用且易更換的結(jié)構(gòu)。為了防止沉淀與堵塞，溶解性條件需要保持到接口末端。該研究建議將接口出口變細(xì)，這有助于在整個(gè)流道中保持較高的壓力，并在出口產(chǎn)生更大的壓力梯度。最近， Petruzziello 等[25]在其研究中得出了非常相似的結(jié)論，他們?cè)诂F(xiàn)有的專利接口基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，使新接口縮短了減壓過程的發(fā)生長度，這項(xiàng)改進(jìn)顯著提高了分析的可重復(fù)性，并減少了尖峰和起伏峰的出現(xiàn)。

2.2 補(bǔ)充液的影響

補(bǔ)充液的組成對(duì)電離和質(zhì)譜響應(yīng)有很大影響。與純CO₂相比，加入有機(jī)溶劑通常會(huì)使分析物具有更好的溶解度和更快的傳質(zhì)速度。但是， CO₂/有機(jī)溶劑混合物的溫度和壓力臨界點(diǎn)也隨組分比例的不同而改變，因此，在溫度和壓力控制中需要考慮其影響。優(yōu)化補(bǔ)充液組分可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化，特別是在代謝組學(xué)中，使同時(shí)分析不同濃度水平的代謝物成為可能。對(duì)于ESI，進(jìn)入電離源的補(bǔ)充液類型很重要，因?yàn)闅庀噘|(zhì)子親和會(huì)影響質(zhì)譜響應(yīng)。Amad 等[26]研究表明，在具有較高氣相質(zhì)子親和力的補(bǔ)充液存在的條件下，分析物電離會(huì)被抑制。添加的有機(jī)補(bǔ)充液濃度范圍通常為0.1%～2%或1～50 mmol/L，為了更好地洗脫極性化合物，研究者多在含有甲醇的混合補(bǔ)充液中添加低含量（1%～8%）水。

2017 年， West等[27]描述并實(shí)驗(yàn)證明了甲醇-CO₂"流動(dòng)相之間的反應(yīng)生成了單甲基碳酸，從而導(dǎo)致流動(dòng)相的酸性特征。然而，量子化學(xué)計(jì)算和紅外光譜證實(shí)了另一種反應(yīng)，包括導(dǎo)致碳酸形成的兩階段過程[28]。單甲基碳酸可以進(jìn)一步與甲醇反應(yīng)，生成碳酸二甲酯和水；隨后，水與CO₂"反應(yīng)生成碳酸。Haglind 等[29]的研究表明，原本無水的流動(dòng)相中后來存在水，這說明水是甲醇和CO₂"反應(yīng)的產(chǎn)物，證明了上述反應(yīng)過程的存在。

除了有機(jī)溶劑外，還可在流動(dòng)相中加入鹽（如甲酸銨）、酸（如甲酸、三氟乙酸）或堿（如氨水），以提高方法的可重復(fù)性，改善可電離物質(zhì)的峰形。Plachka 等[30]以91種化合物、3種固定相和2種有機(jī)溶劑為研究對(duì)象，通過添加水、甲酸和乙酸、氨和不同摩爾濃度的氨鹽，研究了SFC-ESI-MS 中補(bǔ)充液組成對(duì)色譜的影響。他們首先研究了不同有機(jī)溶劑以及補(bǔ)充液添加劑的影響趨勢(shì)，然后利用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)和矩陣圖計(jì)算物質(zhì)理化性質(zhì)與質(zhì)譜響應(yīng)之間的相關(guān)性，并進(jìn)行回歸分析，得到了理化性質(zhì)與SFC-MS 響應(yīng)之間的回歸方程。該方程可用于優(yōu)化補(bǔ)充液添加劑的選擇與組成，減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間并簡化了程序。

2.3 溫度的影響

在與接口相關(guān)的所有參數(shù)中，溫度是避免相分離的關(guān)鍵參數(shù)。加熱SFC-MS 接口作為一種有效方法已經(jīng)應(yīng)用了很長時(shí)間。隨著流體溫度升高，質(zhì)譜信號(hào)得到改善。對(duì)于純CO_2"流動(dòng)相，為了獲得良好的流動(dòng)特性，以及避免CO_2"膨脹過程中兩相分離，進(jìn)入接口前的流動(dòng)相溫度應(yīng)至少為80～100 ℃。如果可以在整個(gè)接口內(nèi)保持恒溫，避免相分離的溫度應(yīng)更低。這是在流體膨脹之前對(duì)其以及接口進(jìn)行加熱處理能夠顯著提升對(duì)低揮發(fā)性化合物檢測(cè)效果的原因。對(duì)于添加有機(jī)補(bǔ)充液的情況，則需根據(jù)混合相的組分比例及熱力學(xué)性質(zhì)選擇加熱溫度，相關(guān)理論可參考文獻(xiàn)[31]。簡單而言，如果CO₂/有機(jī)溶劑混合流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑濃度增加，通常需要更高的溫度避免相分離。

另一種避免相分離的方法是冷卻流體，使其盡可能像液體[32]。以CO₂/甲醇（70∶30， n/n）混合物為流動(dòng)相，假設(shè)初始?jí)毫?50 bar （1 bar=0.1 MPa）， 如果溫度降至0 ℃，流體在接口內(nèi)須減壓到25 bar 才發(fā)生相分離。假設(shè)壓力在內(nèi)部線性下降，相分離只會(huì)發(fā)生在接口長度的最后1/6 部分；如果使用的接口出口端存在縮口，能夠產(chǎn)生大于25 bar 的壓降，則可完全避免在接口內(nèi)部出現(xiàn)相分離。

2.4 電離源與質(zhì)譜響應(yīng)

靈敏度與分析物的種類、樣品基質(zhì)、流動(dòng)相、補(bǔ)充液組成和分析儀器密切相關(guān)，因此，評(píng)估并比較不同色譜技術(shù)對(duì)同一分析物的分析靈敏度水平并不容易。相比于LC-MS， SFC-MS 在分析葡萄糖苷酸和硫酸鹽類固醇[33]、美沙酮[34]、尿液中的興奮劑[7]以及血清中的維生素D代謝物[35]時(shí)具有更高的靈敏度。

不同的電離源在SFC-MS 中的性能也存在差異。Parr 等[36]使用全流式接口比較了SFC-MS 下離子源分別為ESI、APPI 和APCI 時(shí)質(zhì)譜的檢出限和靈敏度，認(rèn)為ESI 最適于多組分分析，其它電離技術(shù)更適于單獨(dú)分析特定的分析物。例如，單獨(dú)分析孕二醇時(shí)， APCI+優(yōu)于APPI+和ESI+。Matsubara 等[37]也強(qiáng)調(diào)了ESI 在結(jié)構(gòu)解析方面的優(yōu)勢(shì)，在類胡蘿卜素和環(huán)氧類胡蘿卜素的SFC 分析中，采用ESI 可檢測(cè)到結(jié)構(gòu)特異性產(chǎn)物離子，而使用APCI 時(shí)未檢出。Liu 等[35]在分析血清中維生素D代謝物時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用ESI 的信噪比高出APCI 約4～6倍。Wolrab 等[38]認(rèn)為ESI 和APCI 在分析氨基酸及相關(guān)化合物時(shí)的敏感性依賴于分析物。但是，也有研究表明ESI 和APCI 的靈敏度相似[39]。

Mostafa 等[40]設(shè)計(jì)了一種新的納噴霧電離源以及對(duì)應(yīng)的接口，這種電離源能夠產(chǎn)生更小的電噴霧液滴。該接口使用了ABPR，并在ABPR 之后進(jìn)行分流，少部分流動(dòng)相通過電離源電離進(jìn)入色譜。他們構(gòu)建了3種內(nèi)徑尺寸（25、50和75 μm）的電離源，并對(duì)有機(jī)溶劑比以及流量進(jìn)行了優(yōu)化。將最終結(jié)果與傳統(tǒng)的SFC-ESI 進(jìn)行比較，結(jié)果表明，不論采用哪種尺寸的電離源，系統(tǒng)的信號(hào)強(qiáng)度都增強(qiáng)了10 倍。

SFC-MS 分析通常在酸性條件下進(jìn)行，流動(dòng)相的pH 值通常在5 左右，原因是甲醇-CO₂"以及水-CO₂"之間的反應(yīng)。Akbal 等[41]依次檢測(cè)了添加酸性、中性、堿性以及緩沖溶液后的CO₂"噴霧的pH 值。結(jié)果表明，無論哪種條件，噴霧的pH 值都在3.8～7.2范圍內(nèi)，這表明SFC 分析總是在酸性到中性條件下進(jìn)行。酸性條件會(huì)降低ESI 負(fù)離子模式下的靈敏度，因?yàn)槿ベ|(zhì)子化在堿性條件下更易發(fā)生。在SFC-MS 中， ESI的負(fù)離子模式下的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度比正離子模式低10倍。因此，有必要進(jìn)一步研究流動(dòng)相酸性對(duì)質(zhì)譜靈敏度的影響，特別是在負(fù)離子模式的ESI 中。

3 SFC-MS 接口技術(shù)的應(yīng)用

3.1 脂質(zhì)組學(xué)

脂質(zhì)組學(xué)是研究生物體表達(dá)的全部脂質(zhì)或某一體系中所有脂質(zhì)的科學(xué)，不僅需要獲得包含個(gè)體脂質(zhì)組成和豐度信息的“脂質(zhì)譜”，還需要全面了解生物樣品中脂質(zhì)的各種功能[42]。Uchikata 等[43]建立了一套基于SFC 的磷脂分析系統(tǒng)，可在5min 內(nèi)提取3 μL 血漿中的磷脂，并在15min 內(nèi)完成分析，共提取到134 種磷脂，其中， 74種磷脂的分析具有良好的重復(fù)性。Lísa研究組[44]報(bào)道了一種高通量的脂質(zhì)組學(xué)分析方法，以甲醇-水-乙酸銨混合物為梯度改性劑，以1.7μm 顆粒橋接乙烯雜化硅柱為色譜柱，采用UHPSFC 法進(jìn)行脂類分離，可在單次運(yùn)行中分離24個(gè)脂類，其中包含436種脂質(zhì)（圖5A）。

Yang 等[45]建立了一種基于真空溶劑蒸發(fā)接口的在線二維色譜方法，首先通過一維SFC 分離脂類，再通過二維RPLC 分離不同種類的脂類分子。該系統(tǒng)檢測(cè)11 個(gè)脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的回收率均大于88%，脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限均在ng/mL 級(jí)，采用該方法可在38 min 內(nèi)鑒定出人血漿中10 個(gè)脂類中的370 種內(nèi)源性脂質(zhì)。該研究利用十字雙位閥的真空蒸發(fā)接口，經(jīng)過一維SFC 柱的流動(dòng)相在流過回路時(shí)由真空泵蒸發(fā)。通過閥門的自動(dòng)切換，兩個(gè)回路交替捕獲分析物并將其轉(zhuǎn)移到二維液相色譜，建立了無需中途停止的二維SFC/RPLC 系統(tǒng)。

De Kock 等[46]開發(fā)了一種高速定量分析類固醇激素的UPSFC-MS/MS 方法。該方法在ESI 正離子模式下具有良好的穩(wěn)定性、選擇性和高靈敏度，在5 min 內(nèi)可從50 μL 人血漿樣本中分析19種類固醇。該方法線性度良好，相關(guān)系數(shù)為0.9983～0.9999，日內(nèi)和日間精密度（RSD）均小于15%，對(duì)19種分析物的準(zhǔn)確度在80%～116%之間。

Jiang 等[47]利用UPSFC-MS 開發(fā)了一種新型極性脂質(zhì)分析方法，可分離并定量分析18 個(gè)脂類。利用該系統(tǒng)以7 份生物乳汁及乳制品為樣品，在10min 內(nèi)可檢測(cè)并定量分析219 種不同的極性脂質(zhì)。經(jīng)過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，與其它哺乳動(dòng)物相比，人乳中的極性脂質(zhì)組成明顯不同。人乳的極性脂質(zhì)濃度較低，但膽固醇和鞘磷脂含量較高。在檢測(cè)的所有動(dòng)物乳汁樣品種類中，驢乳的極性脂質(zhì)中鞘磷脂的相對(duì)含量與人乳最接近，可能是一種潛在的嬰兒配方奶粉原料（圖5B）。

Wolrab 等[48]利用以UHPSFC-MS 為主的多種質(zhì)譜方法對(duì)胰腺癌患者與健康人的血清樣本進(jìn)行分析，結(jié)果表明，胰腺癌患者與健康對(duì)照組樣本的脂質(zhì)組成存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（圖5C）。根據(jù)樣本結(jié)果訓(xùn)練出的方法在診斷胰腺癌時(shí)敏感性和特異性上均超過90%，與現(xiàn)有的診斷影像學(xué)方法相當(dāng)。此外，該研究組還分析了腎癌、乳腺癌和前列腺癌患者的血漿脂質(zhì)組學(xué)特征與健康對(duì)照組的差異[49]，給出了統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異最顯著的7 種脂質(zhì)，這些脂質(zhì)有望成為癌癥篩查的標(biāo)志物。

Kozlov 等[50]開發(fā)了一種單平臺(tái)的SFC-MS 脂質(zhì)組學(xué)/代謝組學(xué)方法，可以在儀器、色譜柱、流動(dòng)相和改性劑相同的條件下，通過連續(xù)兩次進(jìn)樣分析血漿中的脂質(zhì)和極性代謝物（圖5D）。作者圍繞系統(tǒng)的壓力控制、結(jié)果的長期可重復(fù)性和色譜性能，對(duì)流速梯度程序、補(bǔ)充液以及流動(dòng)相做了選擇與優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)在24 min內(nèi)識(shí)別9 類脂質(zhì)與39 種代謝物，并且在50 次重復(fù)檢測(cè)中分析物的保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差lt;0.011 min。

3.2 手性分離

SFC被認(rèn)為是對(duì)映體分離的首選，與LC相比，在分離結(jié)果幾乎相同的情況下， SFC 的運(yùn)行時(shí)間會(huì)大幅降低，極大地提高了分析檢測(cè)的效率。在市售合法藥物的成分中只存在純S 型安非他明（S-Amphetamine），利用SFC-MS 監(jiān)測(cè)生物樣本中是否存在R 型安非他明（R-Amphetamine）可以區(qū)分非法合成的和作為醫(yī)療用藥的安非他明[51]，并作為判斷是否吸毒的參考依據(jù)之一。此外，明確R/S-安非他明的相對(duì)含量也可以推斷出毒品的合成方法，協(xié)助尋找制毒地點(diǎn)。利用SFC 獲取植物藥物的對(duì)映體組成還可為表征草藥產(chǎn)品提供方案，避免與成分相似的化學(xué)合成藥物或外觀相似的植物藥物混淆[52]。

Yang 等[53]以卡馬西平（Carbamazepine）為內(nèi)標(biāo)，建立了一種基于SFC-MS 的快速靈敏測(cè)定比格犬血漿中奧卡西平（Oxcarbazepine， OXC）及其手性代謝物尼卡巴嗪（Licarbazine， Lic）的方法。OXC 在口服后會(huì)被還原酶迅速代謝為Lic，其藥理活性高于母體化合物，具有較好的抗癲癇作用。Lic 在人血漿中以S-Lic 和R-Lic 的對(duì)映體混合物的形式出現(xiàn)，比例約為5∶1。該方法的運(yùn)行時(shí)間僅為3 min， OXC 濃度在5～1000 ng/mL 范圍內(nèi)和Lic 對(duì)映體濃度（0.5～100 ng/mL）呈線性關(guān)系，定量下限分別為5.0 和0.5 ng/mL。

Gou 等[54]報(bào)道了一種基于手性異構(gòu)體比例分析中成藥質(zhì)量的評(píng)價(jià)策略。以不同制藥企業(yè)的158 批元虎止痛片為樣本，通過HPLC 提取其中的四氫帕馬汀（Tetrahydropalmatine， THP）。THP 有兩種對(duì)映體（d-THP 與l-THP（羅通定）），在元虎止痛片的原料延胡索中，這兩種對(duì)映體將以相對(duì)穩(wěn)定的比例共存。對(duì)分離純化的THP 進(jìn)行SFC 分離，結(jié)果表明，正常藥品樣本的d-THP 與l-THP 的峰面積比與延胡索中的比例相近，峰面積比約為60∶40。然而，在有問題的樣本中d-THP 明顯減少，峰面積比為10∶90。這表明部分制藥企業(yè)可能沒有嚴(yán)格遵守處方配比和生產(chǎn)規(guī)則，使用劣質(zhì)的延胡索原料，并在生產(chǎn)過程中添加化學(xué)原料羅通定，以達(dá)到中國藥典的定量標(biāo)準(zhǔn)。

在藥物的手性化合物純化過程中，制備型SFC 比制備型LC 具有顯著優(yōu)勢(shì)[55]。由于超臨界流動(dòng)相的黏度較低，可以使用更高的流動(dòng)相流速，從而提高SFC 分離的速度。此外，以CO_2"取代大部分流動(dòng)相，制備型SFC 的有機(jī)溶劑消耗會(huì)大大減少，并且CO_2"可在柱后通過降低壓力很容易地去除并回收，大大降低了去除溶劑所需的人力和時(shí)間及能源成本。最后， CO₂"作為主要流動(dòng)相成分也使色譜法更加環(huán)保。Wilson 等[56]開發(fā)了一種用于分離羥氯喹（Hydroxychloroquine， HCQ）的SFC 制備方法，在2 h 內(nèi)收集了363mg R 對(duì)映體和338mg S 對(duì)映體，對(duì)映體純度超過99%。

Xin 等[57]采用手性SFC 對(duì)木脂素的4 種非對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行了制備級(jí)分離純化。這4 種木脂素具有抗神經(jīng)炎癥活性，可用作消炎類藥物。由于單一的非手性HPLC 方法和非手性SFC 方法都不能分離這4 種非對(duì)映異構(gòu)體，該研究建立了層疊式自動(dòng)進(jìn)樣的兩步純化方法。首先，在第一個(gè)手性固定相（Chiralstationary phase， CSP）上分離，將4種木脂素分成兩對(duì)；然后，在第二個(gè)CSP 上分別將兩對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體兩兩分離。以710 mg 提取物為原料，采用該方法成功分離出4 種非對(duì)映異構(gòu)體，產(chǎn)量分別為103.1、10.0、152.3 和178.6 mg， 純度均大于98%。

4 總結(jié)與展望

本文總結(jié)了設(shè)計(jì)和開發(fā)合適的SFC-MS 接口需要考慮的因素， SFC-MS 接口使SFC 和MS 兩個(gè)系統(tǒng)能夠更好地耦合。隨著SFC儀器和色譜柱技術(shù)的發(fā)展，其強(qiáng)大的分離能力與非常靈敏的質(zhì)譜檢測(cè)相結(jié)合，使SFC-MS 在某些領(lǐng)域可以達(dá)到與LC-MS 互補(bǔ)的水平。SFC-MS 可用于多種樣品的分析，從疏水物質(zhì)（如脂質(zhì)或脂溶性維生素）的正常相分離，到中極性物質(zhì)（如藥物或天然產(chǎn)物）的反相分離。特別是在一些重要的應(yīng)用場景，如脂質(zhì)組學(xué)研究中， SFC-MS 表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)，能夠在一次分離過程中同時(shí)測(cè)定極性和非極性物質(zhì)，這是傳統(tǒng)的色譜技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)的。目前， SFC-MS 正進(jìn)入相對(duì)成熟的發(fā)展階段，其基礎(chǔ)和應(yīng)用研究越來越豐富，對(duì)這一領(lǐng)域的持續(xù)關(guān)注將有助于SFC-MS 技術(shù)的普及和發(fā)展。