〔摘要〕 目的 利用轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）刺激人成纖維細胞HFL-1模擬特發(fā)性肺纖維化的病理過程，探討黃芪甲苷（astragaloside-Ⅳ， AS-Ⅳ）對人成纖維細胞凋亡和肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的作用和機制。方法 采用10 ng/mL TGF-β1刺激HFL-1細胞，給予不同濃度（0、1.25、2.5、5、10 μmol/L）的AS-Ⅳ溶液干預(yù)24 h后，利用RT-PCR檢測纖連蛋白（fibronectin， FN）mRNA表達量。隨后細胞分為空白組、TGF-β1組、TGF-β1+AS-Ⅳ組、TGF-β1+XAV939組。采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率;采用RT-PCR法檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）、FN、重組人膠原蛋白-1（collagenⅠ）、B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2， Bcl-2）及Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax） mRNA表達情況;采用免疫熒光法檢測α-SMA、上皮細胞鈣黏蛋白（E-Cadherin）、collagenⅠ、FN、β-聯(lián)蛋白（β-catenin）及半胱氨酸蛋白酶蛋白-3（Cleaved Caspase-3）的蛋白表達;Western blot檢測FN、β-catenin、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平。結(jié)果 與空白組比較，TGF-β1組細胞凋亡率上升（Plt;0.05），F(xiàn)N、collagenⅠ、α-SMA和Bcl-2 mRNA表達增加（Plt;0.05），Bax mRNA表達減少（Plt;0.05），α-SMA、collagenⅠ、FN、Cleaved Caspase-3及β-catenin蛋白表達增加（Plt;0.05）;與TGF-β1組比較，TGF-β1+AS-Ⅳ組和TGF-β1+XAV939組細胞凋亡率下降（Plt;0.05），F(xiàn)N、collagenⅠ、α-SMA和Bcl-2 mRNA表達減少（Plt;0.05），Bax mRNA表達增加（Plt;0.05），α-SMA、collagenⅠ、FN、Cleaved Caspase-3及β-catenin蛋白表達減少（Plt;0.05）;與TGF-β1+XAV939組相比較，TGF-β1+AS-Ⅳ組細胞凋亡率下降（Plt;0.05），F(xiàn)N、collagenⅠ、Bcl-2和α-SMA mRNA表達量降低（Plt;0.05），Bax mRNA表達量增加（Plt;0.05）。結(jié)論 AS-Ⅳ可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細胞凋亡和肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，該作用可能與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 黃芪甲苷;特發(fā)性肺纖維化;成纖維細胞;肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化;Wnt;β-聯(lián)蛋白;凋亡

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.12.006

Effects of astragaloside-Ⅳ on human fibroblast apoptosis and myofibroblast transformation by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway

XIAO Xuefei1， LIU Shi1， FU Yan1， YOU Baiwen2*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China

〔Abstract〕 Objective To simulate the pathological process of idiopathic pulmonary fibrosis （IPF） by stimulating human fibroblast （HFL-1） cells with transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， and to explore the effects and mechanism of astragaloside-Ⅳ （AS-Ⅳ） on human fibroblast apoptosis and myofibroblast transformation. Methods HFL-1 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β1 and then treated with different concentrations （0， 1.25， 2.5， 5， 10 μmol/L） of AS-Ⅳ solution for 24 h. The mRNA expression of fibronectin （FN） was determined by RT-PCR. Subsequently， the cells were divided into blank group， TGF-β1 group， TGF-β1+AS-Ⅳ group， and TGF-β1+XAV939 group. Flow cytometry was used to measure cell apoptosis rate， RT-PCR to examine the mRNA expressions of α-smooth muscle actin （α-SMA）， FN， recombinant human collagen-1 （collagen Ⅰ）， B-cell lymphoma 2 （Bcl-2）， and Bcl-2 associated X protein （Bax）， immunofluorescence to determine the protein expressions of α-SMA， E-Cadherin， collagen Ⅰ， FN， β-catenin， and Cleaved Caspase-3， and Western blot to check the protein expression levels of FN， β-catenin， and Cleaved Caspase-3. Results The optimal concentration of AS-Ⅳ for inhibiting FN expression was 5 μmol/L. Compared with the blank group， the cell apoptosis rate in the TGF-β1 group increased （Plt;0.05）， the mRNA expressions of FN， collagen Ⅰ， α-SMA， and Bcl-2 were elevated （Plt;0.05）， while Bax mRNA expression decreased （Plt;0.05）. Additionally， the protein expressions of α-SMA， collagen Ⅰ， FN， Cleaved Caspase-3， and β-catenin also increased （Plt;0.05）. Compared with the TGF-β1 group， both the TGF-β1+AS-Ⅳ group and TGF-β1+XAV939 group showed decreased cell apoptosis rates （Plt;0.05）， reduced mRNA expressions of FN， collagen Ⅰ， α-SMA， and Bcl-2 （Plt;0.05）， increased Bax mRNA expression （Plt;0.05）， and decreased protein expressions of α-SMA， collagen Ⅰ， FN， Cleaved Caspase-3， and β-catenin （Plt;0.05）. Compared with the TGF-β1+XAV939 group， the cell apoptosis rate in the TGF-β1+AS-Ⅳ group decreased （Plt;0.05）， the mRNA expressions of FN， collagen Ⅰ， Bcl-2， and α-SMA decreased （Plt;0.05）， while that of Bax increased （Plt;0.05）. Conclusion AS-Ⅳ can inhibit TGF-β1-induced HFL-1 cell apoptosis and myofibroblast transformation， which may be related to the Wnt/β-catenin signaling pathway.

〔Keywords〕 astragaloside-Ⅳ; idiopathic pulmonary fibrosis; fibroblast; myofibroblast transformation; Wnt; β-catenin; apoptosis

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis， IPF）是一種常見的以氣道重塑、炎癥、肺泡破壞和纖維化為特征的致死性間質(zhì)性肺病[1-2]。IPF也是進展最快的纖維化疾病之一，其診斷后中位生存期為3.5年[3]，5年生存率僅為20%～30%[4]。近十年，IPF相關(guān)臨床試驗呈指數(shù)級增長，其中吡非尼酮和尼達尼布這兩種藥物用于治療IPF[5-6]。然而，該藥物只能減緩患者疾病進展的速度，進行性的肺纖維化最終仍會導(dǎo)致患者死亡。因此，目前迫切需要新的抗纖維化藥物延緩IPF患者的疾病進程，改善患者的生活質(zhì)量。臨床研究及薈萃分析結(jié)果表明，中藥在改善IPF患者的肺功能、運動能力和生活質(zhì)量等方面具有良好的療效[7-8]。中醫(yī)立足于患者整體，其治療作用具有多環(huán)節(jié)、多靶點的特點。

目前研究認為，IPF發(fā)病的主要原因是反復(fù)肺泡上皮細胞（alveolar epithelial cell， AEC）損傷[9-10]。初始損傷會導(dǎo)致AEC異常激活，從而在纖維化環(huán)境中聚集產(chǎn)生膠原的成纖維細胞和肌成纖維細胞。肌成纖維細胞不存在于正常肺組織中，但肌成纖維細胞是膠原和其他基質(zhì)蛋白的重要產(chǎn)生者，促進成纖維細胞凋亡和抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，能有效抑制肺纖維化[11]。而轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）促進肌成纖維細胞分化和膠原表達的關(guān)鍵細胞因子，在肺纖維化的進展中起到了重要的作用[12]。迄今為止，已提出通過3種肌成纖維細胞募集機制，肺成纖維細胞的增殖和分化、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、骨髓來源的纖維細胞或循環(huán)祖細胞向成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，其中纖連蛋白（fibronectin， FN）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）、重組人膠原蛋白-1（collagenⅠ）是成纖維細胞轉(zhuǎn)化肌成纖維細胞過程中常見的標志物，在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[13]。

Wnt/β-聯(lián)蛋白（Wnt/β-catenin）是一個在進化上高度保守的細胞信號系統(tǒng)，在胚胎發(fā)育、維持器官及組織穩(wěn)態(tài)方面，發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，并且與人類許多疾病的發(fā)病機制有關(guān)。目前，已有大量研究證實經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路在肺纖維化起到重要的作用。SONG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt1處理人成纖維細胞能促進細胞增殖，使得α-SMA、波形蛋白和Ⅰ型膠原表達量顯著增加。從博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠提取支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)人成纖維細胞也能起到相同作用，而轉(zhuǎn)染β-catenin shRNA序列可抑制這一過程。由此可知Wnt1/β-catenin信號通路可促進人成纖維細胞增殖，誘導(dǎo)人成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，促進細胞外基質(zhì)沉積。

黃芪甲苷（astragaloside-Ⅳ， AS-Ⅳ）是黃芪的有效活性成分之一，是我國藥典檢測黃芪質(zhì)量的指標成分之一。目前，AS-Ⅳ的抗纖維化作用已得到研究證實。研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ能夠通過減少細胞外基質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[15-16]，但其作用機制有待進一步探究。本實驗研究以人成纖維細胞HFL-1細胞作為研究對象，探討AS-Ⅳ通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路對人成纖維細胞凋亡和肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化的作用。

1 材料

1.1" 細胞

人成纖維細胞HFL-1細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：CL-0106）。

1.2" 藥品與試劑

AS-Ⅳ（上海研域生物科技有限公司，批號：110781-200512）;含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的完全培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號分別為PM150910、164210、PB180120）;胰蛋白酶（美國Cytiva公司，批號：SH40003.01）;細胞凋亡檢測試劑盒（蘇州四正柏生物公司，批號：20220718）;TGF-β1抗體（美國Peprotech公司，批號：100-21-10uG）;蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、山羊抗兔免疫球蛋白抗體、山羊抗鼠免疫球蛋白抗體（中國Abiowell公司，批號分別為AWB0136、AWB0104、AWH0645、AWH0650、AWS0002、AWS0

001）;mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國北京康為世紀生物科技有限公司，批號分別為CW2569、CW2141）;總RNA抽提試劑盒（美國Thermo公司，批號：15596026）;β-actin抗體、PCNA抗體、FN抗體、GAPDH抗體（美國proteintech公司，批號分別為66009-1-Ig、10205-2-AP、66042-1-Ig、10494-1-AP）;β-catenin抗體（湖南艾方生物公司，批號：AF10715）;半胱氨酸蛋白酶蛋白-3（Cleaved Caspase-3）抗體（美國CST公司，批號：9664T）;抗熒光淬滅封片劑（美國South biotech公司，批號：0100-01）;Tankyrase抑制劑XAV939（美國Target Molecule Corp公司，批號：225249）。

1.3" 儀器

HERAcell2401型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）;XDS-3型倒置生物顯微鏡（中國粵顯光學(xué)儀器有限責任公司）;Enspire 型多功能酶標儀（美國Perkinelmer公司）;H1850R型臺式冷凍離心機（中國湖南湘儀公司）;BD FACSAria Ⅲ流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）;TS-1型水平搖床（中國江蘇其林貝爾公司）;DYCP-31BN型電泳槽、DYCZ-40D型蛋白轉(zhuǎn)印槽、DYCZ-24FN型高電流電泳儀（北京六一生物科技有限公司）;ChemiScope 6000系列化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國勤翔公司）;ViiATM 7型熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）;BioDrop ulite型核酸蛋白濃度測定儀（英國Biochrom公司）;Eclipse CI型正置熒光顯微鏡、DS-u3型成像系統(tǒng)（日本尼康公司）。

2 方法

2.1" 細胞培養(yǎng)

人胚肺成纖維細胞HFL-1細胞用含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的完全培養(yǎng)基在37 ℃ 5%CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到80%時進行傳代。

2.2" AS-Ⅳ藥物溶液配制

AS-Ⅳ用二甲基亞砜溶解成高濃度（100 mmol/L）的儲備液，分裝后-20 ℃避光保存;臨用時用含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的完全培養(yǎng)基稀釋成5 μmol/L的干預(yù)濃度。

2.3" 細胞分組與干預(yù)

HFL-1細胞分為空白組、TGF-β1組、TGF-β1+AS-Ⅳ組、TGF-β1+XAV939組。其中，空白組給予含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;TGF-β1組給予含10 ng/mL TGF-β1的培養(yǎng)基干預(yù)24 h，觀察細胞形態(tài)，細胞從橢圓形變成長條形;TGF-β1+AS-Ⅳ組給予含10 ng/mL TGF-β1和5 μmol/L AS-Ⅳ培養(yǎng)基干預(yù)24 h;TGF-β1+XAV939組給予含10 ng/mL TGF-β1和5 μmol/L XAV939培養(yǎng)基干預(yù)24 h[17]。

2.4" 指標檢測

2.4.1" 最佳濃度的選取" 取對數(shù)生長期HFL-1細胞胰蛋白酶消化后細胞計數(shù)，6孔板每孔加入HFL-1細胞懸液，培養(yǎng)過夜后，每孔加入100 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基同步化24 h，分為6組?？瞻捉M不含細胞、只含等體積培養(yǎng)基;其余5組加入10 ng/mL TGF-β1，再分別加入0、5、10、20、40 μmol/L的AS-Ⅳ分別加入TGF-β1組、5 μmol/LAS-Ⅳ組、10 μmol/LAS-Ⅳ組、20 μmol/LAS-Ⅳ組、40 μmol/LAS-Ⅳ組。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育72 h，隨后采用RT-PCR檢測FN的mRNA表達量。半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration， IC50）=抑制率/抑制劑濃度-log（抑制率/抑制劑濃度），采用GraphPad Prism 9.0軟件計算相應(yīng)的IC50值。

2.4.2" 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率" 用細胞凋亡檢測試劑盒進行流式細胞術(shù)測定，取對數(shù)生長期HFL-1細胞，用2.3所示干預(yù)濃度及分組處理，24 h后收集細胞上清液至離心管，用不含EDTA的胰蛋白酶消化貼壁細胞，將消化好的細胞與收集好的上清混合后離心，吸除上清液，用預(yù)冷PBS洗滌2次后加入100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞，每管細胞分別加入5 μL的FITC-Annexin V和5 μL的PI工作液，放置室溫避光孵育10 min，再加入400 μL的PBS混合后用流式細胞儀進行檢測，結(jié)果用FlowJo軟件分析。

2.4.3" RT-PCR法檢測FN、collagenⅠ、Bax、Bcl-2、α-SMA mRNA的表達" 細胞按2.3的分組方法給藥，用RNA提取液提取總RNA，采用mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為50 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，詳見表1。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，對各基因進行PCR擴增，擴增采用95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，40個循環(huán)，65 ℃延伸1 min。使用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

2.4.4" 免疫熒光染色法檢測α-SMA、E-Cadherin、collagenⅠ、FN、Cleaved Caspase-3、β-catenin蛋白表達" 細胞按2.3的分組方法給藥后，用4%多聚甲醛固定15 min。加入100 μL破膜工作液，室溫孵育10 min，3% BSA封閉30 min。分別加入α-SMA（1∶100）、E-Cadherin（1∶200）、collagenⅠ（1∶200）、FN（1∶200）、Cleaved Caspase-3（1∶200）、β-catenin（1∶200）一抗稀釋液4 ℃孵育。PBS洗滌后加二抗稀釋液室溫孵育，孵育完成后PBS洗滌，再加DAPI染液室溫避光染色，用抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image J軟件分析平均熒光強度。

2.4.5" Western blot檢測FN、β-catenin、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平" 按2.3的分組方法給藥后，使用RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用封閉液室溫封閉2 h，加入β-actin（1∶5 000）、PCNA（1∶5 000）、FN（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000）、β-catenin（1∶1 000）、Cleaved Caspase-3（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜。膜用TBST洗3次，加入二抗（1∶5 000）室溫下孵育2 h，TBST洗3次后顯影成像，用Image J軟件對結(jié)果進行分析。

2.5" 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布用“x±s”表示，多組間比較使用單因素方差分析，多重比較使用Holm-Sidak檢驗。數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性和（或）方差齊性用Kruskal-Wallis檢驗。

3 結(jié)果

3.1" AS-Ⅳ最佳濃度的篩選

與空白組比較，其余各組細胞FN mRNA表達量上升（Plt;0.05）;與TGF-β1組比較，AS-Ⅳ各濃度組細胞FN mRNA表達量均下降（Plt;0.05）;與5 μmol/L AS-Ⅳ組比較，10 μmol/L AS-Ⅳ組、20 μmol/L AS-Ⅳ組、40 μmol/LAS-Ⅳ組細胞FN的mRNA表達量上升（Plt;0.05）;與10、20 μmol/L AS-Ⅳ組比較，40 μmol/L AS-Ⅳ組細胞FN的mRNA表達量上升（Plt;0.05）。經(jīng)計算IC50值，5 μmol/L AS-Ⅳ組、10 μmol/L

AS-Ⅳ組、20 μmol/L AS-Ⅳ組、40 μmol/L AS-Ⅳ組的IC50值分別為1.01、1.43、1.70、2.46，所以選擇5 μmol/L的AS-Ⅳ組為后續(xù)實驗組。詳見表2。

3.2" AS-Ⅳ對TGF-β1誘導(dǎo)下HFL-1細胞凋亡的影響

與空白組比較，其余各組細胞凋亡率升高（Plt;0.05）;與TGF-β1組比較，TGF-β1+AS-Ⅳ組和TGF-β1+XAV939組細胞凋亡率降低（Plt;0.05）;與TGF-β1+AS-Ⅳ組比較，TGF-β1+XAV939組細胞凋亡率升高（Plt;0.05）。詳見圖1、表3。

3.3" AS-Ⅳ對TGF-β1誘導(dǎo)下HFL-1細胞FN、collagenⅠ、Bax、Bcl-2、α-SMA mRNA的表達

與空白組比較，其余各組FN、collagenⅠ、Bcl-2和α-SMA mRNA表達量增加（Plt;0.05），Bax mRNA表達量降低（Plt;0.05）。與TGF-β1組比較，TGF-β1+AS-Ⅳ組和TGF-β1+XAV939組FN、collagenⅠ、Bcl-2、α-SMA mRNA表達量降低（Plt;0.05），Bax mRNA表達量增加（Plt;0.05）。與TGF-β1+AS-Ⅳ組比較，TGF-β1+XAV939組FN、collagenⅠ、Bcl-2、α-SMA mRNA表達量增加（Plt;0.05），Bax mRNA表達量降低（Plt;0.05）。詳見表4。

3.4" 免疫熒光染色法檢測α-SMA、E-Cadherin、collagenⅠ、FN、Cleaved Caspase-3、β-catenin的蛋白表達

與空白組比較，其余各組α-SMA、collagenⅠ、FN、Cleaved Caspase-3、β-catenin蛋白表達量增加（Plt;0.05），E-Cadherin蛋白表達量減少（Plt;0.05）。與TGF-β1組比較，TGF-β1+AS-Ⅳ組和TGF-β1+XAV939組α-SMA、collagenⅠ、FN、Cleaved Caspase-3、β-catenin蛋白表達量減少（Plt;0.05），E-Cadherin蛋白表達量增加（Plt;0.05）。與TGF-β1+AS-Ⅳ組比較，F(xiàn)N、Cleaved Caspase-3蛋白表達量下降（Plt;0.05）。詳見圖2—6。

3.5" Western blot檢測FN、β-catenin、Cleaved Caspase-3的蛋白表達

與空白組比較，其余各組的FN、β-catenin、Cleaved Caspase-3蛋白表達升高（Plt;0.05）;與TGF-β1組比較，TGF-β1+AS-Ⅳ組和TGF-β1+XAV939組FN、β-catenin、Cleaved Caspase-3蛋白表達降低（Plt;0.05）;與TGF-β1+AS-Ⅳ組比較，TGF-β1+XAV939組的FN、Cleaved Caspase-3蛋白表達升高（Plt;0.05），β-catenin的蛋白表達降低（Plt;0.05）。詳見圖7、表5。

4 討論

IPF屬于中醫(yī)學(xué)“肺痿”“肺痹”范疇，發(fā)病原因復(fù)雜，基本病機為肺虛絡(luò)瘀、本虛標實，本虛為肺、脾、腎三臟皆虛，標實為痰濁、瘀血痹阻于肺絡(luò)[18-20]，治療上應(yīng)補肺健脾益腎、祛痰活血通絡(luò)[21]。黃芪具有補肺健脾、補氣活血的功效。AS-Ⅳ為中藥黃芪的藥理成份，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ可增強機體免疫力及抗病能力，改善肺功能，能延緩肺纖維化發(fā)展[22]。研究發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ可以通過miR-21介導(dǎo)的途徑激活肺泡細胞自噬，從而抑制IPF發(fā)生發(fā)展[23]。TONG等[24]使用博來霉素誘導(dǎo)小鼠IPF的發(fā)生，結(jié)果顯示，黃芪甲苷治療后可以減少羥脯氨酸的合成，延緩肺纖維化的發(fā)展。同樣有研究表明，AS-Ⅳ還可通過能被轉(zhuǎn)化生長因子激活的長鏈非編碼RNA/微小RNA-200c/鋅指轉(zhuǎn)錄因子1信號通路抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和肺纖維變性[25]。

Wnt參與細胞增殖、分化與再生，其經(jīng)典通路通過調(diào)控下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子β-catenin以激活Wnt/β-catenin 信號通路，隨后相關(guān)配體與受體結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，調(diào)控肺組織血管新生，對損傷的氣道內(nèi)皮細胞進行修復(fù)，促使間質(zhì)纖維細胞激活與重構(gòu)，引起肺組織膠原沉積，參與IPF進程[26]。研究使用 Wnt/β-catenin信號通路抑制劑后發(fā)現(xiàn)，Wnt相關(guān)配體與LRP-5/6共受體，發(fā)生競爭性結(jié)合，減弱了信號之間的傳導(dǎo)，從而逆轉(zhuǎn)了肺成纖維細胞和肌成纖維細胞的增殖與分化，從而發(fā)揮改善IPF的作用。OKAZAKI等[27]使用新型Wnt/β-catenin/結(jié)合蛋白信號抑制劑 PRI-724，能通過調(diào)節(jié)肺中巨噬細胞的活性，從而改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，因此，Wnt/β-catenin信號通路與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。中醫(yī)藥治療肺纖維化源遠流長，許多研究發(fā)現(xiàn)，某些中藥單體的有效成分，尤其是苷類化合物可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路從而抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[28]。有研究證實，用淫羊藿苷作用于肺成纖維細胞后，下調(diào)了氧化產(chǎn)物的濃度，同時提高了抗氧化物水平，從而抑制肺纖維化的產(chǎn)生，這與抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)相關(guān)[29]。WANG等[30]通過博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化，使用五味子苷進行干預(yù)后檢測相關(guān)指標發(fā)現(xiàn)相關(guān)炎癥因子、Wnt及β-catenin等的表達受到抑制。

本研究流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，AS-Ⅳ能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)下HFL-1細胞的凋亡。RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，TGF-β1處理能夠上調(diào)人成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞過程中標志物α-SMA、FN、collagenⅠ、抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA的表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax mRNA的表達;而AS-Ⅳ能夠下調(diào)α-SMA、FN、collagenⅠ、抗凋亡蛋白Bcl-2表達，上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達。本實驗通過Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達，結(jié)果提示TGF-β1誘導(dǎo)HFL-1細胞后，F(xiàn)N、β-catenin、Cleaved Caspase-3蛋白表達增加，AS-Ⅳ作用后蛋白表達下降，同樣免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示TGF-β1誘導(dǎo)HFL-1細胞后α-SMA、E-Cadherin、collagenⅠ、FN、β-catenin、Cleaved Caspase-3蛋白表達增加，AS-Ⅳ作用后蛋白表達下降。結(jié)果證明，AS-Ⅳ能夠抑制TGF-β1所誘導(dǎo)的細胞凋亡，抑制肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，其作用機制可能與Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HFL-1細胞凋亡和肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，該作用可能與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，為AS-Ⅳ治療IPF的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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〔基金項目〕湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（2021165）。

〔通信作者〕*游柏穩(wěn)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：1326493020@qq.com。