〔摘要〕 目的 采用UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS和網(wǎng)絡藥理學探討清肺湯抗肺炎的作用機制。方法 通過UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS法進行分析，鑒定清肺湯的主要化學成分，結合Swisstarget收集清肺湯主要化學成分的作用靶點;利用OMIM、DrugBank及GeneCards等數(shù)據(jù)庫獲取“肺炎”的相關靶點，并與清肺湯化學成分靶點取交集篩選出共同靶點，通過蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建及GO、WikiPathways通路富集分析確定清肺湯治療肺炎的重要信號通路。結果 通過UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS從清肺湯中鑒別出142種活性成分，獲得200個清肺湯成分與肺炎交集靶點，構建網(wǎng)絡后獲取了44個潛在有效成分和131個肺炎關鍵靶點。KEGG通路富集分析表明，清肺湯通過MAPK3信號通路、EGFR信號通路、LCK信號通路等多種信號通路以及白細胞介素-5（interleukin-5， IL-5）、白細胞介素-2（interleukin-2， IL-2）和胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin， TSLP）等多靶點發(fā)揮抗肺炎的作用。結論 清肺湯中的活性成分可通過多通路、多靶點發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、抗炎、調(diào)節(jié)細胞凋亡、抗病毒感染和改善肺纖維化的作用，從而起到治療肺炎的作用。

〔關鍵詞〕 UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS;清肺湯;肺炎;網(wǎng)絡藥理學;作用機制

〔中圖分類號〕R284.1" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.12.019

Analysis of the mechanism of action of Qingfei Decoction's"anti-pneumonia activity by UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS"combined with network pharmacology

WANG Junshuai1，2， WANG Xueyi1，2， WANG Xueying1，2， LIU Zhenyin1，2， ZHAO Zhenxia2，"LIU Yongli2*， LI Hui2*

1. School of Pharmacy， Henan University， Kaifeng， Henan 475000， China; 2. Hebei Institute for Drug and Medical Device Inspection， Shijiazhuang， Hebei 050227， China

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of action of Qingfei Decoction's anti-pneumonia activity using UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS and network pharmacology. Methods The major chemical components of Qingfei Decoction were analyzed and identified by UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS. Targets of the identified components were collected using Swisstarget; pneumonia-related targets were retrieved from OMIM， DrugBank， and GeneCards databases. Common targets between the identified components of Qingfei Decoction and pneumonia were screened by taking their intersection. Protein-protein interaction （PPI） network construction and GO/WikiPathways enrichment analyses were performed to identify key signaling pathways involved in Qingfei Decoction's treatment of pneumonia. Results A total of 142 active ingredients were identified from Qingfei Decoction by UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS， yielding 200 intersecting targets between the ingredients and pneumonia. Network construction identified 44 potential effective components and 131 key pneumonia-related targets. KEGG pathway enrichment analysis indicated that Qingfei Decoction exerted its anti-pneumonia effects through multiple signaling pathways， including the MAPK3 signaling pathway， EGFR signaling pathway， and LCK signaling pathway， as well as multiple targets such as interleukin-5 （IL-5）， interleukin-2 （IL-2）， and thymic stromal lymphopoietin （TSLP）. Conclusion The active ingredients in Qingfei Decoction can exert therapeutic effects against pneumonia via multi-pathway and multi-target mechanisms， including immune regulation， anti-inflammatory action， modulation of apoptosis， antiviral effects， and mitigation of pulmonary fibrosis.

〔Keywords〕 UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS; Qingfei Decoction; pneumonia; network pharmacology; mechanism of action

肺炎是指由病毒、細菌、化學污染物等因素引起的疾病，涉及肺泡、肺間質及肺葉部位的炎性病變，在老年與幼兒人群高發(fā)，末期可引發(fā)敗血癥及呼吸衰竭[1]。臨床肺炎的治療包括抗感染治療、對癥治療、支持治療及并發(fā)癥治療[2-3]?？垢腥局委熓欠窝字委煹闹饕h(huán)節(jié)之一，治療的藥物主要包括抗生素、抗病毒藥物和抗真菌藥物等，但該類藥物在臨床應用中易產(chǎn)生耐藥性和不良反應[4-5]。因此，從中藥中尋找治療肺炎新藥意義重大。

清肺湯出自《萬病回春·咳嗽門》，是明朝龔廷賢用于治療咳嗽的經(jīng)典名方。清肺湯為《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》收載的湯劑之一，其由黃芩、桔梗、茯苓、橘紅和貝母等15味中藥組成，原文記載“清肺湯治一切咳嗽，上焦痰盛”[6]。總結古籍及文獻中關于清肺湯功效主治的記載，其功效為清肺化痰止咳，臨床常用于治療支氣管炎、慢性支氣管炎、肺炎、肺結核、慢性咽炎、支氣管喘息、心臟性喘息等病癥[7-8]?，F(xiàn)代藥理作用研究表明，清肺湯可有效改善肺炎患者的血液生化、病理影像學指標，具有依從性好、用藥周期短、副作用小等優(yōu)點[9-10]。但其治療肺炎的藥效物質基礎和作用機制尚不明確，因此，對其藥效物質基礎和作用機制進行闡釋有利于指導其臨床用藥。

中藥復方起效機制研究的復雜性主要體現(xiàn)在成分組成、生物學效應兩個方面，而網(wǎng)絡藥理研究模式可以有序地將藥物化學、藥理學、生物信息學等學科與系統(tǒng)網(wǎng)絡分析相結合，從基因分布、分子功能和信號通路等角度解釋中藥復方如何通過多組分影響多通路、多靶點發(fā)揮作用，該研究模式特別適合中藥復方作用機制的闡釋[11]。本研究通過UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS對清肺湯中化學成分進行鑒定，采用網(wǎng)絡藥理學技術探尋清肺湯治療肺炎的主要有效成分和作用機制，以期在分子層面上闡釋清肺湯多成分、多途徑和多靶點發(fā)揮抗肺炎作用的科學內(nèi)涵，為其治療肺炎的臨床應用提供參考，同時為其深入的作用機制研究奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1" 試藥與試劑

當歸（批號：DGYP-2，產(chǎn)地：甘肅岷縣）2.61 g、梔子（批號：ZZYP-10，產(chǎn)地：福建福鼎）2.61 g、桔梗（批號：JGYP-3，產(chǎn)地：河北安國）3.73 g、黃芩（批號：HQYP-6，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古赤峰）5.60 g、麥冬（批號：MDYP-5，產(chǎn)地：四川三臺縣）2.61 g、甘草（批號：GCYP-6，產(chǎn)地：新疆庫爾勒博湖縣）1.12 g、苦杏仁（批號：KXRYP-7，產(chǎn)地：河北懷來）2.61 g、五味子（批號：WWZYP-11，產(chǎn)地：遼寧新賓）1 g、茯苓（批號：FLYP-11，產(chǎn)地：安徽岳西）3.73 g、橘紅（批號：JHYP-5，產(chǎn)地：湖南常德）3.73 g、浙貝母（批號：ZBMYP-11，產(chǎn)地：浙江寧波）3.73 g、桑白皮（批號：SBPYP-13，產(chǎn)地：重慶石柱）3.73 g、天冬（批號：TDYP-12，產(chǎn)地：重慶石柱）2.61 g、生姜（批號：SJYP-02，產(chǎn)地：云南文安縣）2 g、大棗（批號：DZYP-06，產(chǎn)地：新疆若羌縣）6 g，所用飲片經(jīng)北京中醫(yī)藥大學任廣喜講師鑒定為正品，且經(jīng)檢驗均符合《中華人民共和國藥典》（2020年版）質量標準相關要求。水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）;乙腈（質譜級，德國Merck公司）;甲酸（質譜級，美國Sigma公司）。

1.2" 儀器

Vanquish Horizon型超高效液相色譜儀、UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS質譜儀（美國Thermo Scientific公司）;BT25S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;JM-B10002型電子天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）;KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;LC-10N-50A型臺式真空冷凍干燥機（上海力辰儀器科技有限公司）;Milli-Q型超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

2 方法

2.1" 清肺湯物質基準凍干粉的制備

處方各藥飲片粉碎為過4目篩不過10目篩的粗顆粒，10倍水浸泡30 min，先用1 200 W武火煮沸，后轉600 W火繼續(xù)煎煮45 min，趁熱以200目濾除藥渣，收集濾液，真空冷凍干燥（Tlt;-40 ℃，Vaclt;20 Pa）60 h。

2.2" 基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的清肺湯化學成分鑒定研究

2.2.1" 色譜條件" 色譜柱為Waters Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）;流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）;梯度洗脫（0～5 min，5%→7%B;5～15 min，7%→15%B;15～25 min，15% →18%B;25～45 min，18%→20%B;45～55 min，20%→25%B;55～65 min，25%→75%B;65～70 min，75% →95%B）;流速為0.3 mL·min-1;柱溫為35 ℃;進樣量為5 μL。

2.2.2" 質譜條件" HESI采用正、負離子掃描模式，噴霧電壓為3.5 kV;毛細管溫度為320 ℃，輔助氣溫度為400 ℃;掃描范圍為m/z 100～1 000;Full MS、dd-MS2分辨率分別為7×104、1.75×104;S-lens RF level為55;輔助氣流速為10 arb，鞘氣流速為35 arb;NCE為30、35、40。

2.2.3" 供試品溶液制備" 精密稱取清肺湯物質基準凍干粉0.2 g，精密加入25 mL 75%甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理20 min（250 W，40 kHz），75%甲醇補足失重量，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.4" 數(shù)據(jù)采集與分析" 首先將供試品溶液按照“2.1.1”項下的條件進行質譜分析，利用PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、人類代謝組數(shù)據(jù)庫（human metabolome database，HMDB）和MassBank數(shù)據(jù)庫（https：//massbank.eu/）收集關于清肺湯的相關內(nèi)容，構建清肺湯成分自建庫，根據(jù)分子量、碎片離子、不同種類化合物的化學鍵斷裂規(guī)律及相關文獻資料，并通過與標準品進行比對來對化合物的結構進行解析。

2.3" 基于網(wǎng)絡藥理學的清肺湯治療肺炎作用機制研究

2.3.1" 清肺湯中主要活性成分和靶標蛋白篩選" 根據(jù)UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的鑒定結果，設定口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%且類藥性（drug likeness， DL）≥0.18為篩選條件，建立清肺湯的主要有效成分數(shù)據(jù)庫并得到相關作用靶點信息。

2.3.2" 肺炎靶點的收集和清肺湯抗肺炎的潛在作用靶點預測" 通過Swiss target（http：//www.swisstargetprediction.ch/）對“2.2.1”中清肺湯化學成分組的作用靶點進行預測，規(guī)范名稱、去除重復項，得到清肺湯活性成分的作用靶點組。進一步在OMIM（https：//www.omim.org/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/，relevance scoregt;1）和PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）數(shù)據(jù)庫，以“pneumonia”作為關鍵詞進行檢索、規(guī)范名稱并去除重復項，得到肺炎相關的作用靶點，并與預測得到的清肺湯活性成分的作用靶點組取交集并繪制韋恩圖，以得到清肺湯治療肺炎的潛在作用靶點。

2.3.3" 蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡和“化學成分-作用靶點”網(wǎng)絡的構建" 將“2.2.2”中得到的清肺湯治療肺炎的潛在作用靶點導入STRING 11.5（https：//cn.string-db.org），限定物種為“Homo sapiens”，將篩選后的結果保存為“TSV”格式，導入Cytoscape 3.7.1軟件（https：//www.cytoscape.org/）對其進行可視化，以“String Physical Scoregt;0.132，Network Sizegt;3”為條件，使用Cytoscape的MCODE功能對蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡進行分析。并利用Cytoscape軟件完成“化合物-作用靶點”網(wǎng)絡的構建。

2.3.4" 基因本體富集分析" 通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）和WikiPathways數(shù)據(jù)庫（https：//www.wikipathways.org/index.php/WikiPathways）對得到的交集靶點進行GO富集分析，輸入潛在作用靶點并限制物種為人，得到的分析結果以Plt;0.05為指標進行篩選。使用R語言對結果進行可視化處理，分析得到清肺湯治療肺炎的作用機制。

3 結果

3.1" 基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的清肺湯化學成分分析

清肺湯正、負離子掃描模式的總離子流圖見圖1，將質譜數(shù)據(jù)導入Xcalibur 4.1中的Qual Browser程序，調(diào)取MS離子并模擬分子式，結合MS2碎片離子、數(shù)據(jù)庫（Massbank of North America、MassBank Europe）及文獻共鑒定出142個化合物，其中黃酮及其苷類成分占比較大。其中92個化合物可明確其歸屬，其詳細信息見表1。

3.2" 基于網(wǎng)絡藥理學的清肺湯治療肺炎作用機制研究

3.2.1" 清肺湯中活性成分和靶標蛋白篩選" 符合條件OB≥30%，DL≥0.18的化合物共有44個，其中甘草中活性成分12種，黃芩中活性成分9種，且篩選得到的活性成分多屬于黃酮類成分及其衍生物，通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取活性成分的sdf格式分子結構，通過SwissTargetPrediction平臺預測得到對應靶標550個。

3.2.2" 肺炎疾病靶點和清肺湯治療肺炎潛在靶點" 利用OMIM、DrugBank、GeneCards和PharmGKB數(shù)據(jù)庫檢索得到肺炎相關靶點1 508個，通過Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）平臺將清肺湯主要化學成分所對應的靶點與肺炎疾病靶點取交集，得到200個清肺湯治療肺炎的潛在靶點，詳見圖2。

3.2.3" “化學成分-作用靶點”交互網(wǎng)絡的構建與分析" 利用Cytoscape 3.7.1軟件構建的化學成分-靶點交互網(wǎng)絡見圖3。通過分析篩選到的關鍵化合物有44個，關鍵靶點有131個。其中排名前10位的化合物是6-姜酚、五味子醇甲、五味子酯乙、10-姜酚、槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、黃芩苷、5，7，8-三羥基黃酮、甘草苷;排名前5的靶點是IL-5、EGFR、LCK、TNF、MAPK3，見表2和表3。由圖3可知，1個活性化合物可對多個靶點起作用，與此同時也存在多個成分對1個靶點起作用，體現(xiàn)了清肺湯多成分和多靶點相互協(xié)同治療肺炎的特點。

3.2.4" 清肺湯治療肺炎潛在靶點PPI網(wǎng)絡構建" 利用Metascape平臺構建PPI網(wǎng)絡，經(jīng)平臺MCODE算法分析得5個節(jié)點數(shù)大于3的顯著聚類簇，見圖4。由圖4可知，包含130個節(jié)點和104 1條邊。靶蛋白的平均節(jié)點等級值為30，超過平均節(jié)點等級值的有50個。篩選出前5個節(jié)點度值的靶點蛋白，分別是IL-2、MAPK14、NFKB1、PIK3R1、NTRK1，揭示其可能是清肺湯治療肺炎的主要作用靶點。

3.2.5" GO富集分析" 通過DAVID網(wǎng)站中的GO富集分析得到了GO條目（Plt;0.05），其中包含465個生物過程（biological process， BP）條目，143個分子功能（molecular function， MF）條目和98個細胞組分（cell composition， CC）條目，對各聚類簇的代表條目（-log10

P值降序排名前3者）進行展示，結果如圖5所示。在BP中靶點主要涉及正向調(diào)節(jié)外部刺激反應（positive regulation of response to external stimulus）、酶聯(lián)受體蛋白信號通路（enzyme linked receptor protein signaling pathway）、炎癥反應（inflammatory response）、趨化性（chemotaxis）及細胞因子介導的信號通路（cytokine-mediated signaling pathway）等。在MF中靶點主要涉及磷酸酶結合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）、絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、C-C趨化因子受體活性（C-C chemokine receptor activity）及C-C趨化因子結合（C-C chemokine binding）等。在CC中靶點主要涉及分泌顆粒腔（secretory granule lumen）、細胞質囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、囊泡腔（vesicle lumen）、膜面（side of membrane）及質膜外側（external side of plasma membrane）等。

3.2.6" WikiPathways通路富集" 經(jīng)WikiPathways富集分析后，對各聚類簇的代表條目（-log10P值降序排名前3者）進行展示，結果如圖6所示，主要包括白細胞介素-5（interleukin-5， IL-5）信號通路、白細胞介素-2（interleukin-2， IL-2）信號通路、胸腺基質淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin， TSLP）信號通路及抑瘤素M（oncostain M， OSM）信號通路，這些信號通絡可能是清肺湯治療肺炎的主要作用靶點。

4 討論

清肺湯由黃芩、桔梗和茯苓等共15味藥材組成，方中黃芩配伍梔子使二者清肺熱、解熱毒的作用增強;苦杏仁與天門冬和麥冬配伍，增強止咳平喘作用的同時又強化潤肺的作用，緩解肺部燥熱;桔梗配伍甘草，使止咳化痰作用增強;貝母配伍苦杏仁和甘草，增強化痰止咳、潤肺平喘的作用，貝母配伍黃芩，增強黃芩清熱解毒和貝母潤肺止咳的作用，貝母與桔梗配伍，起到宣肺平喘、化痰止咳的作用;茯苓與當歸配伍，起到調(diào)血益氣、活血化瘀的作用，茯苓與甘草配伍，起到益氣健脾、祛痰濕的作用;桑白皮與黃芩配伍，增強黃芩清熱涼血解毒的作用;橘紅與甘草配伍，使和中化濕、行氣止痛的作用增強，橘紅配伍生姜，使二者化痰止咳的作用增強，全方共奏養(yǎng)陰清肺、宣肺止咳、燥濕化痰功效[37-38]。

本研究首先使用UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS技術獲取清肺湯的成分信息，初步鑒別142個結構，包括黃酮及其苷類74個、氨基酸類12個、小分子有機酸類12個、木脂素類7個、生物堿類6個、三萜類5個、環(huán)烯醚萜類5個、苯酞類4個、香豆素類3個、核苷類3個、姜酚類2個、酯類2個、醛類2個、苯乙醇苷類1個、二苯乙烯苷類1個、氫苷類1個、甾體皂苷類1個、多酚類1個，較為全面地反映了復方的成分信息，其潛在活性成分包括五味子醇甲、黃芩素、槲皮素、6-姜酚及漢黃芩素等。黃芩素可明顯緩解炎癥和降低炎性因子水平，減輕肺組織水腫和病理損傷，顯著降低肺炎球菌性肺炎小鼠死亡率，其主要通過下調(diào)肺組織中NF-κB和p38 MAPK在mRNA水平的表達，以發(fā)揮抗炎作用[39]。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以抑制病毒的復制，減輕肺部炎癥，降低感染小鼠死亡率和肺指數(shù)，對感染流感病毒的小鼠亦有治療作用[40]，同時槲皮素可通過減少氧化應激、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和下調(diào)活性氧介導的下游信號通路等方式，發(fā)揮抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎和抗病毒等藥理作用[41]。漢黃芩素具有較強抑制炎癥反應的作用，通過減輕流感病毒感染后的過度免疫應答反應而減輕肺組織細胞損傷，能夠緩解病毒性肺炎的炎性損傷，達到治療肺炎的作用[42]。

WikiPathways通路富集及聚類簇歸屬顯示，治療靶標組主要干預人體的IL-2信號通路、IL-5信號通路、胸腺基質淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin， TSLP）信號通路及抑瘤素M（oncostain M， OSM）信號通路。肺部發(fā)生感染或損傷時，引起復雜的細胞因子網(wǎng)絡，當IL-2、IL-5等促炎因子過度釋放時，形成炎性細胞爆發(fā)，毛細血管的通透性改變，致大量內(nèi)毒素蛋白進入肺泡，肺泡表面被破壞，病情急劇惡化[43]。因此在治療肺炎中，及時抑制此類促炎因子過度表達尤為重要。通過調(diào)控IL-2信號通路和IL-5信號通路減輕肺部炎癥反應，從而降低肺泡上皮細胞的凋亡率，達到保護肺組織，防治肺二次損傷的作用[44]。TSLP參與炎癥級聯(lián)反應的啟動，可以促進慢性疾病和過敏性炎癥，調(diào)控TSLP信號通路，在免疫反應中起調(diào)節(jié)作用，減輕過敏，促進機體的恢復[45]。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法結合UPLC-Q-Excative Orbitrap-MS系統(tǒng)探究清肺湯治療肺炎的物質基礎和作用機制，研究結果表明清肺湯中五味子醇甲、黃芩素、6-姜酚及漢黃芩素等活性成分作用于MAPK3、EGFR、LCK信號通路的IL-5、IL-2和TSLP等關鍵靶標，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、抗炎、調(diào)節(jié)細胞凋亡、抗病毒感染和改善肺纖維化的作用，從而起到治療肺炎的作用。本研究初步探明經(jīng)典名方清肺湯治療肺炎的物資基礎和作用機制，為經(jīng)典名方的新藥開發(fā)奠定了基礎。

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〔基金項目〕河北省自然科學基金項目（H2022329003）。

〔通信作者〕*李" 揮，男，博士，研究員，碩士研究生導師，E-mail：lihui7171@163.com;劉永利，男，碩士，主任藥師，碩士研究生導師，E-mail：liuyongli2008@126.com。