摘要 電化學(xué)生物傳感器在小分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)、酶、核酸、外泌體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等生物靶標(biāo)的檢測(cè)研究領(lǐng)域中備受關(guān)注。為實(shí)現(xiàn)生物靶標(biāo)的高靈敏、高選擇性電化學(xué)檢測(cè)，需采用多種特異性生物識(shí)別元件和高效信號(hào)放大策略。本文歸納總結(jié)了電化學(xué)生物傳感中典型的生物識(shí)別元件與信號(hào)放大策略。依據(jù)生物識(shí)別元件與靶標(biāo)的作用方式，分別介紹了酶-底物型和受體-配體型電化學(xué)生物傳感器，著重介紹了核酸類靶標(biāo)與非核酸類靶標(biāo)電化學(xué)檢測(cè)中的生物識(shí)別元件；圍繞生物靶標(biāo)的高靈敏檢測(cè)，重點(diǎn)介紹了基于等溫核酸擴(kuò)增、催化反應(yīng)、功能納米載體以及聚合物材料的信號(hào)放大策略在電化學(xué)生物傳感中的應(yīng)用，討論了電化學(xué)生物傳感器實(shí)際應(yīng)用面臨的諸多挑戰(zhàn)，并展望了該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞 電化學(xué)生物傳感器；生物識(shí)別元件；信號(hào)放大；評(píng)述

電化學(xué)生物傳感器是一類將發(fā)生在電極上的分子識(shí)別事件（如親和識(shí)別和酶促催化）轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)（如電流、電位和阻抗）進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物靶標(biāo)定量分析的器件，具有測(cè)量范圍寬、易于集成和微小型化、靈敏度和選擇性高、儀器設(shè)備簡單且便攜、響應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)學(xué)診斷、健康護(hù)理和環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面展示出良好的應(yīng)用前景[1-4]。電化學(xué)生物傳感器主要由電極及其表面固定化的生物識(shí)別元件（BRE）構(gòu)成。對(duì)于電化學(xué)生物傳感器，選擇性和靈敏度是評(píng)價(jià)其性能的兩個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。圍繞生物靶標(biāo)的高選擇性檢測(cè)，常用的BRE 有核酸（含核酸適體）、抗體及其片段（如納米抗體）、酶和多肽（含底物肽和親和肽）等[5-8]；為實(shí)現(xiàn)生物靶標(biāo)的高靈敏電化學(xué)檢測(cè)，研究人員利用等溫核酸擴(kuò)增、催化反應(yīng)（含酶促催化和非酶促催化）、功能納米載體（如富碳納米材料和無機(jī)納米粒子）以及聚合物材料（天然和人工合成）對(duì)檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大[9-12]。本文對(duì)近年來電化學(xué)生物傳感中的BRE 與信號(hào)放大策略的研究進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)的歸納與總結(jié)，以期為電化學(xué)生物器的發(fā)展提供參考。

1 生物識(shí)別元件

BRE 與靶標(biāo)間的相互作用可分為酶-底物型和受體-配體型這兩大類。酶-底物型利用酶對(duì)底物的特異性識(shí)別對(duì)酶活性或底物進(jìn)行檢測(cè)，如以葡萄糖氧化酶（GOx）和過氧化氫酶（CAT）修飾的酶電極分別對(duì)葡萄糖和H2O2 濃度進(jìn)行檢測(cè)，或以底物肽作為BRE 對(duì)激酶、蛋白酶和磷酸酶活性進(jìn)行檢測(cè)。受體-配體型利用BRE 與靶標(biāo)之間的親和識(shí)別作用（即捕獲）對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，包括核酸分子雜交、轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合、抗原-抗體免疫識(shí)別、核酸適體或親和肽對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別等。受體-配體型識(shí)別方式通常用于對(duì)靶標(biāo)濃度進(jìn)行定量分析，而酶-底物型識(shí)別更適用于酶活性檢測(cè)。酶（如凝血酶）的活性水平較其濃度更具有臨床意義，在酶分子與抑制劑結(jié)合或輔因子濃度過低等情況下，即使酶的總量未發(fā)生改變，其催化活性也會(huì)發(fā)生顯著變化[13-14]。因此，在酶類生物靶標(biāo)的檢測(cè)中應(yīng)優(yōu)先選用酶-底物型識(shí)別模式。

1.1 酶-底物型

酶對(duì)底物識(shí)別的特異性可分為4 類：絕對(duì)特異性、基團(tuán)特異性、鍵特異性和立體化學(xué)特異性。絕對(duì)特異性可被視為酶對(duì)某一特定底物的排他性作用，如乳糖酶只能催化乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖激酶只能催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸?；鶊F(tuán)特異性是指酶能催化含有某一特定官能團(tuán)（如羥基、磷酸基團(tuán)和甲基等）的分子發(fā)生反應(yīng)，如胃蛋白酶可水解切割疏水性氨基酸殘基之間的肽鍵并識(shí)別苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）等芳香族側(cè)鏈，己糖激酶（HK）可催化葡萄糖和甘露糖等己糖的磷酸化反應(yīng)，堿性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶（ACP）能催化眾多含磷酸基團(tuán)的底物發(fā)生脫磷酸化反應(yīng)。鍵特異性是指酶能識(shí)別特定的化學(xué)鍵類型（如肽鍵）。立體化學(xué)特異性是指酶僅對(duì)底物的某種特定光學(xué)活性敏感，如β-糖苷酶僅能水解纖維素中的β-糖苷鍵，而不能水解α-糖苷鍵。利用酶對(duì)底物的特異性識(shí)別，既可將酶作為BRE 對(duì)其底物進(jìn)行高選擇性檢測(cè)，也可將特定底物作為BRE 對(duì)酶活性進(jìn)行高選擇性檢測(cè)。而且，得益于酶對(duì)其底物的高效催化活性，酶-底物型電化學(xué)生物傳感器通常具有很高的檢測(cè)靈敏度。

Updike 等[15]將GOx 修飾到電極表面，催化葡萄糖與O2 反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖酸與H2O2，通過測(cè)定生成的H2O2，實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄糖的高選擇性電化學(xué)檢測(cè)。Kumar 等[16]利用乳酸脫氫酶（LDH）修飾的絲網(wǎng)印刷電極（SPE）對(duì)汗液中的乳酸鹽進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，檢出限（LOD）為0.1 mmol/L。Chen 等[17]利用乙酰膽堿酯酶（AChE）修飾的酶電極，借助于電化學(xué)阻抗譜（EIS）對(duì)乙酰膽堿進(jìn)行高靈敏、高選擇性檢測(cè)。Roberts等[18]以近端含有4 個(gè)陰離子谷氨酸（Glu）殘基且遠(yuǎn)端含有4 個(gè)陽離子賴氨酸（Lys）殘基的底物肽作為固定化BRE，以六胺合釕（[Ru（NH3）6]3+）作為電活性探針，通過比較多肽酶促切割前后的電流信號(hào)大小，實(shí)現(xiàn)對(duì)前列腺特異性抗原（PSA）的高靈敏、高選擇性檢測(cè)， LOD 為1.0 pmol/L。Liu 等[19]以末端修飾有電活性二茂鐵（Fc）探針的多肽作為BRE，對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP7）活性進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)， LOD 低至3.4 pmol/L。Wang 等[20]以底物肽為固定化BRE，其特定位點(diǎn)的絲氨酸（Ser）殘基被磷酸化后會(huì)促進(jìn)[Ru（NH3）6]3+與電極表面的電荷轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白激酶a（PKA）活性的高靈敏、高選擇性檢測(cè)， LOD為0.1 mU/mL。Song 等[21]以底物肽為固定化BRE，以γ位含有Fc 探針的ATP（Fc-ATP）為共底物，在蛋白激酶c（PKC）催化底物肽磷酸化的過程中，共底物上的Fc 探針會(huì)轉(zhuǎn)移到底物肽上，實(shí)現(xiàn)對(duì)PKC 活性的電化學(xué)檢測(cè)。

1.2 受體-配體型

受體-配體型電化學(xué)生物傳感器主要是利用固定化BRE（即受體）對(duì)靶標(biāo)（即配體）進(jìn)行特異性識(shí)別與捕獲，如基于核酸分子雜交反應(yīng)的電化學(xué)DNA/RNA 生物傳感器、基于抗原-抗體識(shí)別的電化學(xué)免疫傳感器以及基于核酸適體/親和肽的電化學(xué)生物傳感器等。受體與配體之間的親和識(shí)別主要依賴于氫鍵、靜電作用、疏水效應(yīng)和范德華力等分子間非共價(jià)相互作用（即超分子作用力），具有很好的可逆性；但其結(jié)合強(qiáng)度易受溫度和離子強(qiáng)度等因素影響。核酸類靶標(biāo)可通過核酸分子雜交反應(yīng)特異性識(shí)別與捕獲，而非核酸類靶標(biāo)（如小分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)、外泌體、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）、細(xì)菌和病毒）主要通過抗體、核酸適體以及親和肽捕獲。根據(jù)生物靶標(biāo)的類型，本文將從核酸類靶標(biāo)與非核酸類靶標(biāo)檢測(cè)的角度分別介紹電化學(xué)生物傳感中的BRE。

1.2.1 核酸類靶標(biāo)的電化學(xué)檢測(cè)

核酸是由許多核苷酸單體彼此通過3′，5′-磷酸二酯鍵共價(jià)連接而成的電負(fù)性生物大分子。DNA 是主要的遺傳物質(zhì)， RNA 是埃博拉病毒等RNA 病毒的遺傳物質(zhì)。由于遺傳物質(zhì)具有種屬/個(gè)體特異性，并且基因突變可能影響蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)而引發(fā)疾病，因此，可通過核酸分析對(duì)疾病進(jìn)行篩查甚至早期診斷以及病原微生物鑒定。此外，基于循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、微小RNA（microRNA）等游離核酸的液體活檢，在疾病的篩查與診斷等方面也備受關(guān)注[22-23]。針對(duì)核酸類靶標(biāo)的高選擇性檢測(cè)，主要基于Watson-Crick 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將與靶序列互補(bǔ)配對(duì)的核酸片段作為BRE[24]。例如， Pareek 等[25]以互補(bǔ)單鏈DNA（ssDNA）片段作為固定化BRE，以亞甲基藍(lán)（MB）作為電活性探針，對(duì)人乳頭瘤病毒16（HPV-16）DNA 進(jìn)行高選擇性檢測(cè)。為進(jìn)一步提高選擇性乃至實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性分析，研究人員相繼開發(fā)出發(fā)卡DNA[26]、肽核酸（PNA）[27]、鎖核酸（LNA）[28]和磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸（PMO）[29]等核酸類似物，作為核酸檢測(cè)的BRE。

發(fā)卡DNA 是根據(jù)分子信標(biāo)原理設(shè)計(jì)的一種單鏈核酸探針，其兩端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)，常溫下呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，具有選擇性好、結(jié)構(gòu)簡單和可重復(fù)使用等特點(diǎn)[30]。如圖1 所示，將發(fā)卡DNA 作為BRE 對(duì)核酸進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)時(shí)，通常在其一端修飾巰基等官能團(tuán)（用于電極表面固定化），另一端（遠(yuǎn)端）修飾電活性探針（如Fc 和MB）[3]。Fan 等[31]將遠(yuǎn)端修飾有Fc 探針的發(fā)卡DNA 作為BRE，借助于靶標(biāo)與發(fā)卡DNA雜交將發(fā)卡環(huán)打開，導(dǎo)致源自Fc 探針的氧化電流下降，據(jù)此實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA 的高選擇性電化學(xué)檢測(cè)（LOD 為10 pmol/L）。隨著靶標(biāo)濃度增大，此類電化學(xué)DNA 生物傳感器的響應(yīng)電流信號(hào)相應(yīng)降低。該類方法屬于“信號(hào)減弱”型方法，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。為克服上述缺陷， Hu 等[32]將末端修飾有疊氮基團(tuán)（—N3）的發(fā)卡DNA 固定在電極表面，與靶標(biāo)雜交后，借助于點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將含有炔基（—C≡C）的Fc 探針連接到電極表面，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA 的“信號(hào)增強(qiáng)”型檢測(cè)， LOD 為0.296 pmol/L。由于電負(fù)性脫氧核糖磷酸骨架之間存在靜電排斥，類似于傳統(tǒng)ssDNA 探針，以發(fā)卡DNA 作為BRE 時(shí)，存在電極表面探針組裝密度低以及與靶標(biāo)雜交效率低等不足。

PNA 是一種人工合成的電中性核酸類似物，通過采用不攜帶電荷的N-（2-氨乙基）-甘氨酸（N-2-AEG）骨架替換DNA 分子的電負(fù)性脫氧核糖磷酸骨架獲得[33]。PNA 既能與互補(bǔ)單鏈核酸片段雜交形成穩(wěn)定的雙螺旋，也能經(jīng)由螺旋入侵的方式與dsDNA 的大溝穩(wěn)定結(jié)合[34]。PNA 與互補(bǔ)單鏈核酸間的雜交反應(yīng)呈現(xiàn)以下特征：①分子骨架呈電中性，在電極表面能形成更加致密的單分子層，與電負(fù)性核酸片段間結(jié)合時(shí)無靜電排斥，可形成更加穩(wěn)定的雙螺旋，雜交效率顯著提升，并且形成的雙螺旋具有更高的熱穩(wěn)定性[35]；②能有效區(qū)分單堿基錯(cuò)配，可用于單核苷酸多態(tài)性分析；③連接N-2-AEG 單元間的酰胺鍵不同于磷酸二酯鍵或肽鍵，可抗核酸酶和蛋白酶水解；④與單鏈核酸間的結(jié)合不受溶液離子強(qiáng)度的影響，在Mg2+不存在時(shí)也能與互補(bǔ)單鏈核酸發(fā)生高效雜交反應(yīng)。Li 等[36]以PNA 為BRE，實(shí)現(xiàn)了對(duì)SARS-CoV-2病毒RNA 的高選擇性電化學(xué)檢測(cè)， LOD 為0.38 fmol/L。Hu 等[37]以PNA 為BRE，將氨基二茂鐵直接修飾到被PNA 探針捕獲的靶標(biāo)的5′端游離磷酸基上，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA 的快速檢測(cè)。但是，相較于ssDNA 探針，目前PNA 探針存在合成費(fèi)用高等不足。

LNA 是一種修飾過的RNA， RNA 分子中的部分β-D-呋喃核糖的2′-O 與4′-C 被氧亞甲基“橋”共價(jià)連接在一起，不僅有效降低了呋喃核糖環(huán)的柔韌性，也在一定程度上提升了磷酸骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[38]。LNA 能與單鏈核酸雜交形成穩(wěn)定的雙螺旋，具有抗酶解能力強(qiáng)和水溶性好等特性[39]。研究發(fā)現(xiàn)，DNA 同源雙螺旋中的單堿基錯(cuò)配會(huì)使其解鏈溫度（Tm）下降4～16 ℃，而LNA/DNA 異源雙螺旋中的單堿基錯(cuò)配會(huì)使Tm 下降約20 ℃。因此， LNA 與單鏈核酸雜交呈現(xiàn)更高的特異性。Chen 等[40]以LNA 為BRE、MB 為雜交反應(yīng)指示探針，對(duì)DNA 進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)， LOD 為0.94 pmol/L。Lin 等[41]以LNA 為BRE、苯甲酸雙核銅（Ⅱ）配合物為雜交反應(yīng)指示探針（其能插入到LNA/DNA 異源雙螺旋中），對(duì)DNA 進(jìn)行高選擇性電化學(xué)檢測(cè)， LOD 為0.1 pmol/L。由于存在靜電排斥， LNA 探針與靶標(biāo)間的雜交反應(yīng)也存在效率較低等不足。

PMO 為第三代反義寡核苷酸，可阻斷蛋白質(zhì)翻譯，進(jìn)而達(dá)到抑制靶基因功能的目的，其骨架由亞甲基嗎啉環(huán)與磷酰鍵連接而成[42]。PMO 能與單鏈核酸雜交形成穩(wěn)定的異源雙螺旋，與電負(fù)性核酸片段間結(jié)合時(shí)無靜電排斥，并能更好地抵抗核酸酶水解[43]。與PNA 相比， PMO 具有更好的水溶性。目前，PMO 已被用于核酸的電化學(xué)檢測(cè)[44]。例如， Tercero 等[29]以PMO 為BRE，通過測(cè)量雜交反應(yīng)前后界面電容的變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA 的快速檢測(cè)。Li 等[45]將PMO 修飾在納米通道表面，以[Fe（CN）6]3–為電活性探針，通過測(cè)量雜交反應(yīng)引起的電流變化，實(shí)現(xiàn)了DNA 的免標(biāo)記型檢測(cè)， LOD 為0.1 nmol/L。然而， PMO的合成費(fèi)用較高。

1.2.2 非核酸類靶標(biāo)的電化學(xué)檢測(cè)

針對(duì)有機(jī)小分子物質(zhì)（如ATP 和氨基酸）、蛋白質(zhì)（如糖化血紅蛋白和甲胎蛋白）、外泌體、CTCs、細(xì)菌（如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）和病毒（如HIV 病毒和天花病毒）等非核酸類靶標(biāo)的親和型電化學(xué)檢測(cè)，常用的BRE 包括抗體、核酸適體以及親和肽等。

基于抗體的高特異性識(shí)別，電化學(xué)免疫傳感器在非核酸類靶標(biāo)的檢測(cè)中廣泛應(yīng)用[6，46]。由于抗原-抗體結(jié)合會(huì)阻礙界面電荷轉(zhuǎn)移，可將抗體修飾到電極表面，以[Fe（CN）6]4–/3–為電活性探針，通過測(cè)量免疫識(shí)別所引起的電信號(hào)變化，分別實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌O157∶H7 和癌胚抗原（CEA）的阻抗型和伏安型檢測(cè)，LOD 分別為106 cfu/mL 和3.0 fg/mL[47-48]。由于抗體具有制備過程復(fù)雜且批間差異大、穩(wěn)定性差、價(jià)格高昂以及不易修飾等缺點(diǎn)，研究人員提出以核酸適體和親和肽作為非核酸類靶標(biāo)親和捕獲的BRE。

核酸適體是一類由20～100 個(gè)堿基組成的單鏈DNA 或RNA 片段，通常經(jīng)由指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）從核酸文庫中體外篩選獲得[49-50]，能夠與有機(jī)小分子（如抗生素）[51]、蛋白質(zhì)（如凝血酶）[52]、外泌體[53]、CTCs[54]、細(xì)菌（如霍亂弧菌）[55]以及病毒（如SARS-CoV-2 病毒）[56]等靶標(biāo)特異性結(jié)合。由于核酸適體可人工合成且具有價(jià)格低廉、批間差異極小和熱穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)[57-58]，在電化學(xué)生物傳感領(lǐng)域備受關(guān)注[59-60]。例如，研究人員以末端修飾有Fc 探針的核酸適體作為固定化BRE，分別對(duì)凝血酶[61]和ATP[62]進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)， LOD 分別為0.5 和10 nmol/L。還可將核酸適體作為固定化BRE，采用EIS 對(duì)CTC[63]和SARS-CoV-2 病毒[64]進(jìn)行檢測(cè)， LOD 分別為10 和1000 particle/mL。Zhong 等[65]構(gòu)建了一種伏安型電化學(xué)適體傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)黃曲霉毒素B1 的高選擇性檢測(cè)， LOD 為1.82 pg/mL。Min 等[66]分別以RNA 和DNA 核酸適體為固定化BRE，對(duì)γ-干擾素進(jìn)行阻抗型檢測(cè)， LOD 達(dá)到pmol/L 量級(jí)。Wan 等[67]以核酸適體為固定化BRE，借助于硼酸鹽親和作用將Fc 探針標(biāo)記到糖化白蛋白（GA）的非酶促糖基化位點(diǎn)上，實(shí)現(xiàn)了高選擇性檢測(cè)（該電化學(xué)適體傳感器可有效區(qū)分GA 與人血清白蛋白）， LOD 為45.5 ng/mL。然而，核酸適體在生物基質(zhì)中易被快速降解，與抗體相比，核酸適體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步提升。

蛋白質(zhì)分子之間以及抗原-抗體之間的結(jié)合通常是通過局部肽段上數(shù)個(gè)氨基酸殘基之間的非共價(jià)相互作用實(shí)現(xiàn)的[68]。雖然某些多肽的序列與抗原的天然表位存在差異，但結(jié)合抗體或配體的方式一致，此類具有關(guān)鍵氨基酸殘基的多肽通常被稱為模擬表位[69]。因此，可將親和肽作為抗體的替代物，對(duì)非核酸類靶標(biāo)進(jìn)行高選擇性檢測(cè)。類似于核酸適體，親和肽具有可人工合成、價(jià)格低、批間差異極小以及熱穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)。研究人員以親和肽作為固定化BRE，分別對(duì)脂多糖（LPS）（LOD 為0.08 pg/mL）[70]、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白（ NGAL） （ LOD 為1.74 ng/mL） [ 71]、利妥昔單抗（ RitMab） （ LOD 為35.26 ng/mL）[72]和諾如病毒（LOD 為7.8 copies/mL）[73]進(jìn)行阻抗型檢測(cè)。然而，親和肽存在易酶解以及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差等不足。

2 信號(hào)放大策略

在惡性腫瘤的早期診斷以及疫情防控等方面，特定生物靶標(biāo)的濃度可能處于很低的水平。例如，循環(huán)腫瘤DNA（ctDNAs）在人血漿中的總濃度僅約為3.0～21.0 amol/L[74]，并且其中與特定疾病相關(guān)的某種ctDNA 片段的豐度通常低于1%。為實(shí)現(xiàn)低濃度生物靶標(biāo)的高靈敏電化學(xué)檢測(cè)，通常需要采用等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[75-76]、催化反應(yīng)[77-78]、功能納米載體[79-80]以及聚合物材料[81-82]等多種策略放大檢測(cè)信號(hào)。

2.1 基于等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的信號(hào)放大策略

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）和CRISPR/Cas 系統(tǒng)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)在生物靶標(biāo)的高靈敏電化學(xué)檢測(cè)中引起了廣泛關(guān)注[83-84]。Chaibun 等[85]以互補(bǔ)ssDNA 片段為BRE，借助RCA 在電極表面引入大量的電活性探針，對(duì)SARS-CoV-2病毒N 和S 基因片段實(shí)現(xiàn)了高靈敏檢測(cè)， LOD 為1000 fragment/mL。Kim 等[86]以互補(bǔ)ssDNA 片段為固定化BRE，基于RPA 的信號(hào)放大策略，對(duì)SARS-CoV-2 病毒的RdRP 和S 基因片段進(jìn)行高靈敏電化學(xué)檢測(cè)，LOD 低至fg/μL 數(shù)量級(jí)。Chen 等[87]以核酸適體為固定化BRE，基于CRISPR/Cas12a 的信號(hào)放大作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)心肌肌鈣蛋白I（cTnI）的高靈敏電化學(xué)檢測(cè)（LOD 為10 pg/mL）。與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）相比，上述等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)具有無需熱循環(huán)等優(yōu)勢(shì)；然而，基于RCA、LAMP、RPA 和CRISPR/Cas 系統(tǒng)的等溫核酸擴(kuò)增均需要使用酶，存在成本高、穩(wěn)定性差等不足。為了克服上述缺陷，研究人員提出將催化發(fā)夾組裝（CHA）等不依賴酶的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)用于信號(hào)放大，其具有生物相容性好、反應(yīng)體系簡單和反應(yīng)條件溫和等特性[88]。例如， Zhu 等[89]以互補(bǔ)ssDNA 片段為固定化BRE，借助CHA 在電極表面引入大量的[Ru（NH3）6]3+探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)microRNA 的高靈敏電化學(xué)檢測(cè)， LOD 為5.24 amol/L。

2.2 基于催化反應(yīng)的信號(hào)放大策略

基于催化反應(yīng)的信號(hào)放大可分為酶促催化和非酶促催化這兩類。其中，酶促催化是采用天然酶（如核酸外切酶、辣根過氧化物酶（HRP）、ALP、GOx 和切刻內(nèi)切酶）進(jìn)行信號(hào)放大。天然酶具有催化效率高和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，在生物靶標(biāo)的高靈敏電化學(xué)檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。例如， Fang 等[90]以互補(bǔ)ssDNA片段為BRE，其與靶標(biāo)雜交后，通過鋅指蛋白ZNF346 對(duì)DNA/RNA 異源雙螺旋的識(shí)別作用將ALP 引入電極表面，實(shí)現(xiàn)了對(duì)microRNA 的高靈敏檢測(cè)， LOD 為2.0 fmol/L。Wei 等[91]以遠(yuǎn)端修飾有熒光素的發(fā)卡DNA 為BRE，其與靶標(biāo)雜交后，利用抗熒光素抗體與熒光素間的特異性識(shí)別將HRP 引入電極表面，實(shí)現(xiàn)了對(duì)RNA 的高靈敏檢測(cè)， LOD 為0.4 fmol/L。Hwang 等[92]構(gòu)建了一種“夾心型”電化學(xué)DNA 生物傳感器，借助ALP 介導(dǎo)的酶促銀沉積，對(duì)DNA 進(jìn)行高靈敏檢測(cè)， LOD 為0.1 fmol/L。Salam 等[93]構(gòu)建了一種夾心型電化學(xué)免疫傳感器，借助HRP 的生物催化作用，對(duì)鼠傷寒沙門桿菌進(jìn)行高靈敏檢測(cè)， LOD 為20 CFU/mL。Huang 等[94]構(gòu)建了一種夾心型電化學(xué)免疫傳感器，借助于多聚HRP（PolyHRP）的信號(hào)放大作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)神經(jīng)纖維絲輕鏈（NEFL）和白細(xì)胞介素6（IL-6）的高靈敏檢測(cè)（圖2）， LOD 分別為5.22 和3.69 pg/mL。然而，將天然酶用于信號(hào)放大的策略存在檢測(cè)成本高、穩(wěn)定性差（天然酶易發(fā)生變性失活）以及酶分子標(biāo)記過程復(fù)雜等不足。鑒于此，近年來，基于金屬卟啉類仿生催化劑[95]、納米酶[96]以及含過渡金屬元素的電催化劑[97]的非酶促催化已被大量應(yīng)用于生物靶標(biāo)的高靈敏電化學(xué)檢測(cè)。例如， Peng 等[98]構(gòu)建了一種電化學(xué)免疫傳感器，借助于G-四鏈體/hemin 復(fù)合物的高效電催化活性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CTC 的高靈敏檢測(cè)， LOD 為8 cell/mL。Hu 等[99]以PNA 作為固定化BRE，借助于氯化高鐵血紅素（Hematin）介導(dǎo)的銀沉積，對(duì)DNA 進(jìn)行高靈敏電化學(xué)檢測(cè)， LOD 為62.41 amol/L。Kwon 等[100]構(gòu)建了一種夾心型電化學(xué)DNA 生物傳感器，借助于Pt 納米粒子（PtNP）對(duì)肼的高效電催化活性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA 的高靈敏檢測(cè)， LOD為100 pmol/L。

2.3 基于功能納米載體的信號(hào)放大策略

納米材料（如碳納米管、金屬納米粒子和有機(jī)框架材料）具有極高的比表面積，其表面或內(nèi)部可攜帶大量的電活性探針（如[Ru（NH3）6]3+）。因此，通過使用功能納米載體，可引入大量電活性探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物靶標(biāo)的高靈敏檢測(cè)。例如， Cheng 等[101]以核酸適體作為固定化BRE，待其捕獲靶外泌體后，進(jìn)一步利用核酸適體對(duì)外泌體表面蛋白分子的特異性識(shí)別引入表面負(fù)載有大量MB 探針的金納米粒子（AuNP），對(duì)外泌體進(jìn)行高靈敏檢測(cè)， LOD 為158 particle/μL。Xu 等[102]以底物肽為固定化BRE，通過AuNP 在電極表面引入大量[Ru（NH3）6]3+探針，對(duì)PKA 活性進(jìn)行高靈敏檢測(cè)， LOD 為150 mU/mL。Zhang 等[103]構(gòu)建了一種夾心型電化學(xué)免疫傳感器，利用共價(jià)有機(jī)框架（COF）將大量甲苯胺藍(lán)探針引入電極表面，對(duì)cTnI 進(jìn)行高靈敏檢測(cè)， LOD 為0.17 pg/mL。

2.4 基于聚合物材料的信號(hào)放大策略

聚合物的分子鏈由大量單體或結(jié)構(gòu)單元共價(jià)連接而成。利用聚合物材料（含天然的和人工合成的）將大量電活性探針引入電極表面，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物靶標(biāo)的高靈敏檢測(cè)[104-109]。由于原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）[110]和可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合[111]等可逆失活自由基聚合（RDRP）技術(shù)具有調(diào)控方式豐富、反應(yīng)條件溫和和分子設(shè)計(jì)能力強(qiáng)等優(yōu)良特性[112]， Hu 研究組在利用RDRP 技術(shù)引入大量的電活性探針對(duì)生物靶標(biāo)進(jìn)行高靈敏電化學(xué)檢測(cè)方面開展了一系列研究工作。例如，將底物肽作為固定化BRE，以甲基丙烯酸二茂鐵基甲酯（FcMMA）為單體，借助熱引發(fā)RAFT 聚合（以水溶性偶氮鹽2，2′-偶氮雙[2-（2-咪唑啉-2-基）丙烷]二鹽酸鹽（VA-044）為自由基引發(fā)劑）[13]和電化學(xué)調(diào)控RAFT 聚合（以芳基重氮鹽BrPhN2+為電子轉(zhuǎn)移媒介體）[113]在電極表面引入大量Fc 探針，分別實(shí)現(xiàn)了對(duì)凝血酶活性和PKA 活性的高靈敏檢測(cè)；以核酸適體為固定化BRE， FcMMA 為單體，借助電化學(xué)調(diào)控ATRP（eATRP，通過硼酸鹽親和作用將ATRP 引發(fā)劑標(biāo)記到靶標(biāo)的聚糖鏈上）實(shí)現(xiàn)了對(duì)甲胎蛋白（AFP）[114]、CEA[115]、LPS[116]和曲妥珠單抗（TraMab）[117]的高靈敏電化學(xué)檢測(cè)， LOD 低至pg/mL 甚至fg/mL 量級(jí)。為了進(jìn)一步簡化操作流程，他們還提出直接將多糖類天然聚合物材料用于信號(hào)放大，以PNA 為固定化BRE，借助于多糖將大量Fc探針引入電極表面，實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA 的高靈敏檢測(cè)[118]。

由于糖蛋白（如AFP、CEA、人絨毛膜促性腺激素、抗體和凝集素）、外泌體、CTCs、細(xì)菌和病毒等生物靶標(biāo)上均攜帶有聚糖鏈且聚糖鏈上的順式1，2-和1，3-二醇位點(diǎn)可與苯硼酸（PBA）基團(tuán)選擇性共價(jià)交聯(lián)[61]，因此，可通過硼酸鹽親和作用將電活性探針標(biāo)記到相關(guān)靶標(biāo)的聚糖鏈上，對(duì)其進(jìn)行高靈敏電化學(xué)檢測(cè)。受此啟發(fā)， Hu 研究組利用核酸適體對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行捕獲，并通過硼酸鹽親和作用將大量Fc 探針標(biāo)記到靶標(biāo)的聚糖鏈上，實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFP[119]和LPS[120]的高靈敏電化學(xué)檢測(cè)， LOD 分別為0.037 ng/mL 和0.34 pg/mL。為進(jìn)一步提高傳感器的抗干擾性能和重現(xiàn)性，他們以近端修飾有MB 探針的核酸適體作為固定化BRE，通過將大量Fc 探針標(biāo)記到靶標(biāo)的聚糖鏈上，分別實(shí)現(xiàn)了對(duì)CA15-3[ 121]和貝伐珠單抗（BevMab）[122]的高靈敏比率型電化學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)原理如圖3 所示。此外， Lv 等[123]以親和肽為固定化BRE，對(duì)人絨毛膜促性腺激素（hCG）進(jìn)行特異性識(shí)別與捕獲，利用NaIO4 將靶標(biāo)聚糖鏈上的鄰位羥基位點(diǎn)氧化為醛基，生成的醛基進(jìn)一步將Ag+還原成金屬Ag，并原位沉積在電極表面，對(duì)金屬Ag 進(jìn)行Ag/AgCl固態(tài)伏安溶出分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)hCG 的高靈敏電化學(xué)檢測(cè)， LOD 為0.45 mIU/mL。借助靶標(biāo)自身攜帶的聚糖鏈引入大量電活性探針的策略具有成本低、操作簡便和檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)良特性，在攜帶有聚糖鏈的生物靶標(biāo)的即時(shí)檢驗(yàn)（POCT）中具有良好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論與展望

本文歸納總結(jié)了電化學(xué)生物傳感中常用的BRE 與信號(hào)放大策略，著重介紹了近年來電化學(xué)生物傳感器在有機(jī)小分子、蛋白質(zhì)（含酶）、核酸、外泌體、CTCs、細(xì)菌和病毒等生物靶標(biāo)檢測(cè)中的研究和應(yīng)用進(jìn)展。相較于傳統(tǒng)的基于質(zhì)譜與光譜原理的儀器分析方法，電化學(xué)生物傳感器具有測(cè)量范圍寬、易于集成與微小型化、靈敏度和選擇性高、儀器設(shè)備簡單且便攜、響應(yīng)速度快等優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)學(xué)診斷、健康護(hù)理和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域展示出巨大的應(yīng)用前景。利用酶-底物或受體-配體間的特異性識(shí)別，可實(shí)現(xiàn)相應(yīng)靶標(biāo)的高選擇性檢測(cè)。其中，酶-底物型識(shí)別可用于酶活性以及底物濃度的檢測(cè)，而受體-配體型識(shí)別只能用于檢測(cè)靶標(biāo)濃度。得益于天然酶的高特異性和高催化效率，基于酶-底物識(shí)別的電化學(xué)生物傳感器通常具有靈敏度高和可靠性好等優(yōu)點(diǎn)。在受體-配體型電化學(xué)生物傳感方面，核酸類靶標(biāo)可通過Watson-Crick 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則利用互補(bǔ)的單鏈探針捕獲，而非核酸類靶標(biāo)利用抗體、核酸適體或親和肽識(shí)別與捕獲。借助核酸分子雜交和抗原-抗體免疫識(shí)別，可實(shí)現(xiàn)相應(yīng)靶標(biāo)的可靠識(shí)別與捕獲；相較而言，核酸適體和親和肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差且易酶解，在實(shí)際樣品中對(duì)靶標(biāo)識(shí)別的可靠性尚不理想。圍繞生物靶標(biāo)的高靈敏電化學(xué)檢測(cè)，現(xiàn)有策略主要是將等溫核酸擴(kuò)增、催化反應(yīng)、功能納米載體或聚合物材料引入電極界面實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。然而，除了經(jīng)典的葡萄糖酶電極已成功實(shí)現(xiàn)商業(yè)化并已被廣泛應(yīng)用于血糖的日常分析外，目前尚缺少電化學(xué)生物傳感器實(shí)際應(yīng)用的案例。究其原因，主要包括以下4 個(gè)方面：（1）不同于血糖分析時(shí)的高靶標(biāo)濃度（空腹血糖的正常范圍為4.4～6.1 mmol/L），血清等實(shí)際樣品中的絕大多數(shù)生物靶標(biāo)（如外泌體和CTCs）的濃度通常處于很低的水平，利用信號(hào)放大策略對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行高靈敏檢測(cè)會(huì)導(dǎo)致操作復(fù)雜化以及可控性差；（2）生物識(shí)別元件功能化電極界面的穩(wěn)定性較差，易產(chǎn)生“假陽性”和“假陰性”結(jié)果，使得電化學(xué)生物傳感器的重現(xiàn)性不能滿足實(shí)際應(yīng)用需求；（3）實(shí)際樣品中存在大量與靶標(biāo)組成、結(jié)構(gòu)或性質(zhì)相似的干擾性組分，并且電極表面易發(fā)生非特異性吸附；（4）目前的研究主要聚焦于材料的合成與表征以及檢測(cè)靈敏度的提高，而在提高電極界面的穩(wěn)定性、檢測(cè)結(jié)果的可重現(xiàn)性、用戶友好性、成本效益以及實(shí)際樣品中靶標(biāo)的可靠性識(shí)別等方面尚無實(shí)質(zhì)性突破。電化學(xué)生物傳感器的相關(guān)研究工作應(yīng)充分考慮靶標(biāo)在實(shí)際檢測(cè)場(chǎng)景下的濃度范圍，而不應(yīng)盲目追求過低的LOD。由于糖蛋白、外泌體、CTCs、細(xì)菌和病毒等生物靶標(biāo)上均攜帶有聚糖鏈，充分利用靶標(biāo)自身所攜帶的聚糖鏈對(duì)其進(jìn)行高靈敏檢測(cè)，有望顯著提升電化學(xué)生物傳感器的實(shí)用性，并大幅降低檢測(cè)成本。為滿足POCT 等場(chǎng)景的實(shí)際應(yīng)用需求，電化學(xué)生物傳感器應(yīng)具有較高的集成度與簡便性，應(yīng)能夠快速直接給出靶標(biāo)的具體濃度（或活性）信息。隨著與大數(shù)據(jù)、人工智能、移動(dòng)電子設(shè)備、無線通信技術(shù)、3D 打印和物聯(lián)網(wǎng)等的深度融合，電化學(xué)生物傳感器將持續(xù)朝著便攜化、集成化、自動(dòng)化、數(shù)字化、高通量、微小型化以及可植入式等方向發(fā)展。

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廣東省科協(xié)青年科技人才培育計(jì)劃（No. SKXRC202414）、廣東省普通高校特色創(chuàng)新項(xiàng)目（No. 2024KTSCX154）、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目（No. 2022A1515010618）、廣州市科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)青年科技人才托舉項(xiàng)目（No. QT20230101007）和廣州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（No. S202411078056）資助。