摘 要： 旨在通過(guò)探究五指山豬背最長(zhǎng)肌MYH基因家族結(jié)構(gòu)變異（SVs）對(duì)背最長(zhǎng)肌肌纖維性狀的影響，為深入理解肌纖維生長(zhǎng)規(guī)律和分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。研究對(duì)象為五指山豬，采用大白豬作為對(duì)照組。屠宰前一周將3頭五指山豬（4月齡母豬，平均體重14.2 kg）和3頭大白豬（4月齡母豬，平均體重58.0 kg）飼養(yǎng)在相同的環(huán)境中，飼喂充足的食物和水，所有豬饑餓處理24 h之后屠宰。采集6頭豬背最長(zhǎng)肌組織，提取完整DNA，PacBio平臺(tái)建庫(kù)測(cè)序，每個(gè)樣本測(cè)序大約40 Gb，測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組（Sscrofa 11.1）比對(duì)，使用Sniffles和PBSV軟件的默認(rèn)參數(shù)檢測(cè)SVs，過(guò)濾條件：50 bp≤SVs≤10 kb；提取每頭豬背最長(zhǎng)肌總RNA，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，計(jì)算基因表達(dá)量；統(tǒng)計(jì)五指山豬和大白豬SVs在染色體上分布位置和數(shù)目，比較五指山豬相對(duì)于大白豬SVs差異，篩選五指山豬特異性SVs，構(gòu)建五指山豬MYH基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域，分析MYH基因表達(dá)量與肌纖維指標(biāo)相關(guān)性。結(jié)果表明：1）五指山豬共有7個(gè)特異性MYH基因，主要分布在第3、5、6、12、13號(hào)染色體，第12號(hào)染色體包含3個(gè)MYH基因；2）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，五指山豬7個(gè)MYH基因分化為2個(gè)分支，分別編碼非肌肉肌球蛋白和肌肉肌球蛋白，MYH9與MYH11基因、MYH1與MYH4基因同源性最高；7個(gè)MYH基因都包含結(jié)構(gòu)域Motor domain，5個(gè)MYH基因包含結(jié)構(gòu)域Myosin-N，MYH基因頭部結(jié)構(gòu)域（Myosin-N和Motor domain）相對(duì)保守，中間和尾部結(jié)構(gòu)域差異較大；其中五指山豬MYH1、MYH4和MYH9基因包含SVs而大白豬沒(méi)有SVs，皮爾森系數(shù)統(tǒng)計(jì)表明，MYH基因是否包含SVs可能與基因表達(dá)量相關(guān)；綜合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和Q-PCR試驗(yàn)，檢測(cè)這3個(gè)MYH基因的表達(dá)量與肌纖維指標(biāo)相關(guān)性，MYH1基因表達(dá)量與肌纖維密度和數(shù)量正相關(guān)，MYH4基因表達(dá)量與肌纖維密度和數(shù)量負(fù)相關(guān)，MYH9基因表達(dá)量與肌纖維密度負(fù)相關(guān)，與直徑正相關(guān)。綜上所述，五指山豬第12號(hào)染色體上特異性MYH基因最多；MYH基因家族主要分化為非肌肉肌球蛋白和肌肉肌球蛋白2個(gè)分支；MYH蛋白頭部結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守，中間和尾部結(jié)構(gòu)域差異可能是造成MYH基因家族分化的主要原因；MYH1、MYH4和MYH9基因表達(dá)量均與肌纖維密度相關(guān)，可能通過(guò)調(diào)控背最長(zhǎng)肌肌纖維密度影響肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。本研究不僅擴(kuò)展了肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制相關(guān)內(nèi)容，也為優(yōu)化結(jié)構(gòu)變異有關(guān)的遺傳育種模式提供借鑒。

關(guān)鍵詞： 五指山豬；肌纖維；結(jié)構(gòu)變異；蛋白結(jié)構(gòu)域；相關(guān)性

中圖分類號(hào)：S828.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）11-4912-13

收稿日期：2024-04-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃青年科學(xué)家項(xiàng)目（2022YFF1001300）；海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院本級(jí)科研項(xiàng)目（HAAS2023RCQD04）；海南省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（324QN351）

作者簡(jiǎn)介：任鈺為（1986-），女，湖北宜昌人，副研究員，博士，主要從事畜禽基因組和遺傳育種研究，E-mail： renyuwei@hnaas.org.cn

*通信作者：晁 哲，主要從事畜禽基因組和遺傳育種研究，E-mail：chaozhe@hnaas.org.cn

Effect of Structural Variation of MYH Gene Family on Longissimus Dorsi Muscle Fiber of Wuzhishan Pigs

REN" Yuwei， WANG" Feng， SUN" Ruiping， ZHANG" Yan， LIU" Hailong， LIN" Yanning， HONG" Lingling，

HUANG" Xiaoxian， CHAO" Zhe*

（Key Laboratory of Tropical Animal Breeding and Disease Research， Institute of

Animal Science and Veterinary Medicine， Hainan Academy of Agricultural Sciences， Haikou 571100，" China）

Abstract：" The study aimed to explore the effect of structural variation （SVs） in MYH gene family on muscle growth for longissimus dorsi muscle （LDM） of Wuzhishan pigs， and to provide a theoretical basis for further understanding of the rule and molecular mechanism of muscle growth. The study subjects were Wuzhishan pigs， and Large White pigs were used as control group. Three Wuzhishan pigs （4-month-old sows， average weight was 14.2 kg） and three Large White pigs （4-month-old sows， average weight was 58.0 kg） were raised in the same environment for one week before slaughter， fed sufficient food and water， and all pigs were starved for 24 hours before slaughter. LDM of 6 pigs were collected and sent to Beijing Novogene Technology Company on dry ice， complete DNA was extracted， library was built and sequenced by PacBio platform， the sequencing data of each sample was about 40 Gb.

The sequencing data was aligned to reference genome.

Filter condition： 50 bp≤SVs≤10 kb; Total RNA was extracted from longissimus dorsi muscle of each pig， transcriptome sequencing was performed， and gene expression was calculated. The distribution position and number of SVs on chromosomes of Wuzhishan pig and Large White pigs were counted， the specific SVs of Wuzhishan pigs were screened， and the phylogenetic tree of MYH gene family was constructed， the structure domains were predicted， and the correlation between MYH gene expression and muscle fiber indicators was analyzed. The results showed as follows： 1） There were 7 specific MYH genes in Wuzhishan pigs， which were mainly distributed in chromosomes 3， 5， 6， 12 and 13， and chromosome 12 contained 3 MYH genes; 2） Phylogenetic tree showed that 7 MYH genes of Wuzhishan pigs differentiated into 2 branches， encoding non-muscle myosin and muscle myosin respectively， MYH9 and MYH11 genes， MYH1 and MYH4 genes had the highest homology; All 7 MYH genes contained the Motor domain， and 5 MYH genes contain the Myosin-N domain. The head domain of MYH gene （Myosin-N and Motor domain） was relatively conservative， and the middle and tail domain of MYH gene were different. The MYH1， MYH4 and MYH9 genes of Wuzhishan pigs contained SVs，

while those of Large White pigs did not. Pearson coefficient statistics showed that the existence of SVs in MYH genes might be related to gene expression. The correlation between the expression levels of these three MYH genes and muscle fiber indexes was detected by both RNA-seq and Q-PCR. MYH1 gene expression was positively correlated with muscle fiber density and number， MYH4 gene expression was negatively correlated with muscle fiber density and number， MYH9 gene expression was negatively correlated with muscle fiber density and positively correlated with diameter. In summary，

the largest number of MYH genes distributed on chromosome 12，

the MYH gene family is mainly divided into two branches： non-muscle myosin and muscle myosin. The head domain is relatively conservative， and the difference between the middle and tail domain may be the main reason for the differentiation of MYH gene family. The expression levels of MYH1， MYH4 and MYH9 genes were significantly correlated with muscle fiber density， indicating that these genes might affect LDM growth through regulating the muscle fiber density. This study not only expands the content of molecular mechanism of muscle growth and development， but also provides reference for optimizing genetic breeding model related to structural variation.

Key words： Wuzhishan pigs; muscle fiber; structural variations; protein domains; correlations

*Corresponding author：" CHAO Zhe， E-mail： chaozhe@hnaas.org.cn

五指山豬是海南省特有的一種小型豬，具有耐粗飼、瘦肉率高、抗逆行強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定等特點(diǎn)。雖然五指山豬肉質(zhì)優(yōu)良，但是生長(zhǎng)緩慢，相比于其它商品豬，例如大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克等豬品種，五指山豬缺乏市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)［1］。大部分養(yǎng)殖場(chǎng)利用傳統(tǒng)雜交選育方法提高五指山豬子代個(gè)體的生長(zhǎng)速度［2］，然而，雜種優(yōu)勢(shì)個(gè)體差異較大，而且不能穩(wěn)定遺傳；少數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)引入全基因組選擇技術(shù)，研發(fā)芯片進(jìn)行定向選育，但是該方法技術(shù)成本高、實(shí)施難度大［3］。因此，亟需探究有效穩(wěn)定的遺傳育種模式來(lái)提高五指山豬的生長(zhǎng)性能。

肌球蛋白分為非肌肉肌球蛋白（non-muscle myosin）和肌肉肌球蛋白，前者屬于平滑肌組成成分，參與細(xì)胞遷移、黏附和形成細(xì)胞骨架等多種功能［4］，后者構(gòu)成骨骼肌重要成分。骨骼肌主要由不同含量肌球蛋白重鏈（myosin heavy chains，MYH）亞型的不同收縮性和代謝特性的肌纖維組成［5］；同時(shí)，肌纖維周圍也包含大量的血管和免疫細(xì)胞。肌球蛋白重鏈（MYH）是肌球蛋白的重要組成部分，由多基因家族編碼，在不同種類肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均能檢測(cè)到MYH基因［6］。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化后的成熟肌管中肌球蛋白重鏈MYHC基因和蛋白水平顯著高于分化前的細(xì)胞［7］。通過(guò)對(duì)豬混合群體進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)差異最顯著的數(shù)量性狀區(qū)域位于MYH基因家族，與骨骼肌肌纖維總數(shù)目性狀相關(guān)［8］。馬身豬和大白豬MYH3和MYH6基因能夠影響肌纖維組成［9］。牦牛骨骼肌快肌纖維MYH1和 MYH4基因表達(dá)量隨海拔增高而顯著增加，能夠在缺氧環(huán)境下迅速提供短期能量［10］。MYH1、MYH4、MYH6、MYH7、MYH9 和MYH13與烏蘇里白鮭肌肉生長(zhǎng)相關(guān)［11］。這些研究結(jié)果說(shuō)明，MYH基因家族編碼的非肌肉肌球蛋白和肌肉肌球蛋白都參與調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

基因組結(jié)構(gòu)變異（structural variation，SVs）主要指基因序列發(fā)生大片段變異，包括插入、缺失、易位、倒位和重復(fù)［12］?；蚪M結(jié)構(gòu)變異對(duì)豬的遺傳多樣性和適應(yīng)性具有重要作用。野豬和家豬的拷貝數(shù)變異用來(lái)研究肉質(zhì)性狀、肌肉生長(zhǎng)和免疫反應(yīng)［13］。在亞洲家豬品種中，亞洲家豬X染色體普遍存在一段30 Mb序列長(zhǎng)度SV，但在亞洲野豬中未檢測(cè)到此片段，表明亞洲家豬與野豬已經(jīng)發(fā)生了明顯分化［14］。藏豬缺氧反應(yīng)、骨骼發(fā)育、心臟收縮調(diào)節(jié)和神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)變異，可能有助于增強(qiáng)藏豬的本地適應(yīng)［15］。不同養(yǎng)殖系統(tǒng)、生態(tài)環(huán)境和地理環(huán)境可能誘導(dǎo)碳水化合物代謝相關(guān)的SVs，影響豬群生長(zhǎng)狀態(tài)［16］。此外，基因SVs通過(guò)影響調(diào)控元件來(lái)改變基因的轉(zhuǎn)錄水平，增強(qiáng)子區(qū)域SVs影響豬肉質(zhì)基因的表達(dá)［17］。秦川牛、云嶺牛、夏南牛動(dòng)力蛋白基因拷貝數(shù)變異影響肌肉細(xì)胞增殖和分化，減緩生長(zhǎng)速度［18］。此外，北京黑豬背最長(zhǎng)肌（longissimus dorsi muscle，LDM）MYH3基因編碼區(qū)檢測(cè)到1個(gè)SNP（single nucleotide polymorphism），與肌內(nèi)脂肪和基因表達(dá)顯著相關(guān)；MYH13基因的SNPs與滴水損失和肉質(zhì)顯著相關(guān)［19］。晉汾白豬與長(zhǎng)白豬、大白豬、馬身豬和太湖豬（二花臉）相比較，MYH基因家族的SNPs具有較大差異［20］。

基因結(jié)構(gòu)變異可能影響豬的體型，調(diào)控豬的新陳代謝、細(xì)胞增殖分化和免疫反應(yīng)［21］。例如，香豬以小型豬為主，也有少數(shù)體型較大的個(gè)體，體型差異主要與14個(gè)SVs相關(guān)，主要參與調(diào)控細(xì)胞周期、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存等功能［22］。梅山豬與杜洛克豬相比，共檢測(cè)到49 103個(gè)SVs，其中4.02%是亞洲豬特異性SVs［14］。藏豬IGF2R轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)存在1個(gè)SV（274 bp缺失），抑制藏豬生長(zhǎng)發(fā)育［14］。五指山豬與大白豬相比，生長(zhǎng)因子IGF1基因UTR3區(qū)域檢測(cè)到一段缺失序列，可能影響該基因的調(diào)控功能［23］。

推測(cè)五指山豬MYH基因家族可能具有生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的特異性SVs。本研究將從基因組結(jié)構(gòu)變異的角度分析背最長(zhǎng)肌MYH基因家族結(jié)構(gòu)和功能特征，探究MYH基因家族調(diào)控生長(zhǎng)規(guī)律的分子機(jī)制，為優(yōu)化五指山豬結(jié)構(gòu)變異相關(guān)選育指標(biāo)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和測(cè)序

樣本和測(cè)序方法參考本項(xiàng)目前期測(cè)序數(shù)據(jù)（PRJNA1030798）［23］。具體步驟是，將3頭五指山豬（4月齡母豬，平均體重14.2 kg）和3頭大白豬（4月齡母豬，平均體重58.0 kg）飼養(yǎng)在相似的環(huán)境中，屠宰前一周飼喂充足的食物和水，過(guò)渡期結(jié)束后，所有豬饑餓處理24 h，電擊昏迷并放血。采集6頭豬背最長(zhǎng)肌組織，干冰寄送至北京諾禾致源科技股份有限公司，提取完整DNA，PacBio平臺(tái)建庫(kù)測(cè)序，每個(gè)樣本測(cè)序大約40 Gb。

1.2 結(jié)構(gòu)變異分析

原始三代測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組（Sscrofa 11.1）比對(duì)，使用Sniffles和PBSV軟件的默認(rèn)參數(shù)檢測(cè)SV，包括缺失（deletions，DELs）、插入（insertions，INSs）、重復(fù)（duplication， DUP） 、倒位（inversions， INVs）和易位（translocations，TRAs）。過(guò)濾條件：50 bp≤SVs≤10 kb。將兩個(gè)品種的3個(gè)重復(fù)樣本的SVs分別組合，然后比較兩個(gè)品種不同的SVs（將SVs共分為四類：一是兩個(gè)品種位置相同、變異類型相同且變異序列相同的SVs；二是兩個(gè)品種位置相同、變異類型相同但是序列具有差異的SVs；三是兩個(gè)品種序列位置不同的SVs；四是兩個(gè)品種結(jié)構(gòu)變異種類不同的SVs），篩選兩個(gè)品種特異性SVs，即第二、三、四類SVs。從差異SVs中提取MYH基因家族SVs，統(tǒng)計(jì)不同MYH基因SVs種類和數(shù)目，開(kāi)展MYH基因家族同源性分析和結(jié)構(gòu)域功能分析。

1.3 進(jìn)化樹(shù)和蛋白結(jié)構(gòu)分析

首先，根據(jù)步驟“1.2”篩選的MYH基因，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載蛋白序列（MYH1： NP_001098421.1; MYH4： NP_001116613.1; MYH9： JAA53670.1; MYH10： XP_020923522.1; MYH11： XP_020941824.1; MYH14： XP_020950448.1; MYH15：XP_020925485.1），利用MEGA11軟件最大似然法構(gòu)建7個(gè)MYH蛋白序列的進(jìn)化樹(shù)，結(jié)合分支長(zhǎng)度和距離分析親緣關(guān)系。然后，查詢Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)構(gòu)域（https：//www.uniprot.org/），比較MYH蛋白結(jié)構(gòu)域種類、長(zhǎng)度和數(shù)量，分析不同結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍坠δ艿挠绊憽?/p>

1.4 基因表達(dá)量和相關(guān)性分析

五指山豬和大白豬轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本與步驟“1.1”采集的組織樣本相同，測(cè)序數(shù)據(jù)是［PRJNA1030798］。使用Trimmomatic（版本0.36.6）過(guò)濾原始數(shù)據(jù)的低質(zhì)量數(shù)據(jù)，用HISAT2軟件（Version 2.2.1）［24］默認(rèn)的參數(shù)將過(guò)濾后的數(shù)據(jù)映射到參考基因組（Sscrofa11.1），利用HTSeq v. 0.9.1［25］計(jì)算基因表達(dá)量計(jì)數(shù)。采用DEseq2［26］鑒定差異表達(dá)基因（differentially expressed genes， DEGs）。

比較五指山豬和大白豬MYH基因的SVs，將具有SVs的MYH基因標(biāo)記為1，沒(méi)有SVs的MYH基因標(biāo)記為0，采用皮爾森統(tǒng)計(jì)法（Pearson）分別計(jì)算每個(gè)基因是否存在SVs與表達(dá)量之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)（R）和顯著性，篩選與存在SVs具有一定關(guān)聯(lián)的MYH基因繼續(xù)分析基因表達(dá)量與肌纖維指標(biāo)之間的相關(guān)性。

提取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中MYH基因家族成員的基因表達(dá)量，采用皮爾森統(tǒng)計(jì)法（Pearson）分別計(jì)算SVs關(guān)聯(lián)MYH與步驟“2.4”測(cè)量的肌纖維指標(biāo)之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)（R）和顯著性，閾值設(shè)定為：R≥0.9，P≤0.05。篩選相關(guān)性程度強(qiáng)且差異顯著的MYH基因與肌纖維指標(biāo)，并用R軟件繪制相關(guān)性圖。同時(shí)，提取組織總RNA，采用定量PCR試驗(yàn)檢測(cè)SVs關(guān)聯(lián)MYH基因表達(dá)量，計(jì)算2-ΔΔCT值，T-TEST統(tǒng)計(jì)顯著性，分析表達(dá)顯著差異的MYH基因與肌纖維指標(biāo)相關(guān)性，判斷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和定量PCR數(shù)據(jù)一致性。

1.5 切片染色分析

分別對(duì)步驟“1.1”采集的五指山豬和大白豬背最長(zhǎng)肌組織使用4%多聚甲醛處理，進(jìn)行修剪、包埋、切片、染色（HE染色和天狼猩紅染色）、封片和檢測(cè)，選取合格切片成像。HE染色采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，簡(jiǎn)稱HE染色）制作石蠟切片，蘇木精為堿性，使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色，伊紅為酸性，使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)著紅色。天狼猩紅是強(qiáng)酸性染料，易與膠原基團(tuán)中的堿性分子結(jié)合，采用偏振光鏡檢測(cè)，天狼猩紅增強(qiáng)膠原纖維的雙折射，從而區(qū)分I型/III型膠原纖維。利用PANNORAMIC全景切片掃描儀將組織切片掃描移動(dòng)成像，成像文件繼續(xù)用CaseViewer2.2軟件以1～400倍像素觀測(cè)；調(diào)整Eclipse Ci-L偏振光強(qiáng)度，捕獲并拍照顯微鏡下的目標(biāo)區(qū)域，調(diào)整為200倍像素圖片，利用Image-Pro Plus 6.0分析軟件檢測(cè)I型膠原纖維（橙色）和III型膠原纖維（綠色）含量；使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件統(tǒng)一以1mm作為計(jì)數(shù)單位，統(tǒng)計(jì)肌纖維總數(shù)、密度、面積、直徑和I型/III型膠原纖維比率。

每張切片統(tǒng)計(jì)400倍視野內(nèi)肌纖維數(shù)量并測(cè)量視野內(nèi)肌纖維總面積，重復(fù)3次，計(jì)算平均值。每個(gè)肌纖維面積（mm2）=肌纖維總面積（mm2）/肌纖維數(shù)量（n）；肌纖維密度（n·mm-2）=肌纖維數(shù)量（n）/肌纖維總面積（mm2）；肌纖維直徑（mm）=（每個(gè)肌纖維面積（mm2）/2π）1/2×2。

2 結(jié) 果

2.1 MYH基因家族SVs數(shù)量及分布

通過(guò)比較五指山豬和大白豬MYH基因家族SVs，篩選兩個(gè)品種特異性SVs。五指山豬和大白豬MYH基因家族的基因分別檢測(cè)到29個(gè)SVs和7個(gè)SVs。五指山豬共檢測(cè)到7個(gè)MYH基因具有SVs，分別分布在5條染色體上，其中第12號(hào)染色體包含3個(gè)MYH基因（MYH10、MYH4和MYH1），其它4條染色體上分別有1個(gè)（圖1A）；大白豬共有3個(gè)具有SVs的MYH基因，分別分布在3條染色體上（圖1A）。五指山豬3號(hào)染色體MYH11基因的SVs最多，共有10個(gè)SVs（5DEL+5INS），其次是12號(hào)染色體MYH10基因（4DEL+2INS）（圖1B）；大白豬也是MYH11和MYH10基因的SVs最多，分別有3個(gè)（2DEL+1INS）（圖1B，表1）。五指山豬MYH1基因檢測(cè)到2個(gè)INS位于外顯子區(qū)域，長(zhǎng)度分別為64 bp和74 bp，其它SVs都位于內(nèi)含子區(qū)域；大白豬所有SVs都位于內(nèi)含子區(qū)域。這些統(tǒng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明大多數(shù)SVs都位于調(diào)控區(qū)域，僅少數(shù)SVs位于編碼區(qū)；五指山豬MYH基因發(fā)生結(jié)構(gòu)變異的染色體和基因數(shù)目均多于大白豬，而且兩個(gè)豬品種的變異結(jié)構(gòu)類型主要是缺失和插入。

2.2 MYH基因家族同源性分析

利用7個(gè)MYH蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)主要分成2個(gè)分支。一個(gè)分支是非肌肉肌球蛋白，包含4個(gè)MYH蛋白，序列長(zhǎng)度范圍較長(zhǎng)（1 979～2 038 aa）；另一個(gè)分支是肌肉肌球蛋白，包含3個(gè)MYH蛋白，序列長(zhǎng)度范圍較短（1 937～1 961 aa）。MYH頭部結(jié)構(gòu)域較保守，中間和尾部結(jié)構(gòu)域差異較大。MYH蛋白都具有結(jié)構(gòu)域Motor domain，但是兩個(gè)分支的長(zhǎng)度范圍不同，分別是679～710 aa和662～670 aa；5個(gè)MYH蛋白預(yù)測(cè)到Myosin-N結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域序列長(zhǎng)度波動(dòng)范圍較?。?7～39 aa），而且氨基酸序列相似度較高，說(shuō)明Myosin-N結(jié)構(gòu)域保守性較強(qiáng)。在這7個(gè)MYH蛋白中，蛋白MYH9、MYH10和MYH11同源性較高，其中 MYH9和MYH11蛋白序列長(zhǎng)度和3個(gè)結(jié)構(gòu)域位置相似，同源性最高；MYH1和MYH4蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分支距離較近，兩者都具有結(jié)構(gòu)域Myosin-N和Motor domain。MYH1蛋白結(jié)構(gòu)域最多，包含7個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中2個(gè)外顯子區(qū)域的SVs可能位于頭部的Myosin-N和右邊的Myosin-tail編碼區(qū)（圖2）。

2.3 肌纖維指標(biāo)測(cè)定

肌纖維呈較粗不規(guī)則性狀，膠原纖維呈均勻細(xì)長(zhǎng)的絲狀。通過(guò)HE切片染色初步比較五指山豬與大白豬肌纖維密度（圖3A和3B），利用天狼猩紅染色比較兩個(gè)品種I型和III型膠原纖維含量（圖3C和3D，表2）。HE染色圖片顯示，以100 μm為比例尺的視野中，五指山豬肌纖維排列比大白豬相對(duì)緊密；天狼猩紅染色圖片顯示，五指山豬肌纖維的橙色（I型膠原纖維）含量比大白豬多。肌纖維指標(biāo)測(cè)量值的結(jié)果表明，五指山豬與大白豬相比，肌纖維密度顯著增高、肌纖維直徑顯著減小，膠原纖維I型/III型比例有增大趨勢(shì)。成熟骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)層分子組成主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原參與控制，這些纖維分子協(xié)助肌肉內(nèi)部承受巨大的壓力，使骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)能夠向肌腱傳遞能量。檢測(cè)結(jié)果表明，五指山豬和大白豬膠原纖維I型/III型比例無(wú)顯著差異，說(shuō)明兩個(gè)豬品種膠原纖維I型或III型可能不是影響肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素。

2.4 MYH基因表達(dá)量與肌纖維指標(biāo)相關(guān)性分析

轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)MYH基因表達(dá)量結(jié)果表明，共

6個(gè)基因在背最長(zhǎng)肌組織中表達(dá)（表3）。五指山豬和大白豬5個(gè)MYH基因表達(dá)差異顯著，其中五指山豬4個(gè)基因（MYH4、MYH9、MYH10、MYH14）表達(dá)量顯著低于大白豬，MYH1基因表達(dá)量顯著高于大白豬（表3）。兩個(gè)豬品種的MYH1基因表達(dá)量與其它4個(gè)表達(dá)差異顯著的基因呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。

皮爾森相關(guān)系數(shù)及顯著性分析結(jié)果表明， MYH基因是否存在SVs與基因表達(dá)量之間可能具有相關(guān)性（表4）。五指山豬的4個(gè)MYH基因（MYH1、MYH4、MYH9和MYH15）具有SVs，而大白豬的4個(gè)MYH基因沒(méi)有SVs（表1）。差異表達(dá)基因MYH1、MYH4和MYH9表達(dá)量分別與這3個(gè)基因是否存在SVs顯著相關(guān)，由于五指山豬和大白豬MYH15基因表達(dá)量都很低（FPKMlt;1），無(wú)法計(jì)算皮爾森相關(guān)系數(shù)。

進(jìn)一步采用皮爾森相關(guān)系數(shù)分析差異表達(dá)基因MYH1、MYH4和MYH9表達(dá)量與肌纖維指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)MYH基因與肌纖維密度顯著相關(guān)。其中MYH1基因表達(dá)量與肌纖維密度、肌纖維數(shù)目正相關(guān)（圖4A和4B），MYH4基因與肌纖維密度、肌纖維數(shù)目負(fù)相關(guān)（圖4C和4D），MYH9與肌纖維密度負(fù)相關(guān)，與肌纖維直徑正相關(guān)（圖4E和4F）。

進(jìn)一步采用Q-PCR方法驗(yàn)證MYH1、MYH4和MYH9基因表達(dá)量，并分析這3個(gè)基因表達(dá)量與肌纖維指標(biāo)的相關(guān)性。Q-PCR試驗(yàn)結(jié)果表明，五指山豬MYH1基因表達(dá)量顯著高于大白豬，MYH4和MYH9基因表達(dá)量顯著低于大白豬（圖5），該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)結(jié)果一致。而且這3個(gè)基因表達(dá)量（2-ΔΔCT）均與3個(gè)肌纖維指標(biāo)（肌纖維密度、數(shù)目、直徑）顯著相關(guān)。MYH1基因表達(dá)量與肌纖維密度和肌纖維數(shù)量正相關(guān)，與肌纖維直徑負(fù)相關(guān)（圖6A、6B和6C）；MYH4和MYH9基因表達(dá)量與肌纖維密度和肌纖維數(shù)量負(fù)相關(guān)，與肌纖維直徑正相關(guān)（圖6D、6E、6F、6G、6H和6I）。

3 討 論

本項(xiàng)目研究發(fā)現(xiàn)，五指山豬共有7個(gè)MYH基因檢測(cè)到特異性SVs，主要分布在第3、5、6、12、13號(hào)染色體。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示MYH基因在進(jìn)化演變過(guò)程中主要分化出兩個(gè)分支，分別包含非肌肉肌球蛋白和肌肉肌球蛋白。MYH基因結(jié)構(gòu)域Myosin-N和Motor domain相對(duì)保守，造成基因分化的可能是中間和尾部的結(jié)構(gòu)域。物種進(jìn)化過(guò)程中，除了在生存環(huán)境突發(fā)劇烈變化的特殊時(shí)期（例如地殼遷移、海嘯等海陸演變的歷史階段），群體中少數(shù)發(fā)生基因組結(jié)構(gòu)變異的個(gè)體具有特異性表型性狀，能夠適應(yīng)新環(huán)境并繁衍后代，渡過(guò)群體瓶頸期，擴(kuò)大群體規(guī)模；大多數(shù)情況下，基因組大片段結(jié)構(gòu)變異對(duì)生物群體生長(zhǎng)發(fā)育和繁衍弊大于利。自然選擇能夠有效規(guī)避基因序列中罕見(jiàn)SVs對(duì)生物個(gè)體造成的危害，淘汰有害變異，保留有利于物種適應(yīng)環(huán)境性狀的SVs［27］。五指山豬是一種小型豬，具有反應(yīng)靈敏、善于奔跑、遺傳穩(wěn)定、代謝率低、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良特性，這些特性都與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和能量代謝有關(guān)，而且相比于其它豬品種（杜洛克豬、大白豬、梅山豬和湘西黑豬），五指山豬的馴化時(shí)間較短［23］，說(shuō)明五指山豬肌肉生長(zhǎng)特征可能是生存環(huán)境塑造的適應(yīng)性表型。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)7個(gè)MYH基因具有不同特征。MYH蛋白都具有結(jié)構(gòu)域Motor domain，檢測(cè)到5個(gè)MYH含有保守結(jié)構(gòu)域Myosin-N。在其中一個(gè)分支中，MYH9、MYH10和MYH11蛋白都具有相同結(jié)構(gòu)域，都屬于非肌肉肌球蛋白；MYH9和MYH11結(jié)構(gòu)域的序列長(zhǎng)度和位置都非常相似，親緣關(guān)系最近。在另一個(gè)分支中，MYH1和MYH4親緣關(guān)系較近，都屬于肌肉肌球蛋白。MYH9、MYH10、MYH11、MYH1和MYH4蛋白都具有結(jié)構(gòu)域Myosin-N和Motor domain，但是屬于2個(gè)分支，說(shuō)明MYH蛋白頭部（Myosin-N和Motor domain）結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守，中間和尾部結(jié)構(gòu)域差異較大，可能是產(chǎn)生MYH基因分化的主要原因。

MYH基因家族共6個(gè)MYH基因在五指山豬和大白豬背最長(zhǎng)肌表達(dá)，其中5個(gè)MYH基因在兩個(gè)豬品種表達(dá)量差異顯著，共4個(gè)MYH基因（MYH14、MYH4、MYH9和MYH10）在五指山的表達(dá)量顯著低于大白豬，MYH1基因的表達(dá)量顯著高于大白豬。五指山豬MYH1、MYH4、MYH9基因具有SVs，而大白豬沒(méi)有SVs，皮爾森相關(guān)系數(shù)表明，這3個(gè)MYH基因是否存在SVs與基因表達(dá)量相關(guān)。進(jìn)一步分析MYH1、MYH4、MYH9基因表達(dá)量與肌纖維指標(biāo)的相關(guān)性，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)表明，MYH1基因表達(dá)量與肌纖維密度和數(shù)目正相關(guān)，MYH4基因表達(dá)量與肌纖維密度和數(shù)目負(fù)相關(guān)，MYH9基因表達(dá)量與肌纖維密度負(fù)相關(guān)，與肌纖維直徑正相關(guān)；Q-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證了上述結(jié)果。全基因組關(guān)聯(lián)分析表明，豬12號(hào)染色體MYH基因家族與肌纖維數(shù)目顯著關(guān)聯(lián)［8］，馬身豬（小型豬）背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑顯著小于大白豬，而肌纖維密度顯著高于大白豬［9］，該結(jié)果與本研究中五指山豬和大白豬肌纖維指標(biāo)結(jié)果類似，說(shuō)明肌纖維數(shù)目可能與豬體型有關(guān)。牛MYH1基因啟動(dòng)子活性在成肌細(xì)胞C2C12中高于脂肪細(xì)胞模型3T3-L1［28］。綿羊胎兒成肌細(xì)胞分化過(guò)程中，MYF6、MYH1、 MYH2、MYH4和MYH7基因表達(dá)量增加，促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)［29］，其中MYH1和MYH4基因表達(dá)量水平一致，本研究中，MYH1、MYH4和MYH9基因都與肌纖維數(shù)目相關(guān)，但是MYH1和MYH4基因表達(dá)量趨勢(shì)相反，可能與不同物種、不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期或不同組織有關(guān)。MYH9基因通常被認(rèn)為編碼非肌肉肌球蛋白，然而研究結(jié)果表明MYH9基因調(diào)控雞的骨骼肌纖維生長(zhǎng)速度［30］，也與西伯利亞鱘肌纖維直徑長(zhǎng)度相關(guān)［31］。本研究中，MYH9基因表達(dá)量和肌纖維密度和直徑顯著相關(guān)，說(shuō)明骨骼肌生長(zhǎng)不僅依賴肌肉肌球蛋白，也需要非肌肉肌球蛋白。

MYH1外顯子區(qū)域2個(gè)SVs可能影響基因功能。MYH1和MYH9蛋白共有的結(jié)構(gòu)域Moter domain可能與肌肉病變有關(guān)［32］。馬MYH1蛋白E321G氨基酸發(fā)生替換之后，改變Myosin head結(jié)構(gòu)域功能，導(dǎo)致肌纖維收縮異常［33］。全外顯子測(cè)序結(jié)果表明，編碼人類肌纖維蛋白的MYH1基因錯(cuò)義突變可能導(dǎo)致人類橫紋肌溶解和肌肉損傷，而且該突變位點(diǎn)的致病效應(yīng)與馬E321G氨基酸替換導(dǎo)致肌肉病變的癥狀類似［34］。對(duì)小鼠MYH1基因引入無(wú)義移碼突變，編碼蛋白序列紊亂，導(dǎo)致出生2周后的小鼠開(kāi)始出現(xiàn)骨骼肌發(fā)育不良［35］。本研究中，五指山豬背最長(zhǎng)肌MYH1基因表達(dá)量與肌纖維密度成正比，與肌纖維直徑成反比，而且外顯子區(qū)域包含2個(gè)SVs，表明五指山豬可能通過(guò)SVs調(diào)控MYH1基因表達(dá)量，從而影響背最長(zhǎng)肌肌纖維密度。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、Q-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證和相關(guān)性分析等多種方法探討MYH基因?qū)±w維的影響，不足之處是肌纖維指標(biāo)檢測(cè)樣本量較少，相關(guān)結(jié)論還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入研究。

4 結(jié) 論

五指山豬特異性MYH基因主要分布在第3、5、6、12、13號(hào)染色體，其中第12號(hào)染色體包含基因數(shù)目最多，分別是MYH1、MYH4和MYH10。五指山豬MYH蛋白頭部結(jié)構(gòu)域Myosin-N和Motor domain相對(duì)保守，造成基因分化的可能是中間尾部結(jié)構(gòu)域。皮爾森相關(guān)系數(shù)分析表明，MYH1、MYH4和MYH9基因是否存在SVs與基因表達(dá)量相關(guān)。五指山豬MYH1基因表達(dá)量高于大白豬；兩個(gè)豬品種MYH1基因表達(dá)量趨勢(shì)與MYH4和MYH9基因相反；綜合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和Q-PCR檢測(cè)的基因表達(dá)量與肌纖維指標(biāo)相關(guān)性結(jié)果，取兩者交集，MYH1基因表達(dá)量與肌纖維密度和數(shù)量正相關(guān)，MYH4基因表達(dá)量與肌纖維密度和數(shù)量負(fù)相關(guān)，MYH9基因表達(dá)量與肌纖維密度負(fù)相關(guān)，與直徑呈正相關(guān)；說(shuō)明五指山豬背最長(zhǎng)肌生長(zhǎng)不僅依賴肌肉肌球蛋白，也需要非肌肉肌球蛋白。MYH1、MYH4和MYH9基因均與肌纖維密度相關(guān)，可能通過(guò)調(diào)控背最長(zhǎng)肌肌纖維密度影響肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。本研究結(jié)果不僅擴(kuò)展了五指山豬背最長(zhǎng)肌肌纖維分子機(jī)制的相關(guān)內(nèi)容，也為優(yōu)化結(jié)構(gòu)變異有關(guān)的遺傳育種模式提供借鑒。

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（編輯 郭云雁）