【摘 要】目的：研究自主跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD（Alzheimer’s disease，AD）模型小鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（medial prefrontalcortex，mPFC）內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，少突膠質(zhì)細(xì)胞分化、成熟以及髓鞘形成的作用。方法：將10月齡雄性轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠隨機(jī)分為AD組和AD跑步（AD+RUN）組，另外將同月齡同窩生野生型小鼠隨機(jī)分為正常（WT）組和正常跑步（WT+RUN）組。其中跑步組于跑步籠內(nèi)給予3個(gè)月自主跑步鍛煉，AD組和WT組不做處理。跑步鍛煉結(jié)束后4組小鼠同時(shí)給予行為學(xué)測(cè)試，用Morris水迷宮檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力；用Y迷宮檢測(cè)小鼠工作記憶能力；用新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的認(rèn)知記憶功能；利用無偏體視學(xué)技術(shù)和免疫組化技術(shù)相結(jié)合精確定量小鼠大腦mPFC內(nèi)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞（CC1+）總數(shù)量；同時(shí)分析小鼠mPFC內(nèi)邊緣皮層、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅵ層成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞密度；利用免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡分析小鼠mPFC內(nèi)未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞（PDGFα+/Olig2+）密度、髓鞘標(biāo)志物髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）熒光強(qiáng)度。結(jié)果：AD+RUN組和WT組在Morris水迷宮、Y迷宮以及新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)優(yōu)于AD組，AD組mPFC內(nèi)MBP熒光強(qiáng)度明顯低于WT組（Plt;0.05），而AD+RUN組mPFC內(nèi)MBP熒光強(qiáng)度明顯大于AD組（Plt;0.001）。AD+RUN組mPFC內(nèi)CC1+細(xì)胞總數(shù)較AD組明顯增加（Plt;0.05）。AD+RUN組mPFC內(nèi)第Ⅲ層和第Ⅴ層CC1+細(xì)胞密度較AD組明顯增高（Plt;0.05），AD組mPFC內(nèi)第Ⅴ層和第Ⅵ層CC1+細(xì)胞密度較WT組明顯降低（Plt;0.05）。AD組mPFC內(nèi)PDGFα+/Olig2+細(xì)胞密度明顯大于WT組，而AD+RUN組mPFC內(nèi)PDGFα+/Olig2+細(xì)胞密度明顯小于AD組（Plt;0.05）。結(jié)論：自主跑步運(yùn)動(dòng)能促進(jìn)AD小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和髓鞘形成，這可能與運(yùn)動(dòng)能改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】阿爾茨海默?。蛔灾髋懿竭\(yùn)動(dòng)；內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)；少突膠質(zhì)細(xì)胞；髓鞘

【中圖分類號(hào)】R361.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2023-10-30

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年癡呆最主要的發(fā)病類型之一[1-2]，目前全世界發(fā)病人數(shù)多達(dá)5 000萬[3]，而其中約三分之一病例發(fā)生在中國[4]。自1906年德國精神病學(xué)家阿洛伊斯·阿爾茨海默發(fā)現(xiàn)AD患者以來，多年來科學(xué)家圍繞AD發(fā)病機(jī)制提出了多種學(xué)說，目前普遍認(rèn)為與AD患者腦內(nèi)存在Aβ沉積和異常的磷酸化Tau蛋白、神經(jīng)炎癥等有關(guān)[5-7]。但AD病理變化復(fù)雜多變，圍繞這些學(xué)說所研發(fā)的藥物還未取得明顯治療效果[8-9]。因此找到AD有效的治療靶點(diǎn)仍迫在眉睫。深入探究AD的發(fā)病機(jī)制并以對(duì)AD認(rèn)知功能有改善的非藥物干預(yù)手段為切入點(diǎn)尋找新靶點(diǎn)，是行之有效的方法。

近年來，跑步運(yùn)動(dòng)作為一種非藥物干預(yù)手段改善AD癥狀受到廣泛關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)轉(zhuǎn)基因AD小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力具有積極的改善作用[10-12]。但由于跑步運(yùn)動(dòng)作用廣泛，其改善AD認(rèn)知功能的作用靶點(diǎn)至今仍未完全闡明。

目前，少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocyte，OL）和髓鞘的可塑性在AD發(fā)病機(jī)制逐漸受到重視[13-15]。研究表明，OL減少和髓鞘異常早于Aβ和Tau的病理改變[16]，OL的可塑性障礙會(huì)影響小鼠記憶的鞏固[17]。OL是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）形成髓鞘的特有細(xì)胞，其增殖、分化及轉(zhuǎn)化為髓鞘的過程對(duì)損傷髓鞘的再生和可塑性具有至關(guān)重要的影響[18-19]。2020年，Wang F等[20]發(fā)現(xiàn)促進(jìn)OL分化和髓鞘的形成后，能夠恢復(fù)小鼠空間記憶能力。研究報(bào)道也顯示跑步運(yùn)動(dòng)則能夠有效改善AD小鼠海馬內(nèi)有髓神經(jīng)纖維及髓鞘的丟失[10，12]。而跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)AD小鼠腦內(nèi)少突膠質(zhì)增殖、分化是否有作用目前還未見報(bào)道。

內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（medial prefrontal cortex，mPFC）作為最高階認(rèn)知功能的中心，其神經(jīng)纖維廣泛投射于與認(rèn)知功能密切相關(guān)的腦區(qū)（丘腦、杏仁核和海馬），也是AD患者大腦病理改變的主要受累區(qū)域之一[21-23]。影像學(xué)發(fā)現(xiàn)在AD 的早期階段，mPFC與其他腦區(qū)連接就已經(jīng)出現(xiàn)異常，其連接改變與認(rèn)知障礙密切相關(guān)[24]。AD患者尸檢結(jié)果及AD動(dòng)物模型研究也發(fā)現(xiàn)顯著的前額葉皮質(zhì)萎縮，以及明顯的執(zhí)行功能障礙[21-23]。2019 年Mathys H 等[13]在Nature 發(fā)表的針對(duì)44例AD患者前額葉皮質(zhì)單細(xì)胞測(cè)序的文章發(fā)現(xiàn)，髓鞘形成相關(guān)過程在多種細(xì)胞類型中反復(fù)受到干擾，這表明前額葉皮質(zhì)內(nèi)髓鞘形成在AD病理生理學(xué)中具有關(guān)鍵作用。單核和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析顯示：與正常大腦相比，AD前額葉皮質(zhì)中成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞減少[24]。那么跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)AD小鼠mPFC區(qū)內(nèi)OL是否有作用，作用是什么，目前仍不清楚。

因此，本研究選取10 月齡APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠，跑步組給予3個(gè)月的自主跑步運(yùn)動(dòng)干預(yù)，行為學(xué)結(jié)束后運(yùn)用體視學(xué)、免疫組化、免疫熒光等方法綜合研究跑步鍛煉對(duì)AD小鼠mPFC的OL的作用，為尋找干預(yù)AD的新手段提供新的靶點(diǎn)和切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所購買AD（B6C3-Tg [APPswe+，PSEN1dE9+]85Dbo/NJU）小鼠，于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心自行繁殖，經(jīng)過鑒定，選取APP和PS1基因均為陽性的雄性小鼠40 只，同窩野生型（APPswe- ，PSEN1dE9-）小鼠40只。本研究符合作者所在單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 兔抗髓磷脂堿性蛋白單克隆抗體（rabbit monoclonal [ab218011] to myelin basic protein，MBP），小鼠抗APC 單克隆抗體（mouse monoclonal [ab109186] toanti-adenomatous polyposis coli clone，CC1），兔抗少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2 單克隆抗體（rabbit monoclonal [ab109186] tooligodendrocyte transcription factor 2，Olig2），均來自英國Abcam公司，羊抗血小板衍生生長因子抗體（platelet-derived growthfactor receptor α[AF1062]，PDGFα）購自美國Ramp;D systems公司，DyLight 488 驢抗羊IgG（HRP Donkey Anti-Goat IgG[A24231]），DyLight 488 驢抗兔lgG（HRP Goat Anti-RabbitIgG[A24221]），DyLight 549羊抗兔lgG（HRP Goat Anti-RabbitIgG[A23320]）均購自中國Abbkine 公司，DAB 顯色液、SP-9002試劑盒、免疫組化專用PBS（0.01 mol/L）和枸櫞酸鈉粉來自中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TritonX-100，Tween-20 均購于美國Sigma 公司；十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、蔗糖、多聚甲醛粉脂購于中國成都市科龍化工試劑廠；二甲苯以及75%乙醇購自中國重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠；蘇木素染液、抗熒光淬滅劑購自中國武漢博士德生物工程有限公司；0.9%氯化鈉注射液來自中國太極西南藥業(yè)股份有限公司；戊巴比妥鈉由德國進(jìn)口；ANY-maze Morris水迷宮分析系統(tǒng)來自美國Stoelting，ChemiDocTouch 成像系統(tǒng)來自美國Bio-rad；金屬浴購自中國杭州奧盛儀器有限公司；微量移液器來自德國Eppendorf公司；熒光顯微器來自日本Nikon instrument；體視學(xué)分析軟件購自美國MBF；超低溫冰箱采購于美國Thermo scientific。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將40 只APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為AD組（AD，n=20）和AD跑步組（AD+RUN，n=20），40只同窩野生型小鼠隨機(jī)分為正常組（WT，n=20）和正常跑步組（WT+RUN，n=20）。所有小鼠均在重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心獨(dú)立通氣籠（individually ventilated cage，IVC）系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房包間飼養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物干預(yù)措施 AD+RUN和WT+RUN組給予自主跑步運(yùn)動(dòng)干預(yù)，小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于帶有跑輪的鼠籠內(nèi)，每周定時(shí)記錄1次跑步路程，淘汰極端值小鼠。AD和WT組老鼠在普通鼠籠單獨(dú)飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)。各組小鼠飼養(yǎng)在同一環(huán)境3個(gè)月，期間自由進(jìn)食飲水。

1.2.3 Morris水迷宮 Morris水迷宮用于評(píng)估空間學(xué)習(xí)和記憶能力[25]。剔除體弱和跑步量異常小鼠。在1個(gè)裝有混有白色鈦白粉自來水的圓桶（直徑1.5 m，高0.5 m）中，將桶壁分為4個(gè)象限，在每個(gè)象限隨機(jī)選取一個(gè)黑色圖案（★、●、■、?）貼紙作為標(biāo)記。第1天為可見平臺(tái)將平臺(tái)高于水面0.5～1.0 cm。將小鼠單獨(dú)放置于平臺(tái)學(xué)習(xí)15 s后，選取離平臺(tái)最遠(yuǎn)的兩個(gè)象限分別從桶壁放入水中，1 min之內(nèi)小鼠若未找到平臺(tái)則放置平臺(tái)上學(xué)習(xí)15 s后放入鼠籠。第2～6天為隱藏平臺(tái)期，將平臺(tái)置于水平面下0.5～1.0 cm左右，在這5 d中每天隨機(jī)安排4個(gè)象限順序?qū)⑿∈蠓湃胨羞M(jìn)行實(shí)驗(yàn)。自小鼠入水到找到平臺(tái)并停留3 s的時(shí)間記錄下來作為逃避潛伏期，第7天為空間探索實(shí)驗(yàn)，撤掉平臺(tái)，選取離目標(biāo)平臺(tái)最遠(yuǎn)的2個(gè)象限檢測(cè)小鼠1 min內(nèi)經(jīng)過目標(biāo)平臺(tái)所在位置次數(shù)和目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間比。用以評(píng)價(jià)小鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力[25]。

1.2.4 Y迷宮 Y迷宮用于評(píng)估小鼠工作和參考記憶[26]。Y迷宮是一種以自發(fā)交替的模式測(cè)試小鼠工作和參考記憶的行為學(xué)手段，在實(shí)驗(yàn)開始前3 d控制小鼠飲食和體質(zhì)量。Y迷宮包括3個(gè)夾角均為120°的長窄臂（30 cm×10 cm×15 cm）中，固定一端為起始臂。前4 d實(shí)驗(yàn)，每天開始前將小鼠背對(duì)通道從起始臂尾端放入Y迷宮中自由探索5 min以適應(yīng)環(huán)境，然后交替在其他兩臂尾端放置少量食物并貼上黑色壁紙。記錄小鼠從進(jìn)入起始臂后首次進(jìn)入正確臂的時(shí)間、進(jìn)入正確臂的次數(shù)和進(jìn)入正確臂花費(fèi)總時(shí)間，循環(huán)5次。最后一天則移除食物，在目標(biāo)臂貼上黑色壁紙，進(jìn)行2次自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)。記錄小鼠5 min內(nèi)探索正確臂的時(shí)間和次數(shù)[26]。

1.2.5 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)（novel object recognition，NOR） 通過記錄小鼠對(duì)新舊物體探索時(shí)間長短的行為學(xué)方法評(píng)價(jià)動(dòng)物的認(rèn)知記憶能力。在竭力排除光、聲音、氣味影響的前提下，小鼠在適應(yīng)白色塑料箱10 min后，箱內(nèi)對(duì)角線固定兩個(gè)相同形狀顏色的物體A，物體距離墻壁約10 cm。小鼠于箱體中間放入箱中，使其熟悉物體A 10 min。然后用30%～40%乙醇擦拭箱壁，消除小鼠糞便和尿液的味道，再放入下1只小鼠繼續(xù)適應(yīng)環(huán)境和物體。1 h后，將箱內(nèi)其中1個(gè)物體A換成與其顏色形狀完全不同的物體B，開始正式測(cè)試。用攝像頭和軟件記錄小鼠5 min內(nèi)探索行為。記下小鼠對(duì)新舊物體探索的時(shí)間和次數(shù)。并根據(jù)公式計(jì)算小鼠認(rèn)知指數(shù)（recognition index，RI）：RI=新物體（/ 新物體+舊物體）×100%。

1.2.6 腦組織取材和標(biāo)本制備 每組隨機(jī)選取5只小鼠，記錄每只小鼠的耳標(biāo)號(hào)和體質(zhì)量，用1%現(xiàn)配的戊巴比妥麻醉劑腹腔給藥，麻醉后暴露小鼠心臟，依次用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注后，于顱骨中剝離大腦，在4%多聚甲醛中浸泡至少24 h，蔗糖梯度（10%、20%、30%）依次脫水后，隨機(jī)選取一側(cè)大腦用冰凍切片機(jī)以50 μm或30 μm厚度進(jìn)行連續(xù)切片，然后等距抽樣。分別可得5組和8組組織切片，隨后浸泡于75%乙醇中，保存在-20 ℃冰箱以供取用。

1.2.7 免疫組化染色 每只小鼠選取1組50 μm的腦組織切片。PBS（0.01 mol/L）漂洗（10 min×3）后用PBS+T（0.3%Triton+0.1%Tween+PBS溶液配制而成）漂洗（15 min×3），隨后將腦片在室溫避光條件下浸泡于H2O2 20 min 中。PBS+T 漂洗（5 min×2），其后浸泡在枸櫞酸鹽溶液中熱水浴30 min進(jìn)行組織修復(fù)；腦片恢復(fù)室溫后于PBS+T 中漂洗（5 min×2），再用0.1%山羊血清和PBS+T溶液配置的封閉液封閉切片，于37 ℃水浴鍋中封閉2 h。然后將切片置于小鼠來源CC1單克隆抗體（1∶1 000）4 ℃環(huán)境中孵育72 h，其間隨時(shí)搖晃切片防止貼壁；隨后將切片于PBS+T 漂洗（10 min×6），浸于羊抗小鼠lgG（SP-9002）（1∶10）溶液中，37 ℃水浴3 h，后于PBS+T漂洗（10 min×6），然后辣根過氧化酶在37 ℃水浴鍋孵育2 h，PBS漂洗（10 min×6），后于DAB避光顯色1～2 min。用大量去離子水洗凈（5 min×6）后，再用PBS漂洗（10 min×6），貼片，蘇木素核染（2 min），PBS洗凈，飽和Na2HPO4返藍(lán)30 s，PBS洗凈，梯度酒精脫水，二甲苯10 min×3；中性樹脂封片過夜。

1.2.8 定量成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞 在10倍物鏡下描繪mPFC邊界，于100倍油鏡下進(jìn)行切片厚度測(cè)量、抽樣，并按照體視學(xué)中體視框的禁線法則（圖1）對(duì)CC1+細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)光學(xué)分合法公式得到CC1+細(xì)胞總數(shù)[27]：

1.2.9 mPFC分區(qū)和CC1+細(xì)胞密度統(tǒng)計(jì) 在光學(xué)顯微鏡10倍物鏡下描繪mPFC分界，并描繪出mPFC各層的細(xì)胞帶分層（邊緣皮層、Ⅱ?qū)印ⅱ髮?、Ⅴ層、Ⅵ層）。然后?00倍鏡下每層隨機(jī)挑選3～5個(gè)視野，選取細(xì)胞核最清晰的高度進(jìn)行拍照。分別計(jì)算mPFC各層CC1+細(xì)胞密度。

1.2.10 免疫熒光染色并計(jì)數(shù)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（oligodendrocyteprecursor cell，OPC） 每只小鼠選取1組30 μm的腦組織切片。將腦片于PBS（0.01 mol/L）漂洗（10 min×3）；然后置于PBS+T溶液中漂洗（15 min×3）；其后將腦片放入枸櫞酸鹽溶液中加熱30 min修復(fù)組織；待組織恢復(fù)室溫后PBS+T漂洗（5 min×2）；用驢血清、牛血清，以及PBS+T溶液（1∶200∶1 000）配置的封閉液封閉切片，使用37 ℃水浴鍋封閉2 h。然后浸在羊抗PDGFα單克隆抗體溶液中于4 ℃環(huán)境中孵育48 h，其間隨時(shí)搖晃切片防止貼壁；PBS+T漂洗（10 min×6）；驢抗羊（綠）和PBS+T（1：200）配置溶液，在37 ℃的水浴鍋中孵育2 h，此步驟及以后所有步驟均需避光；羊抗小鼠lgG（SP-9002）和PBS+T（1：10）配置溶液，在37 ℃的水浴鍋中孵育2 h；在Olig2和PBS+T（1：200）配置的溶液中，置于4 ℃環(huán)境中孵育48 h，其間隨時(shí)搖晃切片防止貼壁；PBS+T漂洗6次（10 min×6）；羊抗兔（紅）和PBS+T（1∶200）配置溶液，在37 ℃的水浴鍋中孵育2 h；PBS+T漂洗（10 min×6）；含DAPI 抗熒光淬滅劑封片，4 ℃冰箱避光保存留待觀察。在激光共聚焦顯微鏡下拍攝mPFC區(qū)大圖，利用imagej軟件畫框計(jì)數(shù)，計(jì)算mPFC內(nèi)PDGFα+/Olig2+細(xì)胞和Olig2+細(xì)胞密度。

1.2.11 免疫熒光染色和MBP熒光強(qiáng)度 實(shí)驗(yàn)步驟同上，其中一抗為兔抗MBP和PBS+T（1∶5 000）配制而成；二抗為羊抗兔（綠）和PBS+T（1∶200）配制而成。在激光共聚焦顯微鏡下拍攝mPFC區(qū)大圖，利用imagej軟件分析MBP熒光強(qiáng)度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Stata17軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，其中4組小鼠逃避潛伏期組間差異采用重復(fù)測(cè)量方差分析，其余的數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)且滿足方差齊后使用單因素方差分析，滿足正態(tài)分布但方差不齊用Welch’s ANOVA 檢驗(yàn)分析。不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行Box-Cox轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)后滿足正態(tài)分布且滿足方差齊則采用單因素方差分析，轉(zhuǎn)換后仍不滿足正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 自主跑步運(yùn)動(dòng)顯著改善AD小鼠的認(rèn)知功能

2.1.1 Morris 水迷宮結(jié)果 AD 組（50.565±12.162）小鼠水迷宮逃避潛伏期顯著長于WT 組（32.625±16.324）（F=20.800，P=0.000；圖2A），為期3個(gè)月的自主跑步運(yùn)動(dòng)之后，AD+RUN組（38.735±13.906）小鼠水迷宮逃避潛伏期相較于AD 組明顯縮短（P=0.000；圖2A）。AD 組（0.455±0.472）的平均穿臺(tái)次數(shù)相較于WT 組（2.773±0.754）明顯減少，而AD+RUN組穿臺(tái)次數(shù)（2.364±1.164）相較于AD組顯著增多（F=13.910，P=0.000；圖2B）。AD 組小鼠（0.239±0.052）在水迷宮探索目標(biāo)象限游泳時(shí)間比顯著低于WT組（0.346±0.072），AD+RUN 組（0.351±0.102）的目標(biāo)象限游泳時(shí)間比顯著高于AD 組（F=4.080，P=0.023；圖2C）。水迷宮結(jié)果顯示經(jīng)過3個(gè)月的自主跑步運(yùn)動(dòng)之后，APP/PS1模型小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力得到了顯著的改善。

2.1.2 Y迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 WT組（0.630±0.114）自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確率明顯大于AD組（0.417±0.125）（F=9.590，P=0.000；圖2D），AD組小鼠自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)進(jìn)入正確臂的準(zhǔn)確率相較于AD+RUN組（0.590±0.103）明顯減?。≒=0.005，圖2D）。Y迷宮結(jié)果顯示經(jīng)過3個(gè)月的自主跑步運(yùn)動(dòng)之后，APP/PS1模型小鼠的工作記憶和學(xué)習(xí)能力得到了顯著的改善。

2.1.3 NOR結(jié)果 WT組M（0.42）RI相較于AD組Md（0.34）顯著增高（χ2=13.925，P=0.000；圖2E）；AD組小鼠的RI指數(shù)相較于AD+RUN 組Md（0.38）明顯降低（P=0.014，圖2E）。NOR結(jié)果顯示經(jīng)過3個(gè)月的自主跑步運(yùn)動(dòng)之后，APP/PS1模型小鼠的認(rèn)知記憶能力得到了改善。

行為學(xué)結(jié)果表明為期3個(gè)月自主跑步運(yùn)動(dòng)有助于改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知功能。

2.2 自主跑步運(yùn)動(dòng)增加AD小鼠mPFC內(nèi)CC1+細(xì)胞總數(shù)，主要增加mPFC內(nèi)第Ⅲ、Ⅴ層CC1+細(xì)胞密度

2.2.1 CC1+細(xì)胞體視學(xué)結(jié)果 對(duì)4組小鼠mPFC采用體視學(xué)方法定量確定統(tǒng)計(jì)CC1+細(xì)胞總數(shù)后發(fā)現(xiàn)：與AD組（0.851±1.032×10-7）相比，AD+RUN 組（0.851±4.013×10-7）CC1+細(xì)胞總數(shù)明顯增加（F=5.390，P=0.025；圖3）；但與WT組（0.851±4.601×10-7）相比，AD 組CC1+細(xì)胞總數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.341，圖3）。

2.2.2 mPFC各層CC1+細(xì)胞密度結(jié)果 4組小鼠mPFC分層后，mPFC 邊緣皮層和第Ⅱ?qū)觾?nèi)CC1+細(xì)胞密度分析，AD 組（22.652±5.648，22.651±5.648）與WT 組（34.323±6.499，34.323±6.499）相比，mPFC邊緣皮層和第Ⅱ?qū)觾?nèi)CC1+細(xì)胞密度無明顯差異（F=1.253，P=0.400；F=0.363，P=0.500；圖4A、B），AD 組與AD+RUN 組（48.078±20.698，48.078±20.698）相比，mPFC邊緣皮層和第Ⅱ?qū)觾?nèi)CC1+細(xì)胞密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.089、P=0.461，圖4A、B）。

mPFC第Ⅲ層內(nèi)CC1+細(xì)胞密度分析結(jié)果：AD組（37.069±2.375）與WT 組（41.512±1.035）之間CC1+細(xì)胞密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.562，P=0.365；圖4C），AD+RUN組（52.066±1.876）CC1+細(xì)胞密度相較于AD組明顯增高（P=0.012，圖4C）。

mPFC 第Ⅴ層內(nèi)CC1+細(xì)胞密度分析，AD 組（57.765±6.648）CC1+細(xì)胞密度與WT組（77.336±9.189）相比明顯降低（F=3.689，P=0.028；圖4D），AD組CC1+細(xì)胞平均密度相較于AD+RUN組（76.902±6.402）明顯降低（P=0.030，圖4D）。

對(duì)mPFC第Ⅵ層內(nèi)CC1+細(xì)胞密度分析，AD組（84.248±11.987）CC1+細(xì)胞密度與WT組（115.610±1.852）相比明顯降低（F=2.379，P=0.041；圖4E），AD 組CC1+細(xì)胞密度相較于AD+RUN組（107.118±26.067）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.114，圖4E）。

以上結(jié)果提示與WT組相比，AD組小鼠mPFC內(nèi)總的成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量沒有改變。而自主跑步運(yùn)動(dòng)可顯著增加APP/PS1小鼠mPFC內(nèi)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。對(duì)mPFC分層進(jìn)行CC1+細(xì)胞密度統(tǒng)計(jì)后，本課題組發(fā)現(xiàn)與WT組相比，AD組小鼠mPFC內(nèi)Ⅴ、Ⅵ層成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞密度明顯降低，而3個(gè)月的自主跑步運(yùn)動(dòng)可以明顯增加APP/PS1小鼠mPFC內(nèi)第Ⅲ層和第Ⅴ層成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞密度。

2.3 自主跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)mPFC內(nèi)PDGFα+和Olig2+細(xì)胞密度的影響

對(duì)4組小鼠mPFC腦區(qū)PDGFα和Olig2的免疫熒光染色（圖5A）并計(jì)算mPFC內(nèi)PDGFα+/Olig2+細(xì)胞和Olig2+細(xì)胞密度，本研究發(fā)現(xiàn)：AD組（12.968±1.501）相較于WT組（6.477±1.453）mPFC內(nèi)PDGFα+/Olig2+細(xì)胞密度明顯上升（F=15.800，P=0.005；圖5B），AD 組mPFC 內(nèi)PDGFα+/Olig2+細(xì)胞密度相較于AD+RUN組（5.886±0.537）明顯升高（P=0.003，圖5B）。AD 組（38.250±2.969）小鼠對(duì)比WT 組（37.149±5.060）和AD+RUN組（32.476±3.248）小鼠mPFC中Olig2+細(xì)胞密度均無明顯差異（F=1.940，P=1.000，P=0.547；圖5C）。AD 組（0.342±0.062）小鼠mPFC內(nèi)PDGFα+/Olig2+細(xì)胞與Olig2+細(xì)胞密度比值明顯高于WT 組（0.174±0.025）（F=8.030，P=0.023；圖5D）和AD+RUN組（0.184±0.034）（P=0.032，圖5D）。

2.4 自主跑步運(yùn)動(dòng)明顯增加mPFC內(nèi)MBP熒光強(qiáng)度

對(duì)4組小鼠mPFC進(jìn)行MBP免疫熒光染色（圖6A），結(jié)合Image J軟件定量分析結(jié)果顯示：AD組（15.010±3.795）相較于WT組（36.100±11.618），mPFC內(nèi)MBP熒光強(qiáng)度值明顯降低（F=6.860，P=0.015；圖6B），并且AD組mPFC內(nèi)MBP熒光強(qiáng)度值明顯低于AD+RUN 組（31.611±9.412）（P=0.042，圖6B）。以上結(jié)果表明：AD 組小鼠與WT組相比較，mPFC 內(nèi)MBP表達(dá)量呈明顯降低，表明AD小鼠mPFC區(qū)存在髓鞘的丟失，而自主跑步運(yùn)動(dòng)可明顯延緩AD小鼠大腦mPFC區(qū)髓鞘的丟失。

3 討 論

AD作為一種隨著年齡增加而患病風(fēng)險(xiǎn)直線上升的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，世界上平均每3 s就會(huì)有1人被診斷為癡呆癥[1，3]。研究顯示目前癡呆癥已經(jīng)超過腫瘤，成為全球第5大死因[1，3，5]，因此作為癡呆癥的主要類型的AD，不僅能帶走人們的記憶，還是一位致命“殺手”。然而世界衛(wèi)生組織在《降低認(rèn)知衰退和癡呆癥風(fēng)險(xiǎn)指南》也指出保持身體活動(dòng)與大腦健康有關(guān)，通過運(yùn)動(dòng)、步行、騎車、做家務(wù)等方式可以降低認(rèn)知衰退風(fēng)險(xiǎn)。跑步運(yùn)動(dòng)多為一種簡(jiǎn)便易行的運(yùn)動(dòng)方式。研究證實(shí)了通過跑步鍛煉對(duì)AD患者和AD模型小鼠的認(rèn)知功能均具有改善作用[10-12]，因此提出跑步鍛煉是改善AD認(rèn)知功能障礙的一種有效治療或者預(yù)防手段。而在目前研究中，跑步鍛煉模式上主要是被動(dòng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和自主轉(zhuǎn)輪跑步運(yùn)動(dòng)[27-28]。而有研究認(rèn)為自主轉(zhuǎn)輪跑步運(yùn)動(dòng)因?yàn)樾枰軐?shí)驗(yàn)方式影響，小鼠必須在帶有轉(zhuǎn)輪的籠子里單獨(dú)飼養(yǎng)，這種獨(dú)居的飼養(yǎng)模式會(huì)給動(dòng)物造成壓力和焦慮感，從而影響跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)大腦的保護(hù)作用[29-31]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)被動(dòng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)是利用跑步機(jī)對(duì)小鼠人為地進(jìn)行強(qiáng)迫跑步運(yùn)動(dòng)，其間部分可能還會(huì)伴隨電擊，也會(huì)給動(dòng)物造成壓力，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[31]。然而在自然界的野生小鼠中有研究觀察到其會(huì)使用跑輪自發(fā)奔跑[32]。由此有研究認(rèn)為小鼠自主轉(zhuǎn)輪跑步鍛煉方式較被動(dòng)跑臺(tái)鍛煉更接近于自然跑步模式[33]。鑒于此，本研究采用了自主轉(zhuǎn)輪跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)10月齡的APP/PS1小鼠進(jìn)行了為期3個(gè)月的跑步干預(yù)，在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中本研究發(fā)現(xiàn)自主跑步運(yùn)動(dòng)確實(shí)改善了AD小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，甚至在檢測(cè)工作記憶的Y 迷宮中，自主跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)AD小鼠也有很明顯的改善作用。因此，本研究進(jìn)一步表明長期的自主跑步運(yùn)動(dòng)確實(shí)對(duì)AD小鼠認(rèn)知功能具有積極的改善作用。

目前尚不清楚自主跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)AD小鼠認(rèn)知功能的改善作用的機(jī)制是什么。多項(xiàng)研究表明學(xué)習(xí)和記憶的形成需要髓鞘的形成[14，20，34-35]。Wang F等[20]還發(fā)現(xiàn)在針對(duì)老年小鼠認(rèn)知能力下降的研究中，脫髓鞘和髓鞘的更新減少與空間學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)，使用氯馬斯汀治療促進(jìn)小鼠髓鞘的形成可以改善衰老小鼠的記憶功能。而AD患者和AD動(dòng)物模型小鼠腦內(nèi)均存在廣泛的髓鞘丟失[36]，由于脫髓鞘也會(huì)破壞神經(jīng)元傳導(dǎo)，甚至導(dǎo)致功能性大腦區(qū)域的破壞和隨之而來的神經(jīng)元的變性丟失[37]。因此AD大腦內(nèi)的髓鞘丟失在AD認(rèn)知功能的改變中具有重要作用。mPFC作為調(diào)控認(rèn)知功能、注意力、情緒等功能的高級(jí)腦區(qū)，在記憶的鞏固和檢索中具有重要作用[38]。mPFC腦區(qū)內(nèi)的神經(jīng)纖維廣泛投射于與認(rèn)知功能密切的腦區(qū)（丘腦、杏仁核和海馬），因此其信息傳輸障礙或者鏈接中斷也會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能下降[23，38]。那么AD小鼠mPFC中髓鞘是否發(fā)生了改變還鮮少有研究。在本研究中，本課題組利用MBP對(duì)髓鞘進(jìn)行免疫熒光染色，觀察mPFC內(nèi)髓鞘的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在出現(xiàn)認(rèn)知功能改變的APP/PS1小鼠的mPFC 腦區(qū)內(nèi)MBP 表達(dá)量顯著降低。這與Wang Z等[39]之前發(fā)現(xiàn)的研究相似。而先前的研究表明促進(jìn)AD模型小鼠海馬和皮層內(nèi)髓鞘形成能夠改善AD 模型小鼠的認(rèn)知功能[36]。Chao FL 等[40]和Zhang L等[41]利用體視學(xué)對(duì)APP/PS1小鼠的海馬和白質(zhì)區(qū)域的有髓神經(jīng)纖維進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)月的跑步運(yùn)動(dòng)干預(yù)延緩了AD認(rèn)知功能下降，并增強(qiáng)了AD模型小鼠海馬和白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的體積。然而目前尚沒有證據(jù)表明跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)AD模型小鼠mPFC區(qū)域內(nèi)髓鞘的影響。本研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)月的自主跑步運(yùn)動(dòng)顯著增強(qiáng)AD小鼠mPFC中髓鞘相關(guān)蛋白MBP免疫熒光的強(qiáng)度，這提示跑步運(yùn)動(dòng)可能促進(jìn)AD小鼠mPFC內(nèi)髓鞘的形成。因此，本課題組推測(cè)跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)mPFC髓鞘形成的有益作用可能是其延緩AD小鼠認(rèn)知功能衰退的重要基礎(chǔ)之一。

那么是什么原因?qū)е翧PP/PS1小鼠mPFC髓鞘受損，而跑步運(yùn)動(dòng)改善其髓鞘形成的原因是什么呢？成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞是CNS的髓鞘形成細(xì)胞，對(duì)損傷髓鞘的可塑性和修復(fù)具有重要意義[42]。研究表明OL特別容易受到Aβ的影響從而死亡[43]。本研究通過免疫組化（CC1+）和體視學(xué)相結(jié)合的方式定量了成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的總數(shù)量，本研究發(fā)現(xiàn)AD組對(duì)比WT組小鼠，mPFC區(qū)域成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)沒有改變。本研究的結(jié)果與Lau SF等[24]的結(jié)果不同。根據(jù)AD患者前額葉皮質(zhì)區(qū)域的單核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了該區(qū)域內(nèi)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的減少。而前額葉皮質(zhì)包括mPFC、眶額皮層（orbitofrontal cortex，OFC）、背外側(cè)前額葉皮層（dorsolateral prefrontalcortex，dlPFC）、腹外側(cè)前額葉皮質(zhì)（ventrolateralprefrontal cortex，vlPFC）以及腹側(cè)前額葉皮層（ventralmedial prefrontal cortex，vmPFC）5 個(gè)亞區(qū)，每個(gè)亞區(qū)分別行使不同的功能[44-45]，因此整體的區(qū)域水平從某種層面來說并不能反映各部分變化的不同。雖然Wu YL等[46]對(duì)APP/PS1海馬內(nèi)成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量定量分析顯示其數(shù)量顯著減少，但是所用動(dòng)物月齡不一致，區(qū)域不一樣，或許導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不一致。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，本課題組對(duì)mPFC區(qū)域進(jìn)行分層測(cè)量，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)AD組第V、Ⅵ層成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞密度顯著低于WT組。這提示mPFC成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的丟失可能主要集中在mPFC的第Ⅴ、Ⅵ層細(xì)胞帶。由于前額葉皮質(zhì)區(qū)域每一層的神經(jīng)元組成類型不同，功能也可能是不同[47]。有研究發(fā)現(xiàn)前額葉皮質(zhì)的認(rèn)知功能與其邊緣下區(qū)（infralimbicprefrontal cortex，IL）第Ⅲ層椎體神經(jīng)元和杏仁核的耦合密不可分[48-49]，此外，前額葉皮質(zhì)區(qū)域也會(huì)接受一些其他核團(tuán)的投射。海馬區(qū)域投射范圍限制較大，而mPFC作為接受其投射的重要腦區(qū)之一，來自海馬的纖維投射也主要終止于Ⅲ層，從而影響記憶的加工處理[50]。前額葉皮層第Ⅵ層是丘腦密集反饋投射的起源，Ⅵ層表達(dá)煙堿受體的神經(jīng)元在注意力方面起著至關(guān)重要的作用從而影響執(zhí)行功能的改變[51]?？傊琺PFC 內(nèi)不同層次的區(qū)域?qū)φJ(rèn)知的影響并不相同。因此，推測(cè)在不同的疾病模型中，mPFC每一層OL的改變是不一致的。例如針對(duì)精神分裂癥患者的尸檢研究表明，前額葉皮質(zhì)第V層OL密度相較于其他皮層明顯降低[52]。而文獻(xiàn)也指出大腦中的OL對(duì)運(yùn)動(dòng)高度敏感，4周自主轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)會(huì)促進(jìn)青年人前額葉皮質(zhì)內(nèi)OL 的生成[53]。Lou YM等[54]發(fā)現(xiàn)跑步運(yùn)動(dòng)可以顯著增加慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激大鼠模型中mPFC內(nèi)OL的數(shù)量。在本研究中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)月的跑步運(yùn)動(dòng)增加了APP/PS1小鼠mPFC內(nèi)總的成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，尤其是顯著增加該模型mPFC區(qū)域第Ⅲ層和第Ⅴ層成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。因此，推測(cè)自主跑步運(yùn)動(dòng)可增加APP/PS1小鼠mPFC 中成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，并且這種改變具有區(qū)域異質(zhì)性，主要體現(xiàn)在自主跑步運(yùn)動(dòng)作用于mPFC區(qū)域第Ⅲ層和第Ⅴ層的OL。

此外，OPC作為CNS成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，在整個(gè)生物的生命過程中持續(xù)增殖并分化成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞[55]，從而促進(jìn)髓鞘的形成[55-56]。研究表明AD患者大腦內(nèi)的髓鞘碎片，可以通過刺激OPCs的增殖、促進(jìn)OPCs向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，從而進(jìn)行髓鞘的再生及修復(fù)[57-59]。本研究使用免疫熒光雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與WT 組相比，AD 組小鼠mPFC 內(nèi)PDGFα+/Olig2+ 細(xì)胞密度、PDGFα+/Olig2+ 細(xì)胞和Olig2+細(xì)胞密度的比值顯著增加。這表明AD小鼠mPFC內(nèi)的OPCs或許存在增殖。本研究的結(jié)果與Behrendt G等[57]和Ferreira S等[58]的結(jié)果相似，有研究發(fā)現(xiàn)APP/PS1小鼠海馬內(nèi)中存在OPCs的增殖[59-63]。成人腦內(nèi)OPCs 數(shù)量通常情況下會(huì)保持一定的穩(wěn)態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)髓鞘損傷則會(huì)刺激OPCs進(jìn)一步增殖、分化，從而修復(fù)髓鞘。因此本研究推測(cè)AD小鼠mPFC腦區(qū)內(nèi)同樣存在普遍的OPCs 增殖現(xiàn)象。與此同時(shí)，本研究先前的結(jié)果表明雖然OPC增多，但是AD組小鼠mPFC髓鞘并沒有得到修復(fù)，結(jié)合OPC到髓鞘的再生過程時(shí)間并不長[60-61]，因此本研究推測(cè)AD小鼠從OPC到成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化出現(xiàn)了障礙。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過3個(gè)月的自主跑步運(yùn)動(dòng)，AD+RUN組小鼠mPFC內(nèi)在少突膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞總數(shù)沒改變的情況下，OPCs密度顯著降低，而成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞顯著增加。因此本研究推測(cè)自主跑步運(yùn)動(dòng)有可能會(huì)促進(jìn)AD小鼠mPFC內(nèi)OPCs向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，為期3個(gè)月的自主跑步運(yùn)動(dòng)可能通過促進(jìn)AD 小鼠mPFC 內(nèi)OPCs 向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，進(jìn)一步促進(jìn)該區(qū)域內(nèi)髓鞘的形成，從而改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能。本課題組目前的研究結(jié)果，為AD病理進(jìn)程中mPFC的OL和髓鞘的病理變化提供了進(jìn)一步證據(jù)，為跑步運(yùn)動(dòng)改善AD認(rèn)知功能提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有望為將來開發(fā)AD新的治療方法提供新靶點(diǎn)和新思路。

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（責(zé)任編輯：周一青）