摘 要：【目的】鑒定馬鈴薯主要病毒病病原，為馬鈴薯病毒病的科學防治提供科學依據(jù)。【方法】根據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫注冊序列設計馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y ，PVY）、馬鈴薯S病毒（Potato virus S，PVS）、馬鈴薯卷葉病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）的檢測引物，完成引物濃度及系統(tǒng)優(yōu)化?！窘Y(jié)果】建立3種馬鈴薯病毒病的實時熒光定量PCR檢測技術(shù)體系（real-time fluorescent quantitative RT-PCR，RT-qPCR），其標準曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈良好的線性關系，相關系數(shù)為99.42%以上，擴增效率均為84.48%以上，可快速、準確檢測出3種馬鈴薯病毒?！窘Y(jié)論】實時熒光定量PCR檢測技術(shù)是一種高靈敏度、特異性強的檢測方法，可實時監(jiān)測馬鈴薯生產(chǎn)中病毒病的感染情況。

關鍵詞：馬鈴薯；病毒病；實時熒光定量PCR

中圖分類號：S436.3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-4330（2024）10-2484-07

收稿日期（Received）：2024-04-12

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)重點研發(fā)項目“新疆馬鈴薯種質(zhì)資源創(chuàng)新及脫毒種薯繁育技術(shù)研究與應用”（2022B02044-1）

作者簡介：楊茹薇（1984-），女，寧夏靈武人，正高級農(nóng)藝師，研究方向為植物保護，（E-mail）617950493@qq.com

通訊作者：劉易（1983-），男，河北保定人，研究員，研究方向為作物栽培育種，（E-mail）414002880@qq.com

0 引 言

【研究意義】馬鈴薯（Solanum tuberosum L）是茄科茄屬一年生草本植物，其塊莖可供食用^［1］。目前我國馬鈴薯種植面積和產(chǎn)量均居世界第一^［2］，2015年馬鈴薯已成為我國第四大糧食作物。馬鈴薯是一種產(chǎn)量較高的糧食作物。近年來馬鈴薯病毒病的波及范圍在逐步擴大，制約了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展^［3］。傳統(tǒng)的防治技術(shù)主要包括有媒介昆蟲防治、脫毒技術(shù)等等。這些技術(shù)在防治一般植物病毒病時起到了較好的效果^［4］。侵染馬鈴薯最嚴重的三種病毒為PVY、PLRV、PVS，也是影響馬鈴薯生產(chǎn)的三種主要病毒^［5］?！厩叭搜芯窟M展】傳統(tǒng)病原菌檢測法有兩大類，一是病原學檢測，如革蘭氏染色法、形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察法等，二是免疫學檢測，有乳膠凝集試驗、熒光免疫檢測法等^［6］。在植物病原體檢測、監(jiān)控病原物感染檢測與分析中使用到該技術(shù)^［7］。實時熒光定量RT-PCR在檢測多種植物病毒中的靈敏度都達到了常規(guī)RT-PCR技術(shù)的 100 倍甚至更高^［8-10］。目前，已經(jīng)建立了 PVX（Potato virus X ，PVX）、PVY^［11］、PVS^［12］、馬鈴薯 A 病毒（Potato virus A，PVA）和 PLRV^［13］的實時熒光定量PCR檢測體系?！颈狙芯壳腥朦c】實時熒光定量RT-PCR是在PCR反應時，利用熒光信號積累實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物生成，判斷目標物是否存在。該檢測技術(shù)的敏感性與特異性均非常強。而且可實現(xiàn)定量分析、實時分析。馬鈴薯病毒病是影響品種退化及產(chǎn)量下降的主要病害之一，需針對生產(chǎn)過程中馬鈴薯主要病毒病病原進行鑒定。【擬解決的關鍵問題】選用設計特異性強的實時熒光定量PCR檢測引物，采集新疆主產(chǎn)區(qū)馬鈴薯病毒樣本，建立3種高效的馬鈴薯病毒病的實時熒光定量PCR檢測方法，于新疆馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采樣及檢測馬鈴薯病毒病樣，掌握馬鈴薯病毒病害的發(fā)生情況，為防控新疆主產(chǎn)區(qū)馬鈴薯病毒病提供重要科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

在新疆馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)5個縣采集疑似病毒病感染植株葉片。

儀器設備：Neofuge 13R高速冷凍離心機（上海力升科學儀器有限公司），電泳儀（美國Major science），EDC-810 PCR儀（北京東升生物技術(shù)有限公司），MA-6000熒光定量 PCR 儀（蘇州雅睿生物科技有限公司）、超微量紫外分光光度計Nanodrop 2000（美國Thermo Scientinc Inc）等。檢測試劑：檢測試劑盒由上海派森諾生物科技股份有限公司提供、其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA提取合成

按照試劑盒說明書提取馬鈴薯葉片RNA，并將提取的RNA保存于-80℃，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA保存于-20℃。

1.2.2 引物設計與合成

根據(jù)GenBank公布的3種馬鈴薯病毒基因序列，采用Primer premier 5.0軟件設計引物。表1

1.2.3 引物特異性驗證

提取馬鈴薯病毒病RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以ddH₂O為陰性對照，對引物進行常規(guī)RT-PCR、實時熒光定量PCR擴增，驗證引物的特異性。

PCR反應體系為：2×easy Taq super Mix 10 μL，正向和反向引物（10 mmol/L）各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH₂O稀釋至20 μL。反應程序：95℃ 5 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，35 個循環(huán)；72℃ 7 min并保存于4℃^［14］。反應完成后，收集7 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1 ％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。120 V恒壓電泳25 min后，在凝膠成像系統(tǒng)上檢查結(jié)果并保存。

實時熒光定量PCR反應體系：SYBR Green Mix 10 μL，P1/P2 引物各 0.4 μL，cDNA 模板 1 μL，50 × ROX 參比染料 0.4 μL，ddH₂O 稀釋至 20 μL。反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。溫度不斷增長，將各個階段熒光信號收集起來，建立熔解曲線。

1.2.4 檢測靈敏度

將初始cDNA 模板稀釋為10個濃度梯度，稀釋倍數(shù) 10～10¹⁰，每個稀釋梯度重復 3 次。并分別采用常規(guī) RT-PCR 、實時熒光定量PCR 擴增法進行檢測，基于擴增片段有無、熒光值大小來判斷、分析引物對兩種檢測方法的敏感度。

1.2.5 標準曲線的建立

將陽性重組質(zhì)粒cDNA梯度稀釋10倍，用引物進行實時熒光定量PCR擴增。使用X軸上的質(zhì)粒濃度對數(shù)和Y軸上的 Ct，生成實時熒光定量 PCR 標準曲線。

1.2.6 樣本檢測

從新疆馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集疑似感染病毒葉片提取RNA，使用實時熒光定量PCR體系對每個樣本進行病毒檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取結(jié)果

研究表明，試劑盒提取的RNA中28s和18s兩條亮帶最亮，5 s條帶較淺，無明顯拉伸，即表示提取的RNA未降解，較為完整。另有檢測結(jié)果表明，試劑盒提取的RNA質(zhì)量符合后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄反應的模板質(zhì)量要求。圖1

2.2 檢測靈敏度及準確度

研究表明，當初始模板濃度很低時，3個馬鈴薯病毒基因仍然具有良好的擴增效率，且靈敏性都比較強。基線平坦、斜率大、無異常擴增。各擴增產(chǎn)物的溶解曲線僅顯示單峰，不存在引物二聚體及非特異性擴增。圖2，圖3

2.3 引物特異性檢測

研究表明，將提取的總RNA作為模板進行反轉(zhuǎn)錄反應，用PVY、PVS、PLRV三種特異性引物分別進行PCR擴增反應。設計的3對引物可以擴增目的片段，初步判斷擴增出了PVY、PVS、PLRV目的基因，可用于實時熒光定量PCR檢測。圖4

2.4 標準曲線的建立

將質(zhì)粒標準品梯度稀釋10倍進行實時熒光定量PCR擴增，繪得標準曲線。3種標準曲線方程的R²均接近1，即表示在測定濃度范圍，陽性質(zhì)?？截悢?shù)與對應Ct值線性均具有較強線性相關性，可用于檢測隨后樣品中病毒拷貝量的數(shù)量。圖5，表2

2.5 不同患病植株檢測結(jié)果

研究表明，PVY樣本每毫升RNA中病毒拷貝數(shù)從高到低依次為QT-58、QT-61、BLK-87，其相對表達量分別為1203.03 copies/μL、1198.05 copies/μL、1170.87 copies/μL，與其余樣本存在顯著差異。樣本ZP-6顯著性高于其它16個樣本，其PVS相對表達量為622.49 copies/μL，樣本QT-23和QT-28與QT-19、QT-17樣本無顯著差異。PLRV樣本每毫升RNA中病毒拷貝數(shù)從高到低依次為QT-9、QT-12、QT-17，其相對表達量分別為128.78、71.26和49.8 copies/μL，染病程度QT-9﹥QT-12﹥QT-17。樣品QT-9顯著性高于其它5個樣本，樣本QT-12和QT-17、QT-20、QT-21樣本之間無顯著差異。圖6～8

3 討 論

3.1 馬鈴薯病毒病在我國各個產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，已感染病毒的植株可通過無性繁殖世代積累及傳遞，因無特效化學藥劑防治，又因不同病毒可在植株上引起相似的癥狀，而在不同條件下同種病毒引起的癥狀又有所差異，病害田間診斷困難，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術(shù)已研究的較成熟^［15-18］。應用實時熒光定量PCR技術(shù)達到快速檢測馬鈴薯病毒病的技術(shù)，對樣本的含毒量要求低，不僅可以定性還能定量分析^［14］，可準確、及時進行植株早期檢測診斷^［19］。

3.2 實時熒光定量PCR分子檢測技術(shù)可用于檢測多種不同病原菌。陳兆貴等^［20］建立的馬鈴薯卷葉病毒Actin 管家基因?qū)崟r熒光定量PCR 體系在病毒 cDNA 稀釋 100 倍以后仍然可以靈敏的檢測出來；張永江等^［21］基于馬鈴薯病毒外殼蛋白基因的保守核苷酸序列設計了用于病毒檢測的引物，可檢測 36 pg/μL的總RNA。研究建立了3種馬鈴薯病毒病的實時熒光定量檢測體系對PVY、PVS、PLRV 3種病毒實現(xiàn)靈敏、精準、特異且快速的檢測。

4 結(jié) 論

引入實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)對3種馬鈴薯病毒病進行實時PCR擴增，均具有基線平坦、斜率大、重復性好、靈敏度高等優(yōu)點。該檢測體系可以在分子水平上檢測出馬鈴薯植株中存在的3種病毒（PVY、PVS、PLRV）。該檢測體系對于馬鈴薯病毒含量可以迅速且準確的檢測，應用該體系還可以定量分析病毒基因表達。馬鈴薯病毒病早期監(jiān)測可以充分利用該檢測體系。

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Research on real-time fluorescence quantitative PCR detection of potato virus disease

YANG Ruwei， LIU Yi， Gulimila Rehemutula，SUN Hui，JIANG Yinghong

（Comprehensive Experimental Farm，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830012，China）

Abstract：【Objective】 Potato virus disease is one of the major diseases affecting the degradation of varieties and the decline of yields， and it is necessary to characterize the major virus pathogens of potato in the production process， so as to provide a scientific basis for the scientific prevention and control of potato virus diseases. 【Methods】 The primers for potato virus Y （PVY）， potato virus S （PVS） and potato leaf roll virus （PLRV） were designed according to the sequences registered in the GenBank database， and the primer concentration and system optimization were completed. 【Results】 A real-time fluorescent quantitative RT-PCR （RT-qPCR） system was established for the detection of three potato virus diseases， and the standard curve showed a good linear relationship between the cycling threshold and the template concentration， with a correlation coefficient of 99.42%， and an amplification efficiency of 84.48%. The amplification efficiencies were all 84.48%， which could rapidly and accurately detect the three potato viruses. 【Conclusion】 Real-time fluorescence quantitative PCR is a highly sensitive and specific detection method， which can be used to monitor the infection of virus diseases in potato production in real time.

Key words：potato; virus disease; real-time fluorescence quantitative PCR

Fund projects：Key Ramp;D Projects in the Autonomous Region \" Potato Germplasm Resource Innovation and Breeding Technology Of detoxified Seed Potato Research and Application In Xinjiang\"（2022B02044-1）

Correspondence author： LIU Yi （1983-）， male， from Baoding，Hebei， researcher， research direction： Crop cultivation and Breeding， （E-mail）414002880@qq.com