Associations of cheese intake with osteoarthritis：a Mendelian randomization study

Abstract" Objective：Using Mendelian randomization method，explore the causal relationship between cheese intake and the risk of osteoarthritis.Methods：Data from gene-wide association studies were used for analysis.The exposure factor was cheese intake，and the outcome variable was osteoarthritis.Mendelian randomization（MR） analysis was performed by IVW method，MR-Egger method and weighted median，and pleiotropy test，heterogeneity test and sensitivity analysis were performed.Results：The results of IVW and weighted median showed that cheese intake was a protective factor for osteoarthritis，and there was a negative causal association between them（Plt;0.05）.The MR-Egger regression showed no statistically significant association between cheese intake and osteoarthritis（P=0.335）.The results were tested for no heterogeneity or pleiotropy，and sensitivity analyses did not identify SNPs that significantly changed the overall causal relationship.Conclusion：Cheese intake is causally related to osteoarthritis.

Keywords" cheese intake； osteoarthritis； Mendelian randomization

摘要" 目的：采用孟德爾隨機(jī)化的方法，探討奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性。方法：采用全基因組關(guān)聯(lián)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，暴露因素為奶酪攝入量，結(jié)局變量為骨關(guān)節(jié)炎。采用逆方差加權(quán)法（IVW）法、加權(quán)中位數(shù)法、MR?Egger法進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化分析，并進(jìn)行多效性分析、異質(zhì)性檢驗(yàn)、敏感性分析。結(jié)果：IVW法和加權(quán)中位數(shù)法結(jié)果顯示，奶酪攝入量為骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的保護(hù)因素，二者之間存在負(fù)向因果關(guān)聯(lián)（Plt;0.05）。MR?Egger回歸結(jié)果顯示，奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.335）。研究結(jié)果經(jīng)檢驗(yàn)不存在異質(zhì)性和多效性，敏感性分析未發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致總體因果關(guān)系發(fā)生顯著變化的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。結(jié)論：奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生風(fēng)險存在因果關(guān)系。

關(guān)鍵詞" 奶酪攝入量；骨關(guān)節(jié)炎；孟德爾隨機(jī)化

doi：10.12102/j.issn.1009-6493.2024.19.006

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)炎癥、疼痛、軟骨退化為主要病變的慢性退化性關(guān)節(jié)疾病[1]，是全球?qū)е鹿顷P(guān)節(jié)疼痛、殘疾的主要原因之一[2]。隨著骨關(guān)節(jié)炎的慢性、長期發(fā)展，病人出現(xiàn)的關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、腫脹等癥狀，可能會影響病人的身體和心理健康，為病人帶來高額的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]，降低其生活質(zhì)量[4]。既往研究表明，奶酪作為一種發(fā)酵的全脂乳制品，其攝入量與2型糖尿病[5]、缺血性心臟病[6]、高血壓[7]等發(fā)病呈負(fù)相關(guān)。同樣，Denissen等[8]納入3 451名荷蘭人的觀察性研究發(fā)現(xiàn)，奶酪攝入量的增加與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，但由于該研究為觀察性研究，樣本量較小，且可能存在選擇偏倚，需要慎重解釋結(jié)果。與此相反，一項納入2 481名美國人群的前瞻性研究結(jié)果顯示，高奶酪攝入的女性可能會增加骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[9]，這些結(jié)果的差異可能是由于其他乳制品攝入或飲食結(jié)構(gòu)不同帶來的影響。同時，既往研究缺乏涉及奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎的隨機(jī)對照試驗(yàn)研究，二者的關(guān)聯(lián)性仍存在一定的質(zhì)疑與爭議。孟德爾隨機(jī)化研究是流行病學(xué)中廣泛用于評估暴露因素與臨床疾病之間潛在因果關(guān)系的重要方法，其以遺傳變異為工具[10]，以大樣本的全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome?wide association study，GWAS）中的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（single nucleotide polymorphism，SNP）為基礎(chǔ)[11]，由于等位基因隨機(jī)分配到個體中是在疾病發(fā)生之前，可使混雜因素的影響達(dá)到最小化[12]，減少因果估計值的偏倚。因此，本研究通過孟德爾隨機(jī)化的方法，探討奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生風(fēng)險的潛在關(guān)聯(lián)性，以期為奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎之間發(fā)生、發(fā)展的關(guān)聯(lián)性提供理論依據(jù)。

1" 資料與方法

1.1 研究設(shè)計

本研究以GWAS中的SNP為基礎(chǔ)，采用雙樣本孟德爾隨機(jī)化分析方法，評估奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎之間的關(guān)聯(lián)性和因果關(guān)系，并采用敏感性分析對結(jié)果的可靠性進(jìn)行了檢驗(yàn)。本研究中孟德爾隨機(jī)化結(jié)果的有效性涉及3個關(guān)鍵假設(shè)：1）SNP與奶酪攝入量密切相關(guān)；2）SNP與已知的“暴露?結(jié)局”關(guān)聯(lián)的混雜因素不相關(guān)；3）SNP僅通過奶酪攝入量影響骨關(guān)節(jié)炎，不與骨關(guān)節(jié)炎直接相關(guān)。具體流程見圖1。

1.2 資料來源

本研究中的暴露因素為奶酪攝入量，通過公開數(shù)據(jù)庫獲得數(shù)據(jù)，其數(shù)據(jù)來源于英國生物銀行（UKBB），該數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計的樣本量已超過50萬人。本研究通過MR?Base平臺獲取了英國生物樣本庫中關(guān)于奶酪攝入量（ID：UKB?B?1 489）的數(shù)據(jù)，研究對象包括451 486例歐洲人群，SNP數(shù)量為9 851 867個。此外，骨關(guān)節(jié)炎（ID：ebi?a?GCST005811）的數(shù)據(jù)來自IEU OpenGWAS project數(shù)據(jù)庫，研究對象包括63 556例歐洲人群病例和50 898例對照，SNP數(shù)量為15 870 475個。本研究所涉及的數(shù)據(jù)均來源于公共數(shù)據(jù)庫，因此不涉及倫理審查問題。

1.3 工具變量

首先，考慮到孟德爾隨機(jī)化的第1個關(guān)鍵假設(shè)，即SNP必須與奶酪攝入量密切相關(guān)，在全基因組水平上篩選了與骨關(guān)節(jié)炎顯著相關(guān)的SNP（Plt;5×10-8，R2lt;0.001，window=10 000 kb）。其次，為了滿足孟德爾隨機(jī)化第2個關(guān)鍵假設(shè)，即SNP與已知的“暴露?結(jié)局”關(guān)聯(lián)的混雜因素不相關(guān)，選擇在Phenoscanner數(shù)據(jù)庫中查詢，以確保篩選后的SNP與已知的混雜因素不相關(guān)。最后，采用異質(zhì)性檢驗(yàn)剔除具有顯著異質(zhì)性的SNP，得到與骨關(guān)節(jié)炎顯著相關(guān)的SNP作為本研究的工具變量。同時，為了判斷選擇的工具變量是否存在弱工具變量偏倚，需要進(jìn)行F統(tǒng)計量的計算評估，計算公式[12]為F=R2（N-2）/（1-R2），N為暴露因素GWAS的樣本量，R2為工具變量解釋暴露因素變異的程度，其詳細(xì)計算公式如下，R2=[2×EAF×（1-EAF）×beta2]/[2×EAF×（1-EAF）×beta2+2×EAF×（1-EAF）×N×SE（beta）2]，EAF為效應(yīng)等位基因頻率，beta為SNP對骨關(guān)節(jié)炎的效應(yīng)值，SE（beta）為遺傳效應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)誤差，若Fgt;10則說明存在弱工具變量偏倚的可能性較小[13]。

1.4 孟德爾隨機(jī)化分析

采用逆方差加權(quán)法（inverse variance weighted，IVW）、加權(quán)中位數(shù)法（weighted median）、MR?Egger回歸法（MR?Egger regression）進(jìn)行雙樣本的孟德爾隨機(jī)化研究分析。如果所有的遺傳變異都滿足工具變量假設(shè)，此時IVW法是因果效應(yīng)的適當(dāng)估計，可用作主要分析結(jié)果[14]。但是IVW法存在一定多效性偏倚的影響，因此，需要進(jìn)行敏感性檢驗(yàn)來判斷結(jié)果的有效性。使用加權(quán)中位數(shù)法分析時，當(dāng)工具變量對遺傳變異貢獻(xiàn)權(quán)重超過50%時，分析具有可信性[15]。當(dāng)工具變量與結(jié)局的直接效應(yīng)獨(dú)立于工具變量與暴露因素的關(guān)聯(lián)效應(yīng)（instrument strength independent of direct effect，InSIDE）的假設(shè)滿足時，MR?Egger法可作為強(qiáng)效的評價工具，產(chǎn)生的非零截距可以用于評價多效性[16]。對于3種孟德爾隨機(jī)化的統(tǒng)計值，本研究選取IVW法為主要結(jié)果。

1.5 敏感性分析

采用Cochran Q檢驗(yàn)、MR?Egger法、留一法（leave?one?out）檢驗(yàn)工具變量間是否存在異質(zhì)性，評估結(jié)果的敏感性。Cochran Q檢驗(yàn)可用于判斷所選工具變量間是否存在異質(zhì)性。MR?Egger法參考截距項，作為是否存在水平多效性的依據(jù)，當(dāng)截距接近零時，所得結(jié)果和IVW法相似；若截距項與零間隔較大，則表明工具變量間有存在水平多效性的可能[17]。留一法指逐一剔除單個SNP并計算剩余SNP的合并效應(yīng)，用于判斷結(jié)局是否受到單個SNP不成比例的影響[18]。

2" 結(jié)果

2.1 工具變量的篩選及弱工具變量偏倚的判斷

最終篩選出62個與奶酪攝入量有關(guān)的SNP作為工具變量，所選SNP互相獨(dú)立且顯著相關(guān)（R2lt;0.001，Plt;5×10-8）。同時，經(jīng)計算所選SNP的F值均gt;10，表明不存在弱工具變量偏倚，結(jié)果較可靠。

2.2 雙樣本孟德爾隨機(jī)化分析結(jié)果

通過雙樣本孟德爾隨機(jī)化得出所選SNP對骨關(guān)節(jié)炎的影響，IVW法結(jié)果顯示，奶酪攝入量為骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的保護(hù)因素，二者之間存在負(fù)向因果關(guān)聯(lián)，奶酪攝入量的增加可減少骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病風(fēng)險（β=-0.560，SE=0.146，Plt;0.001）。加權(quán)中位數(shù)法結(jié)果與之相似（β=-0.468，SE=0.191，P=0.014）。MR?Egger回歸結(jié)果顯示，奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計學(xué)意義（β=-0.594，SE=0.611，P=0.335）。詳見圖2。各種孟德爾隨機(jī)化分析方法得到的因果效應(yīng)方向見圖3。

2.3 敏感性分析

2.3.1 水平多效性檢驗(yàn)

使用MR?Egger法的截距項進(jìn)行評估，P=0.955，表明工具變量之間不存在水平多效性，所選工具變量是可靠的。

2.3.2 異質(zhì)性檢驗(yàn)

Cochran Q檢驗(yàn)結(jié)果顯示，P=0.061，表明所選工具變量間不存在異質(zhì)性。同時，所選的SNP的漏斗圖顯示，該研究的因果效應(yīng)分布是基本對稱的，不存在偏倚，見圖4。

2.3.3 留一法敏感性分析

使用留一法敏感性分析法對結(jié)果進(jìn)行分析，逐個剔除所選SNP并觀察對總體因果關(guān)系的影響，結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致總體因果關(guān)系發(fā)生顯著變化的SNP位點(diǎn)，見圖5。

3" 討論

本研究采用了雙樣本孟德爾隨機(jī)化研究，對奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生風(fēng)險之間的因果關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)、全面的評估，結(jié)果顯示，在歐洲人群中，奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生風(fēng)險之間呈負(fù)相關(guān)，奶酪攝入是骨關(guān)節(jié)炎的保護(hù)因素。

本研究與既往觀察性研究的結(jié)果是一致的，即奶酪攝入的增加能降低膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生風(fēng)險。例如，Denissen等[8]納入3 010名40～75歲的歐洲群體，探討乳制品消費(fèi)與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，結(jié)果顯示二者之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。然而，Ka?ar等[19]納入655名土耳其人進(jìn)行橫斷面研究，結(jié)果表明，牛奶可降低骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率，但奶酪攝入與骨關(guān)節(jié)炎間未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)，這可能與研究對象與歐洲人群奶酪攝入量及種類具有一定的差異，且研究并未糾正潛在的重要混雜因素有關(guān)。綜上所述，奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎存在某種關(guān)聯(lián)。本研究通過孟德爾隨機(jī)化方法證明增加奶酪攝入可降低骨關(guān)節(jié)炎風(fēng)險。既往研究表明，奶酪中的益生菌能降低炎癥、提高免疫力等[20]。同時，奶酪中含有豐富蛋白質(zhì)，包括酪蛋白和乳鐵蛋白等[21]，這些蛋白質(zhì)對減輕炎癥具有正向作用[22]。因此，奶酪對骨關(guān)節(jié)炎的影響不僅僅是單一成分的作用，而是多種有益成分的共同作用。孟德爾隨機(jī)化具有獨(dú)有的特征，包括顯著的因果相關(guān)性、混雜因素的干預(yù)少、能直接觀察暴露因素、不具有反向因果關(guān)系、研究設(shè)計更接近于隨機(jī)分配等[23]，使本研究結(jié)果免于混雜因素或其他偏倚的影響，代表奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎之間具有關(guān)聯(lián)性。同時，本研究采用3種統(tǒng)計方法進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化分析，2種方法的結(jié)果趨于一致，因此推斷結(jié)果較穩(wěn)定。同時，本研究也存在一定的局限性。首先，盡管本研究經(jīng)多效性檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)多效性效應(yīng)的證據(jù)，同樣在敏感性分析中顯示有類似的結(jié)果，但在孟德爾隨機(jī)化研究中，很難完全排除潛在多效性影響；其次，本研究涉及的遺傳數(shù)據(jù)僅包括歐洲人群，這可能影響研究結(jié)果向其他種族、國家人群的推廣，畢竟奶酪的成分中含有乳糖，亞洲東部人群對乳糖的代謝能力與歐洲人群間存在一定的差異[24]；最后，本研究的數(shù)據(jù)僅關(guān)注了奶酪攝入量，未注意其他飲食的攝入，也不清楚攝入奶酪的類型及持續(xù)時間，使研究具有一定的局限性。

4" 小結(jié)

綜上所述，本研究采用雙樣本孟德爾隨機(jī)化方法分析發(fā)現(xiàn)，奶酪攝入量與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生風(fēng)險之間存在因果負(fù)相關(guān)。奶酪的攝入可能會為未來骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和管理開辟新的途徑。

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