摘" 要： 母牛繁殖性能是養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，褪黑素作為一種多功能激素，具有結(jié)合MT1和MT2受體，降低促炎細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）和升高抗炎細(xì)胞因子（IL-10、IL-1Ra）的水平，促進(jìn)抗氧化酶基因（Sod、Cat、Gpx、Gpx4）的表達(dá)，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和線粒體自噬相關(guān)基因的水平，改變瘤胃和陰道微生物組成等多種作用，從而調(diào)控母牛卵泡細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、胚胎發(fā)育以及發(fā)情、排卵、妊娠等繁殖性能。因此，本文綜述了外源褪黑素在體內(nèi)（外）調(diào)控母牛生殖的應(yīng)用現(xiàn)狀及其作用機(jī)制，為合理應(yīng)用褪黑素提高母牛繁殖性能提供理論參考。

關(guān)鍵詞： 褪黑素；牛；繁殖性能；機(jī)制

中圖分類號(hào)：S823.3

"文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）12-5379-12

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.005

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

收稿日期：2024-05-31

基金項(xiàng)目：中國(guó)博士后面上科學(xué)基金 （2020M672233）；河南省農(nóng)業(yè)良種聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目（2022020104）

作者簡(jiǎn)介：劉彩鳳（2003-），女，河南上蔡人，本科生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：liucf2916389782@qq.com

*通信作者：劉深賀，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： liush2016@qq.com；姬普雨，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：jipuyu0576@163.com

Research Progress on Regulation of Reproductive Performance by Exogenous Melatonin in Cows

LIU" Caifeng1， WANG" Jingzhuo1， WANG" Xi1， LIU" Zirui1， JI" Puyu2*， LIU" Shenhe1*

（1.College of Animal Science and Technology， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China;

2.Shangqiu Rural Industry Development Center， Shangqiu 476000， China）

Abstract： The reproductive performance of cows is the basis for the development of cattle industry. As a multifunctional hormone， melatonin interacts with MT1 and MT2 receptors， reduces the levels of pro-inflammatory cytokines （IL-1β， TNF-α， IL-6）， enhances the levels of anti-inflammatory cytokines （IL-10， IL-1Ra）， and promotes the expression of antioxidant enzyme genes （Sod， Cat， Gpx， Gpx4）. Additionally， it modulates autophagy and mitochondrial autophagy-related genes expression， alters the composition of rumen and vaginal microbiota， thereby influencing reproductive performance in bovine follicular cells， granulosa cells as well as embryonic development alongside estrus cycles， ovulation processes， and pregnancy outcomes. Consequently， this article reviews the current status and mechanisms underlying exogenous melatonin's role in regulating cow reproduction both in vivo and in vitro while providing a theoretical framework for its rational application to enhance reproductive efficiency in cattle.

Key words： melatonin; cattle; reproductive performance; mechanism

*Corresponding authors： LIU Shenhe，E-mail： liush2016@qq.com; JI Puyu， E-mail：jipuyu0576@163.com

母牛的繁殖性能是影響?zhàn)B牛業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵因素。繁殖性能主要受環(huán)境、管理和遺傳因素的相互作用影響。此外，與發(fā)情、排卵、妊娠等相關(guān)的疾病也會(huì)造成母牛繁殖效率降低、預(yù)期生產(chǎn)壽命縮短和產(chǎn)奶量下降［1，2］。因此，維持或提高母牛的繁殖效率，預(yù)防繁殖疾病的發(fā)生十分必要。褪黑素是一種多功能細(xì)胞保護(hù)分子，具有清除活性氧（reactive oxygen species， ROS）、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、抗炎等多種作用，其不僅在松果體中分泌，也在胃腸道、腎臟、性腺、胎盤和子宮等器官和組織中產(chǎn)生［3-5］ 。因此，褪黑素既可以在體內(nèi)調(diào)控母牛發(fā)情、排卵、妊娠等繁殖性能，也可在體外調(diào)控母牛生殖細(xì)胞功能，以及預(yù)防和緩解繁殖疾病。本文綜述了外源褪黑素在體（內(nèi)）外調(diào)控母牛繁殖性能的應(yīng)用效果及其通過(guò)MT1和MT2受體通路、抗炎、抗氧化等5個(gè)方面調(diào)控母牛繁殖性能的作用機(jī)制，以期為合理應(yīng)用褪黑素提高母牛繁殖性能提供新的思路與見解。

1" 外源褪黑素在母牛生殖中的應(yīng)用效果

1.1" 外源褪黑素在體內(nèi)調(diào)控母牛繁殖

褪黑素具有高脂溶性和弱水溶性，可以通過(guò)包括血腦屏障在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞膜［6］。因此，外源褪黑素可以自由通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入母牛體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)，影響其繁殖狀態(tài)［7］。大量研究證明，皮下埋植、注射或口服褪黑素能夠影響母牛發(fā)情、排卵、妊娠等繁殖性能（表1）。

例如，Brockus等［8］在妊娠第190～262天的荷斯坦小母牛日糧中補(bǔ)充20 mg褪黑素能夠使母牛子宮動(dòng)脈血流量增加25%，血清總抗氧化能力提高43%，但妊娠期長(zhǎng)度和犢牛出生體重保持不變。趙增元等［9］證實(shí)，皮下埋植160 mg褪黑素能夠提高荷斯坦奶牛超數(shù)排卵效果，主要表現(xiàn)在可用胚胎數(shù)、胚胎質(zhì)量和胚胎移植妊娠率的提升。Ratchamak等［10］對(duì)熱應(yīng)激下進(jìn)行超數(shù)排卵處理的泰國(guó)-荷斯坦雜交奶牛肌肉注射18 mg/50 kg體重的褪黑素，可以增加其大卵泡和黃體數(shù)量，恢復(fù)熱應(yīng)激導(dǎo)致的卵子/胚胎、受精卵和可移植胚胎的數(shù)量下降。因此，通過(guò)不同方式補(bǔ)充外源褪黑素可以提高奶牛的繁殖性能，并可恢復(fù)熱應(yīng)激造成的繁殖損失。水牛季節(jié)性發(fā)情較強(qiáng)，外源添加褪黑素也能夠緩解該現(xiàn)象。例如，Ghuman等［11］研究表明，在不發(fā)情摩拉水牛皮下埋植18 mg/50 kg體重的褪黑素，能夠顯著提高其總?cè)焉锫省ⅫS體活性、優(yōu)勢(shì)卵泡直徑和血漿黃體酮（P4）水平。同樣，Ghuman等［12］對(duì)夏季不發(fā)情的小母水牛體內(nèi)也植入相同劑量的褪黑素，可以成功地實(shí)現(xiàn)排卵大小的非排卵期卵泡排卵，啟動(dòng)卵巢周期。Lochan等［13］指出，在產(chǎn)后早期水牛皮下埋植18 mg/50 kg體重的褪黑素，可以有效降低產(chǎn)后水牛氧化應(yīng)激，使卵巢活動(dòng)提前恢復(fù)，提高產(chǎn)后水牛的發(fā)情表現(xiàn)和排卵率。

褪黑素對(duì)肉牛繁殖性能的影響卻不盡相同。McCarty等［14］在肉牛的妊娠中期至晚期每30 d植入48 mg褪黑素，能夠增加妊娠中晚期肉牛的子宮動(dòng)脈血流量，但對(duì)犢牛出生體重?zé)o顯著影響。Guo等［15］通過(guò)對(duì)雜交肉牛間隔14 d兩次皮下注射0.24 mg·kg-1體重的褪黑素，能夠增加血清抗氧化酶活性，提高肉牛受孕率，但對(duì)P4濃度無(wú)顯著影響。Reid等［16］對(duì)妊娠第190天至分娩后60天的安格斯牛每30 d補(bǔ)充48 mg褪黑素，可以提高血漿褪黑素水平，但乳脂率和總產(chǎn)奶量趨于下降，對(duì)犢牛出生體重也無(wú)顯著影響。Swanson等［17］在妊娠第160～240天的肉牛日糧中每天補(bǔ)充20 mg褪黑素，發(fā)現(xiàn)其乳脂率和產(chǎn)奶量有降低趨勢(shì)，出生犢牛體重?zé)o明顯差異。褪黑素可以增加子宮動(dòng)脈血流量和抗氧化酶的活性，提高肉牛的受孕率，但卻會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)奶量和乳脂率呈下降趨勢(shì)。已知褪黑素對(duì)白色脂肪組織和脂肪源性干細(xì)胞具有脂溶特性，這可能是導(dǎo)致母牛產(chǎn)奶量和乳脂率下降的原因之一［18，19］。

綜上，外源褪黑素可以調(diào)控母牛繁殖性能，但褪黑素在不同品種（屬）母牛的最適添加劑量、添加方式和添加階段等仍有待進(jìn)一步明確。

1.2" 褪黑素調(diào)控體外母牛生殖細(xì)胞

1.2.1" 褪黑素調(diào)控體外母牛卵母細(xì)胞的發(fā)育

卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）是體外胚胎生產(chǎn)（IVEP）過(guò)程中的關(guān)鍵階段，此階段的卵母細(xì)胞獲得了持續(xù)維持胚胎發(fā)育的潛能［20］。卵母細(xì)胞質(zhì)量影響早期胚胎存活、妊娠建立和維持胎兒發(fā)育［21］。因此，通過(guò)優(yōu)化卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)條件能夠提高其體外發(fā)育的能力。大量研究表明，在卵母細(xì)胞培養(yǎng)基中添加褪黑素能夠促進(jìn)體外卵母細(xì)胞發(fā)育（表2）。例如，Zhao等［22］在牛卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)基中添加不同濃度（10-7、10-9、10-11" mol·L-1）褪黑素，發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠改善細(xì)胞器的正態(tài)分布，增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水平，增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化基因的表達(dá)，從而顯著促進(jìn)牛卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)成熟，其中以10-9 mol·L-1效果最顯著。Pang等［23］也證明，10-9 mol·L-1褪黑素促進(jìn)牛卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核成熟的效果最佳，表現(xiàn)為第一極體擠壓、皮質(zhì)顆粒和線粒體正態(tài)分布以及線粒體膜電位升高。Cavalcante等［24］在牛卵巢皮質(zhì)組織體外培養(yǎng)過(guò)程中，添加10-9 mol·L-1和2×10-9 mol·L-1褪黑素可促進(jìn)牛原始卵泡激活，并維持基質(zhì)細(xì)胞密度。El-Raey等［25］在牛卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)基中分別添加10和50 ng·mL-1褪黑素，均能夠顯著促進(jìn)牛卵母細(xì)胞核成熟，積云細(xì)胞擴(kuò)張和改變線粒體分布模式。以上研究表明，外源褪黑素可以促進(jìn)牛卵母細(xì)胞成熟，主要表現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的成熟。此外，已知不適合牛胚胎發(fā)育的劣質(zhì)卵母細(xì)胞約占收集到的未成熟卵母細(xì)胞的三分之一以上，Yang等［26］用10-9 mol·L-1褪黑素培養(yǎng)牛劣質(zhì)卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)褪黑素可以上調(diào)卵母細(xì)胞成熟相關(guān)基因生長(zhǎng)分化因子-9（GDF-9）、骨形態(tài)生成蛋白-15（BMP-15）、ATP合酶Fo亞基6（ATPase6）和ATP合酶Fo亞基8（ATPase8）的mRNA表達(dá)，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，提高劣質(zhì)卵母細(xì)胞的質(zhì)量。該研究結(jié)果為應(yīng)用褪黑素提高牛卵母細(xì)胞的合格率提供了方向，但培養(yǎng)后牛卵母細(xì)胞的質(zhì)量是否達(dá)到體外胚胎生產(chǎn)的水平仍有待進(jìn)一步研究。

過(guò)量添加褪黑素也會(huì)抑制牛卵母細(xì)胞的成熟。例如，Tian等［27］研究發(fā)現(xiàn)在牛卵母細(xì)胞培養(yǎng)基中添加10-9 mol·L-1褪黑素可使牛卵母細(xì)胞卵裂率、囊胚率、平均細(xì)胞數(shù)/囊胚達(dá)到最大值，隨著褪黑素濃度從10-9 mol·L-1增加到10-3 mol·L-1，卵裂率和囊胚率均顯著下降，說(shuō)明高濃度褪黑素可能會(huì)延遲卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟，從而影響胚胎發(fā)育，這與高超等［28］在牛卵母細(xì)胞上的研究結(jié)果相一致。另外，褪黑素也可以促進(jìn)豬［29］、綿羊［30］、小鼠［31］等其他物種的體外卵母細(xì)胞成熟，表明褪黑素對(duì)卵母細(xì)胞IVM的促進(jìn)作用不具有物種特異性，為褪黑素應(yīng)用于一些稀有物種卵母細(xì)胞的IVM提供了理論基礎(chǔ)。

1.2.2" 褪黑素調(diào)控體外母牛顆粒細(xì)胞的發(fā)育

顆粒細(xì)胞是卵泡中的主要功能細(xì)胞，以自分泌和旁分泌的方式影響卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟［32］。顆粒細(xì)胞的不同狀態(tài)，包括凋亡、氧化應(yīng)激、自噬或細(xì)胞周期阻滯，都可能引發(fā)卵泡閉鎖。此外，類固醇激素合成的變化也會(huì)影響顆粒細(xì)胞狀態(tài)［3］。大量研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素對(duì)不同狀態(tài)下母牛顆粒細(xì)胞的發(fā)育具有調(diào)控作用（表3）。例如，Wang等［33］將牛顆粒細(xì)胞暴露于不同濃度（400、800、1 200、1 600、2 000 pg·mL-1）褪黑素中24、48或72 h，發(fā)現(xiàn)不同濃度褪黑素對(duì)細(xì)胞早期凋亡率影響不大，但隨著培養(yǎng)時(shí)間變長(zhǎng)，細(xì)胞的凋亡率降低，表明外源褪黑素以一種時(shí)間依賴性的方式調(diào)節(jié)牛顆粒細(xì)胞的凋亡。Wang等［34］在牛顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基中添加1 200 pg·mL-1褪黑素，發(fā)現(xiàn)褪黑素可以通過(guò)上調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2 （Bcl-2）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-xl（BCL-XL）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）和超氧化物歧化酶1（Sod1）基因的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、胱天蛋白酶3（CASP3）和腫瘤蛋白P53（TP53）基因的表達(dá)來(lái)抑制顆粒細(xì)胞凋亡。Riaz等［35］用10-9 mol·L-1和10-7 mol·L-1的褪黑素培養(yǎng)水牛顆粒細(xì)胞24 h，可以提高顆粒細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中G2期的細(xì)胞數(shù)量，這與細(xì)胞周期抑制劑蛋白p21、p27水平的顯著下降相一致。Wang等［33］添加1 200 pg·mL-1褪黑素培養(yǎng)奶牛顆粒細(xì)胞，可以呈時(shí)間依賴性刺激P4的產(chǎn)生，抑制雌二醇的生物合成，其中72 h時(shí)P4濃度最高，雌二醇濃度最低。Xu等［32］使用10-8 mol·L-1褪黑素預(yù)處理氧化應(yīng)激下的牛卵巢顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)褪黑素可以通過(guò)沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）/肝臟叉頭框蛋白O1（FoxO1）信號(hào)通路促進(jìn)線粒體自噬，減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡和線粒體損傷。楊方曉等［36］證實(shí)，使用10-4 mol·L-1褪黑素預(yù)處理奶牛卵巢顆粒細(xì)胞，能夠顯著降低HT-2毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）的水平，減輕顆粒細(xì)胞的自噬作用。以上研究表明，適量褪黑素對(duì)正常狀態(tài)和應(yīng)激狀態(tài)下體外培養(yǎng)的母牛顆粒細(xì)胞發(fā)育都有積極的促進(jìn)作用。

1.2.3" 外源褪黑素調(diào)控母牛體外胚胎發(fā)育

IVP作為一種世界范圍內(nèi)使用的輔助生殖技術(shù)，是畜牧業(yè)中較多生殖問(wèn)題的替代方案［37］。褪黑素能夠顯著促進(jìn)牛體外胚胎的發(fā)育，提高體外胚胎質(zhì)量（表4）。例如，Manjunatha等［38］在水牛卵母細(xì)胞培養(yǎng)基中添加10-5 mol·L-1和5×10-5 mol·L-1的褪黑素，發(fā)現(xiàn)褪黑素可以提高細(xì)胞減數(shù)分裂成熟率（分別為90.3%和88.8%）和可移植胚胎（TE）產(chǎn)量（分別為28.4%和27.2%）。Sampaio等［39］研究表明，在牛卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)基中添加10-12 mol·L-1的褪黑素可提高IVM質(zhì)量以及受精后胚胎卵裂率和囊胚率。Gutirrez-Aez等［40］在奶牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物培養(yǎng)基中添加10-11 mol·L-1的褪黑素，可以提高體外受精后胚胎囊胚的百分比、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)（ICM）、胚胎總細(xì)胞數(shù)。Wang等［41］將10-7 mol·L-1褪黑素添加到牛受精卵的體外培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)牛胚胎的卵裂率、8細(xì)胞胚產(chǎn)量和培養(yǎng)后第7天的囊胚數(shù)量顯著升高。

然而，當(dāng)褪黑素濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，則對(duì)牛胚胎發(fā)育無(wú)促進(jìn)作用。Wang等［42］用不同濃度（10-3、10-5、10-7、10-9、10-11 mol·L-1）褪黑素培養(yǎng)牛胚胎，發(fā)現(xiàn)10-3 mol·L-1組牛胚胎的囊胚率、孵化囊胚率和平均細(xì)胞數(shù)/囊胚數(shù)與不含褪黑素的效果相當(dāng)。Tsantarliotou等［43］在牛卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物成熟培養(yǎng)基中添加不同濃度（10-5、10-4、10-3 mol·L-1）的褪黑素，與不添加褪黑素（71.0%和41.3%）相比，添加褪黑素對(duì)牛胚胎的卵裂率（72.8%、72.5%、72.7%）和囊胚率（33.8%、39.4%、38.3%）無(wú)顯著影響。以上研究表明，在牛IVEP過(guò)程中添加適量的褪黑素可以有效促進(jìn)胚胎的發(fā)育以及提高體外胚胎的數(shù)量和質(zhì)量，但若添加的濃度過(guò)低或過(guò)高，都不會(huì)發(fā)揮有益作用。

2" 褪黑素調(diào)控母牛生殖的作用機(jī)理（圖1）

2.1" MT1和MT2受體通路

褪黑素主要通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)受體（MT1和MT2）結(jié)合在母牛生殖中發(fā)揮有益作用［44］。Tian等［27］使用褪黑素受體激動(dòng)劑IIK7和拮抗劑luzindole研究褪黑素對(duì)牛卵母細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)褪黑素通過(guò)受體MT1和MT2介導(dǎo)牛卵母細(xì)胞IVM。同樣，在牛次級(jí)卵泡的發(fā)育過(guò)程中，Paulino等［45］也證實(shí)了相同的觀點(diǎn)，即褪黑素通過(guò)MT1和MT2受體促進(jìn)牛次級(jí)卵泡生長(zhǎng)，而luzindole阻斷了褪黑素對(duì)卵泡生長(zhǎng)的作用。Silva等［46］發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以通過(guò)MT1和MT2受體調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/ 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，增加牛卵巢組織細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中的膠原纖維，促進(jìn)ECM中的原始卵泡活化?？梢姡屎谒啬軌蚪Y(jié)合MT1和MT2受體調(diào)控母牛生殖細(xì)胞功能。

MT1受體在母牛繁殖性能調(diào)控中占據(jù)主導(dǎo)作用。在牛卵巢中，El-Raey等［25］證實(shí)在牛卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中，MT1基因在卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物中表達(dá)，而MT2基因僅在卵母細(xì)胞中表達(dá)。Liu等［47］研究證明，敲低牛顆粒細(xì)胞中MT2水平并不會(huì)破壞褪黑素抑制顆粒細(xì)胞凋亡或阻斷細(xì)胞周期的作用，即MT2敲低后，MT1的表達(dá)上調(diào)，而褪黑素在MT2敲低或不敲低的情況下均促進(jìn)了MT1的表達(dá)。Wang等［34］研究發(fā)現(xiàn)，MT1可能通過(guò)下調(diào)促凋亡基因TP53、Bax和CASP3的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)來(lái)抑制牛顆粒細(xì)胞的凋亡。在牛胚胎中，Wang等［42］發(fā)現(xiàn)作為非選擇性MT1和MT2拮抗劑的luzindole阻斷了褪黑素誘導(dǎo)的胚胎發(fā)育，而選擇性MT2拮抗劑4-D-PDOT對(duì)褪黑素誘導(dǎo)的胚胎發(fā)育影響很小，說(shuō)明褪黑素對(duì)牛胚胎發(fā)育的有益作用是通過(guò)MT1介導(dǎo)的。在牛泌乳中，Liu等［48］研究發(fā)現(xiàn)褪黑素通過(guò)受體MT1減少牛奶中乳糖含量，即激活MT1下調(diào)了催乳素受體基因（PRLR）的mRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制了半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 （SLC35B1）的基因表達(dá)。以上研究表明，褪黑素主要通過(guò)結(jié)合MT1受體調(diào)控母牛生殖，但褪黑素通過(guò) MT1受體調(diào)控牛卵巢和胚胎發(fā)育的具體機(jī)制需要更深入地研究。

2.2" 抗炎作用

褪黑素可以下調(diào)生殖細(xì)胞中抗炎因子的表達(dá)，調(diào)控母牛的生殖。褪黑素通過(guò)在不同的病理或生理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)促炎和抗炎細(xì)胞因子發(fā)揮其抗炎作用，緩解母牛的生殖炎癥［49］。Gao等［50］證實(shí)，褪黑素可以顯著降低牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（BEND）中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的mRNA表達(dá)和釋放，抑制LPS誘導(dǎo)的BEND細(xì)胞中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白（NLRP）3炎癥小體的激活，在牛子宮內(nèi)膜炎中發(fā)揮保護(hù)作用。Yao等［51］通過(guò)荷斯坦奶牛瘤胃旁路進(jìn)行褪黑素喂養(yǎng)（RBMF），發(fā)現(xiàn)褪黑素可以顯著降低奶牛血清中促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的水平，升高抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）的水平，增強(qiáng)奶牛自身的抗炎能力。Yu等［52］發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加4.3×10-5 mol·L-1褪黑素培養(yǎng)荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞，可以顯著降低LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）mRNA水平，增加抗炎細(xì)胞因子白介素-1受體拮抗劑（IL-1Ra）mRNA水平，保護(hù)細(xì)胞免受LPS誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激損傷。

此外，褪黑素可以通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子核因子κB （NF-κB）的激活發(fā)揮抗炎作用，減少活性氧（ROS）導(dǎo)致的母牛生殖炎癥［53］。NF-κB的激活會(huì)誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，對(duì)母牛的繁殖性能產(chǎn)生不利影響［54］。NF-κB通過(guò)p50和p65蛋白與抑制亞基I-κB連接，以同源或異源二聚體的形式存在［55］。當(dāng)I-κB存在時(shí)，NF-κB以無(wú)活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，而ROS可以激活NF-κB［56］。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑的刺激，I-κB激酶激活p65的磷酸化，NF-κB被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，進(jìn)而上調(diào)炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1（IL-1）、IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和翻譯，誘發(fā)母牛的炎癥反應(yīng)［55，57，58］。褪黑素可以通過(guò)其抗氧化作用，抑制NF-κB的激活，使炎癥介質(zhì)的表達(dá)減少［54，59］。Zheng等［60］添加2.5×10-6 mol·L-1的褪黑素培養(yǎng)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)褪黑素可以降低氨誘導(dǎo)的Toll樣受體4（TLR-4）、NF-κB和IL-6的蛋白表達(dá)水平，通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路降低IL-6表達(dá)，最終改善奶牛VEGF（子宮接受性相關(guān)基因）表達(dá)和子宮接受性，抑制細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，褪黑素可以抑制促炎因子的表達(dá)，增加抗炎因子的表達(dá)，進(jìn)而緩解母牛的乳腺炎和子宮內(nèi)膜炎。褪黑素具有抗炎作用，但褪黑素調(diào)節(jié)奶牛子宮炎的具體作用機(jī)理還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

2.3" 抗氧化作用

氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致母牛生殖細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物的氧化損傷，給細(xì)胞造成不可逆的傷害［61］。褪黑素可以通過(guò)酶系統(tǒng)清除自由基，直接消除ROS，增加編碼超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶基因表達(dá)，減少母牛的氧化應(yīng)激［62］。例如，Zhao等［22］用10-7 mol·L-1褪黑素培養(yǎng)牛卵母細(xì)胞，可以顯著降低細(xì)胞中的ROS水平，增加內(nèi)源性抗氧化基因Cat、Sod1和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）mRNA的表達(dá)水平，改善牛卵母細(xì)胞發(fā)育質(zhì)量。Silva等［63］在含有10-8 mol·L-1褪黑素的培養(yǎng)基中進(jìn)行牛卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（COCs）IVM，發(fā)現(xiàn)褪黑素提高了成熟COCs中的SOD和CAT mRNA表達(dá)，增加了線粒體活性。Yang等［64］研究證實(shí)，10-4 mol·L-1褪黑素可以顯著增加SOD和CAT蛋白的表達(dá)，減弱β-玉米烯醇介導(dǎo)的牛卵巢顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。Peng等［65］研究證實(shí)，添加10-4 mol·L-1褪黑素可以使H2O2誘導(dǎo)的牦牛著床前胚胎中GPx和CAT活性增加，ROS水平降低，顯著改善牦牛胚胎體外生產(chǎn)中囊胚的數(shù)量和質(zhì)量。Wang等［42］發(fā)現(xiàn)，10-7 mol·L-1褪黑素在牛胚胎發(fā)育過(guò)程中顯著上調(diào)了抗氧化基因Gpx4和Sod1的表達(dá)，從而清除ROS，減少氧化損傷，促進(jìn)牛胚胎健康發(fā)育。

褪黑素通過(guò)清除自由基減少氧化應(yīng)激的能力與其濃度直接相關(guān)。在更高的濃度下有更多的抗氧化劑分子可以淬滅自由基，從而降低氧化損傷和相關(guān)疾病［66］。Zhao等［22］將牛卵母細(xì)胞用不同濃度（10-7、10-9、10-11 mol·L-1）的褪黑素進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)10-7 mol·L-1褪黑素組ROS水平最低，高濃度的褪黑素顯著降低了牛卵母細(xì)胞中的ROS水平。Marques等［62］用不同濃度（10-7、10-9、10-11 mol·L-1）的褪黑素培養(yǎng)牛卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)10-7 mol·L-1褪黑素處理的卵母細(xì)胞內(nèi)ROS量最低。綜上所述，褪黑素可以通過(guò)其抗氧化作用，增加母牛卵泡細(xì)胞、顆粒細(xì)胞以及胚胎中抗氧化酶基因的表達(dá)，直接清除ROS，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激。

2.4" 自噬作用

褪黑素可以通過(guò)調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞內(nèi)自噬反應(yīng)調(diào)控母牛生殖。褪黑素能夠減少對(duì)母牛生殖細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵成分的損害，包括線粒體基因組和電子傳遞鏈的蛋白質(zhì)等，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬［67］。Gao等［50］用褪黑素（10-3 mol·L-1）預(yù)處理牛BEND細(xì)胞1 h，隨后與LPS（1 μg·mL-1）共孵育24 h，發(fā)現(xiàn)褪黑素增加了BEND細(xì)胞中線粒體自噬相關(guān)蛋白芐氯素1（BECLIN1）、LC3-II、帕金森蛋白（PARKIN）和磷酸酶張力蛋白誘導(dǎo)激酶1 （PINK1）的表達(dá)水平，降低了p62的表達(dá)，表明褪黑素可以調(diào)節(jié)線粒體自噬，促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的BEND細(xì)胞自噬能力，緩解LPS造成的損傷。Xu等［32］研究證實(shí)，用10-8 mol·L-1褪黑素預(yù)處理牛卵巢顆粒細(xì)胞可以增加PINK1、PARKIN、BECLIN1和LC3-II/微管相關(guān)蛋白輕鏈3I（LC3-I）的表達(dá)，促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的牛卵巢顆粒細(xì)胞線粒體自噬以及有絲分裂體和溶酶體的融合，改善牛卵巢顆粒細(xì)胞線粒體損傷和線粒體自噬不足，緩解牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。褪黑素也可以通過(guò)抑制細(xì)胞自噬和線粒體自噬緩解霉菌毒素對(duì)母牛生殖的毒害作用。Yang等［36］使用褪黑素培養(yǎng)牛卵巢顆粒細(xì)胞，可以顯著抑制HT-2毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬相關(guān)因子7（Atg7）mRNA表達(dá)的上調(diào)，減輕HT-2毒素引起的p62 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，降低HT-2毒素誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)上調(diào)，有效緩解HT-2毒素誘導(dǎo)的牛卵巢顆粒細(xì)胞自噬作用。El-Sheikh等［68］在胡茹酮暴露的牛卵母細(xì)胞培養(yǎng)基中添加2×10-5 mol·L-1褪黑素治療，發(fā)現(xiàn)褪黑素可以顯著降低胡茹酮誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1（Drp1）的表達(dá)水平，抑制線粒體自噬，緩解卵母細(xì)胞凋亡。綜上，褪黑素可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和線粒體自噬相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)緩解不利因素對(duì)母牛生殖細(xì)胞的損傷。

近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可以緩解鐵過(guò)載誘導(dǎo)的鐵死亡，減輕線粒體功能障礙，減少生殖細(xì)胞自噬［69］。鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡十分必要。鐵穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)觸發(fā)鐵過(guò)載，鐵過(guò)載可作為氧化還原反應(yīng)的催化劑，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累，從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性［70］。Fu等［71］研究證實(shí)，補(bǔ)充10-3 mol·L-1褪黑素可以抵消玉米赤霉烯酮（ZEN）誘導(dǎo)的人顆粒細(xì)胞系（KGN）和小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（mEC）鐵死亡，降低鐵死亡相關(guān)標(biāo)志物（P53和?；o酶A合成酶長(zhǎng)鏈家族成員（ACSL4）的蛋白表達(dá)，減少ZEN誘導(dǎo)的病理性線粒體和自噬體的產(chǎn)生。因此，褪黑素可以用于緩解鐵過(guò)載誘導(dǎo)的鐵死亡，從而緩解生殖細(xì)胞自噬，但目前尚未發(fā)現(xiàn)褪黑素調(diào)控鐵死亡誘導(dǎo)母牛生殖細(xì)胞自噬的相關(guān)研究。

2.5" 改變微生物組成

褪黑素可以改變瘤胃微生物組成，進(jìn)而影響母牛繁殖和生殖道健康狀態(tài)。Fu等［5］通過(guò)建立奶牛體外瘤胃發(fā)酵模型，發(fā)現(xiàn)褪黑素可以提高瘤胃細(xì)菌群落的α多樣性，顯著降低產(chǎn)生丙酸的主要瘤胃細(xì)菌普雷沃氏菌科，增加有益細(xì)菌的豐度，降低致病細(xì)菌的豐度。郭燕［72］通過(guò)分析褪黑素與水牛瘤胃微生物和其他生殖激素季節(jié)性變化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)水牛瘤胃液和血清中的褪黑素濃度以及其他生殖激素均與瘤胃微生物相關(guān)，其中Latescibacterota 與水牛瘤胃內(nèi)褪黑素水平負(fù)相關(guān)。Acidobacteriota與瘤胃液中的孕酮（P）濃度負(fù)相關(guān)，與瘤胃液中的促卵泡素（FSH）濃度正相關(guān)；Gemmatimonadota、Actinobacteriota與FSH、促黃體素（LH）濃度正相關(guān)，與P濃度負(fù)相關(guān)；Caldatribacteriota與LH、P濃度負(fù)相關(guān)；Dependentiae與P、雌激素（E2）濃度正相關(guān)；Methylomirabilota與LH、E2濃度負(fù)相關(guān)。褪黑素能夠改變瘤胃微生物的組成，后者又影響其他生殖激素的分泌。因此，外源褪黑素可能通過(guò)調(diào)節(jié)瘤胃微生物組成，從而調(diào)控母牛生殖。

此外，褪黑素也可能通過(guò)調(diào)節(jié)母牛陰道微生物群的變化來(lái)調(diào)控母牛生殖。Messman等［73］證實(shí)，從母牛妊娠第160天開始，每天在其日糧中添加20 mg褪黑素，可以改變牛陰道細(xì)菌群落的β多樣性，導(dǎo)致好氧屬比例增加。表明褪黑素可以改變陰道微生物群的組成，而陰道微生物群又與生殖道的健康有關(guān)。Otero等［74］研究了健康奶牛從斷奶到配種年齡的陰道細(xì)菌菌群改變，發(fā)現(xiàn)鏈球菌和葡萄球菌在整個(gè)研究期間水平相似，而乳酸桿菌水平在奶牛生長(zhǎng)過(guò)程中增加，定植在奶牛陰道黏膜上的本地微生物群通過(guò)動(dòng)態(tài)的細(xì)菌群落促進(jìn)了生殖道的健康。Wang等［75］通過(guò)評(píng)估肉牛卵泡期和黃體期之間的陰道微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)肉牛卵泡期和黃體期陰道細(xì)菌總數(shù)無(wú)顯著差異，但黃體期陰道鏈球菌數(shù)量顯著高于卵泡期，卵泡期陰道乳酸菌屬數(shù)量顯著高于黃體期。Bicalho等［76］研究發(fā)現(xiàn)，患有胎盤滯留（RP）、子宮炎、子宮內(nèi)膜炎（CE）的奶牛在產(chǎn)后第7天時(shí)總細(xì)菌載量（TBL）均顯著高于健康奶牛，表明陰道微生物群對(duì)母牛的繁殖性能十分重要。

因此，褪黑素可能通過(guò)調(diào)節(jié)陰道微生物的變化進(jìn)而影響母牛的繁殖性能。但關(guān)于褪黑素對(duì)母牛陰道微生物的調(diào)節(jié)機(jī)制研究較少，褪黑素如何通過(guò)陰道微生物調(diào)控母牛的繁殖性能目前還尚未有定論。

3" 小結(jié)和展望

適量外源褪黑素可以通過(guò)與受體（MT1或MT2）結(jié)合，促進(jìn)抗炎因子、抑制促炎因子表達(dá)，增強(qiáng)抗氧化功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬或線粒體自噬以及改變微生物組成等通路促進(jìn)正?；驊?yīng)激狀態(tài)下母牛體內(nèi)（外）卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和胚胎發(fā)育。下一步應(yīng)深入研究褪黑素對(duì)不同品種（屬）母牛個(gè)體或生殖細(xì)胞的最適添加劑量、添加方式和添加階段，以及褪黑素在不同生殖器官和生殖細(xì)胞中發(fā)揮作用的具體機(jī)制。

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↑表示促進(jìn)，↓表示抑制，虛線表示可能作用

↑ indicates promotion， ↓ indicates suppression， and dotted line indicates possible effect

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（編輯" 郭云雁）