摘" 要： 旨在探究唾液乳桿菌對(duì)奶山羊隱性乳腺炎的治療效果。本試驗(yàn)隨機(jī)選用患有乳腺炎的奶山羊12只，其中6只作為益生菌治療組，6只作為乳腺炎模型對(duì)照組；隨機(jī)選用健康奶山羊12只，其中6只作為益生菌對(duì)照組，6只作為空白對(duì)照組。益生菌治療組與益生菌對(duì)照組每天飼喂唾液乳桿菌，其余不作處理。在飼喂第0、28天采集奶山羊血液、糞便和乳汁，通過(guò)熒光定量PCR和16S rRNA菌群測(cè)序的方法，分別檢測(cè)血清炎癥因子、腸道和乳汁菌群變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，奶山羊飼喂唾液乳桿菌后隱性乳腺炎的發(fā)病率從36.36%下降至13.64%；血液中IL-17、IL-1β和IL-6等炎性因子的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，而抗炎因子IL-10的相對(duì)表達(dá)量顯著升高；腸道和乳汁中的微生物Alpha多樣性升高，菌群多樣性增加，在腸道微生物門水平上顯著提高了厚壁菌門的相對(duì)豐度，降低了擬桿菌門的相對(duì)豐度，在乳汁微生物門水平上提高了厚壁菌門和藍(lán)藻菌門的相對(duì)豐度，降低了變形菌門的相對(duì)豐度。綜上表明，唾液乳桿菌對(duì)隱性乳腺炎具有較好的治療效果，具有應(yīng)用于隱性乳腺炎治療的臨床前景。

關(guān)鍵詞： 奶山羊；隱性乳腺炎；唾液乳桿菌；腸道菌群；乳汁微生物

中圖分類號(hào)：S857.26

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）12-5706-10

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.033

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

收稿日期：2023-10-31

基金項(xiàng)目：陜西省2023年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（S202310712366）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2452023072）

作者簡(jiǎn)介：朱" 芳（1998-），女，河南商丘人，碩士，主要從事奶山羊乳房炎研究，E-mail： zhufang@nwsuaf.edu.cn；李璐璐（2001-），女，河北邯鄲人，碩士，主要從事動(dòng)物益生菌研究，E-mail：lilulu778@nwsuaf.edu.cn。朱芳和李璐璐為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：趙慧英，主要從事動(dòng)物神經(jīng)內(nèi)分泌研究，E-mail： zhaohuiying@nwsuaf.edu.cn；陳德坤，主要從事山羊重大疫病的免疫防治研究，E-mail：cdk@nwsuaf.edu.cn；馬文濤，主要從事山羊重大疫病的免疫防治研究，E-mail：mawentao@nwsuaf.edu.cn#同等貢獻(xiàn)作者

Treatment Effects of Lactobacillus salivarius on Subclinical Mastitis in Dairy Goats

ZHU Fang1， LI" Lulu1， ZHAO" Hongyi1， DONG" Yarong1， JIANG" Yuecai1， LI" Dengliang1， ZHANG" Tianliang2， XIONG" Nannan1， CHEN" Dekun1*， MA" Wentao1*， ZHAO" Huiying1*

（1.College of Veterinary Medicine， Northwest Aamp;F University， Yangling 712100，" China;

2.Shaanxi Qianyang Shaneng Milk Goat Development Company， Baoji 721100，" China）

Abstract：" The aim of this study was to explore the therapeutic effect of Lactobacillus salivarius on latent mastitis of dairy goats， in this study， 12 dairy goats with mastitis were randomly selected， of which 6 were used as probiotic treatment group and 6 were used as mastitis model control group. Another twelve healthy dairy goats were selected， of which 6 were used as probiotics prevention group and 6 were used as blank control group. Probiotic treatment group and probiotic control group were fed Lactobacillus salivary every day， and the rest groups were not treated. The milk， anticoagulant and rectal contents of dairy goats were collected after feeding on day 0 and 28. The changes of blood inflammatory factors， intestinal flora and milk flora were detected by fluorescence quantitative PCR and 16S rRNA microflora sequencing， respectively. The results showed that the incidence of subclinical mastitis of dairy goats fed Lactobacillus salivary decreased from 36.36% to 13.64%， The relative expression levels of inflammatory factors such as IL-17， IL-1β and IL-6 were significantly decreased， while the relative expression levels of anti-inflammatory factor IL-10 were significantly increased. The microbial Alpha diversity increased in the gut and milk， and the diversity of flora increased， which significantly increased the relative abundance of Firmicutes and decreased the relative abundance of Bacteroidetes at the phylum level of intestinal microbiome， and increased the relative abundance of Firmicutes and Cyanobacteria at the phylum level of milk microbiome， and decreased the relative abundance of Proteobacteria.In conclusion， Lactobacillus salivarius has a good therapeutic effect on occult mastitis， and has a clinical prospect for the treatment of occult mastitis.

Key words： dairy goats; subclinical mastitis; Lactobacillus salivarius; intestinal flora; milk microorganisms

*Corresponding authors：" ZHAO Huiying， E-mail： zhaohuiying@nwsuaf.edu.cn; CHEN Dekun， E-mail：cdk@nwsuaf.edu.cn; MA Wentao， E-mail：mawentao@nwsuaf.edu.cn

隱性乳腺炎是泌乳期奶山羊較常發(fā)生的一種乳腺炎類型，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降和奶品質(zhì)降低，給奶山羊養(yǎng)殖戶帶來(lái)不小的經(jīng)濟(jì)損失且對(duì)奶山羊養(yǎng)殖業(yè)造成不利影響［1-2］。調(diào)查顯示，我國(guó)奶山羊乳腺炎的發(fā)病率在40%左右，其中隱性乳腺炎的檢出率較高［3］，但因其癥狀不明顯，臨床上很難及時(shí)采取相應(yīng)的防治措施，在特定條件下會(huì)轉(zhuǎn)變成亞臨床型乳腺炎，進(jìn)一步發(fā)展為臨床乳腺炎，對(duì)奶山羊造成難以挽回的損傷。由此可見(jiàn)，隱性乳腺炎是奶山羊養(yǎng)殖過(guò)程中最大的潛在威脅之一，因此做好預(yù)防措施、及早發(fā)現(xiàn)及早治療對(duì)奶山羊養(yǎng)殖業(yè)有十分重要的意義。病原微生物是引起奶山羊乳腺炎的主要因素，故長(zhǎng)期以來(lái)多以抗生素治療為主［4］，但抗生素的長(zhǎng)期使用不但存在細(xì)菌耐藥風(fēng)險(xiǎn)，殘留在乳中的抗生素也會(huì)嚴(yán)重影響乳汁品質(zhì)，降低其經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)帶來(lái)一系列的食品安全問(wèn)題，因此尋求安全有效的乳腺炎治療方法具有重要意義［5-6］。近年來(lái)，中藥［7］、抗菌肽［8］、乳酸菌［9］和細(xì)菌素［10］等逐漸應(yīng)用于乳腺炎的治療并取得良好的效果。乳酸菌作為乳腺組織中的一種有益菌，可以有效抑制入侵乳腺組織的病原菌生長(zhǎng)［11］。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌中的唾液乳桿菌具有免疫調(diào)節(jié)功能［12］、抗氧化作用［13］和抑菌功能［14］等，且對(duì)引起隱性乳腺炎的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等主要致病菌具有較好的抑制作用［15］。本研究通過(guò)飼喂奶山羊唾液乳桿菌，并利用加利福尼亞乳腺炎試驗(yàn)（California mastitis test， CMT）、熒光定量PCR和16S rRNA菌群測(cè)序等方法，研究唾液乳桿菌對(duì)奶山羊隱性乳腺炎的治療效果，以期為唾液乳桿菌在乳腺炎上的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 試驗(yàn)動(dòng)物

從陜西省千陽(yáng)縣某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)選擇1～3歲泌乳期奶山羊24只。

1.1.2" 菌種

唾液乳桿菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，分離自健康奶山羊糞便。

1.1.3" 主要儀器和試劑

熒光定量PCR儀，美國(guó)Life Technologies公司；4℃高速離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；核酸蛋白測(cè)定儀，賽默飛世技科技有限公司；漩渦振蕩器，江蘇天翎儀器有限公司；不同量程移液器，德國(guó)Eppendorf公司。

RNA-iso Plus，日本TaKaRa公司；Fast Kingc DNA試劑盒和SYBR Premix Ex Taq試劑，天根生化科技有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" 加利福尼亞乳腺炎試驗(yàn)方法

無(wú)菌采集2～3 mL乳汁樣本，進(jìn)行加利福尼亞乳腺炎試驗(yàn)（CMT）。加利福尼亞乳腺炎快速診斷試劑的配置方法與判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期創(chuàng)建的方法［16］，奶山羊患有隱性乳腺炎時(shí)，乳汁CMT檢測(cè)會(huì)有絮狀沉淀物。在測(cè)試盤用2 mL CMT診斷試劑與乳汁混合、緩慢搖動(dòng)，觀察液體顏色變化和凝膠沉聚變化，20 s內(nèi)判定結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

1.2.2" 試驗(yàn)動(dòng)物分組

將泌乳期奶山羊的乳汁樣本進(jìn)行CMT檢測(cè)后，隨機(jī)選用患有乳腺炎的奶山羊12只，其中6只作為益生菌治療組，6只作為乳腺炎模型對(duì)照組；選用未患有乳腺炎的健康奶山羊12只，其中6只作為益生菌對(duì)照組，6只作為空白對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組與乳腺炎模型對(duì)照組不進(jìn)行飼喂唾液乳桿菌；益生菌治療組與益生菌對(duì)照組：每天飼喂唾液乳桿菌100 mL，唾液乳桿菌的濃度為1.0×108 CFU·mL－1。

1.2.3" 樣品采集

飼喂前為第0天，分別在飼喂的第0、28天使用乳房基底部按摩擠壓的方法采集各組奶山羊乳汁，4℃保存，用于后續(xù)CMT檢測(cè)和菌群測(cè)序分析；在飼喂的第0、28天收集益生菌治療組奶山羊直腸糞便樣本，并將采集的糞便樣本立即放置于液氮中儲(chǔ)存并轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室-80℃低溫冰箱保存，用于后續(xù)菌群測(cè)序分析；在飼喂的第28天采集奶山羊血液于抗凝管中，4℃保存，用于PBMCs的分離提取以及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)。

1.2.4" 唾液乳桿菌的濃度測(cè)定

活化培養(yǎng)唾液乳桿菌菌株，菌液按2%接種量分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后取出，將菌液濃度稀釋至1.0×108 CFU·mL－1。

1.2.5" 熒光定量PCR檢測(cè)血液樣品中炎性因子表達(dá)

1.2.5.1" 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）的分離：

采集試驗(yàn)羊頸靜脈外周血1 mL于抗凝血管中，置于水平離心機(jī)800×g離心5 min。吸棄上清液并在超凈工作臺(tái)中加入5 mL的紅細(xì)胞裂解液，充分混勻后置于4 ℃冰箱靜置10 min，期間每隔5 min顛倒混勻1次。裂解后加入5 mL的無(wú)菌PBS緩沖液終止，800×g離心5 min。吸棄上清液，底部沉淀即為PBMCs。取1 mL的RNAiso plus溶液加到上述分離的PBMCs中，混勻后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.5.2" 樣品RNA提?。?/p>

將上述樣品從-80 ℃冰箱取出后，室溫溶解，然后顛倒混勻，在冰上放置5 min；加入1/5體積的預(yù)冷三氯甲烷，在漩渦振蕩器上振蕩15 s，使其充分乳化后，室溫放置5 min，4℃下12 000×g離心15 min；將上層水相吸出，加入到一個(gè)新的 RNase-free EP管里；加入相同體積的預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min，4℃下12 000×g離心10 min；棄掉上清，沿管壁緩緩加入1 mL試驗(yàn)前預(yù)冷的75% DEPC乙醇，輕輕上下顛倒洗滌，4℃下12 000×g離心5 min；棄掉上清，室溫干燥沉淀2～5 min，沿管壁緩緩加入10～100 μL的無(wú)RNA酶的水溶解RNA，輕輕吹打使其混勻，測(cè)定其濃度，將RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.3" RNA反轉(zhuǎn)錄：

按照試劑盒說(shuō)明書的方法，配制基因組DNA的去除體系和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系；將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的Mix，加到gDNA去除步驟的反應(yīng)液中，充分混勻；42℃，孵育15 min；95 ℃，孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后續(xù)試驗(yàn)，或低溫保存。

1.2.5.4" Real-time PCR檢測(cè)相關(guān)因子變化：

引物序列如表2所示；按照試劑盒說(shuō)明書要求配制反應(yīng)體系和設(shè)置熒光定量PCR擴(kuò)增儀器反應(yīng)程序。2-△△CT法分析擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.6" 糞便和乳汁16S rRNA菌群測(cè)序

測(cè)序區(qū)域?yàn)榧?xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)。使用Illumina Mi Seq平臺(tái)進(jìn)行結(jié)果分析。F.BF代表益生菌治療組飼喂唾液乳桿菌前采集的糞便，即第0天的糞便；F.AF代表飼喂唾液乳桿菌后采集的糞便，即第28天的糞便。M.BF代表益生菌治療組飼喂唾液乳桿菌前采集的乳汁，即第0天的乳汁；M.AF代表益生菌治療組飼喂唾液乳桿菌后采集的乳汁，即第28天的乳汁。此部分試驗(yàn)由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.7" 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用t檢驗(yàn)進(jìn)行組件差異顯著性檢驗(yàn)。“*”表示差異顯著Plt;0.05，“**”表示差異極顯著Plt;0.01。

2" 結(jié)" 果

2.1" 唾液乳桿菌對(duì)奶山羊隱性乳腺炎的治療效果

對(duì)采取的乳汁樣本進(jìn)行 CMT 試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果如" 表3所示，飼喂唾液乳桿菌28 d后，隱性乳腺炎檢出率從36.36%下降至13.64%（Plt;0.05）；未飼喂唾液乳桿菌組隱性乳腺炎檢出率從36.11%上升至38.89%。（檢出率/%=奶山羊隱性乳腺炎陽(yáng)性樣品數(shù)/總樣品數(shù)×100）

2.2" 唾液乳桿菌對(duì)奶山羊隱性乳腺炎血液中炎癥因子的影響

將采取的奶山羊血液樣本分離外周血細(xì)胞，使用qPCR的方法檢測(cè)奶山羊血液中相關(guān)細(xì)胞因子相對(duì)表達(dá)量的變化，檢測(cè)結(jié)果如圖1。與空白對(duì)照組相比，乳腺炎組IL-17、IL-6、IL-1β、IL-23和TNF-α的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，而IL-10的相對(duì)表達(dá)量降低；益生菌治療組飼喂唾液乳桿菌后，與乳腺炎組相比，細(xì)胞因子IL-17、IL-6、IL-1β、IL-23和TNF-α的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，IL-10的相對(duì)表達(dá)量顯著升高。

2.3" 唾液乳桿菌對(duì)隱性乳腺炎奶山羊腸道菌群的影響

2.3.1" 糞便微生物Alpha多樣性指數(shù)

Alpha多樣性指數(shù)適用于評(píng)估樣品自身菌群的豐度與多樣性之間的差異，其中Shannon指數(shù)與群落多樣性和物種分布有關(guān)，Simpson指數(shù)用來(lái)表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度，ACE指數(shù)是用來(lái)估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，Chao1指數(shù)用于估計(jì)群落樣品中包含的物種總數(shù)。Shannon及Simpson指數(shù)值越大，表明群落的多樣性越高，Chao1或ACE指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高［17］。圖2結(jié)果可知，F(xiàn).AF的Shannon和Simpson指數(shù)均顯著高于F.BF；Chao1和ACE指數(shù)有上升趨勢(shì)但無(wú)明顯差異。

2.3.2" 糞便微生物共有OTU分析結(jié)果

依據(jù)糞便菌群測(cè)序結(jié)果計(jì)算糞便微生物共有的OTU數(shù)量，樣本間共有的OTU和獨(dú)有的OTU之間的關(guān)系通過(guò)Venn圖展示。結(jié)果見(jiàn)圖3，圖中每個(gè)圓代表一組樣本，重疊區(qū)域?yàn)楦鹘M所共有的OTU，每個(gè)區(qū)域的數(shù)字表示該區(qū)域所對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)量。結(jié)果表明，經(jīng)飼喂唾液乳桿菌，糞便微生物所獨(dú)有的OTU數(shù)量大于飼喂前。

2.3.3" 糞便微生物門水平菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

飼喂唾液乳桿菌后奶山羊腸道菌群門水平上的變化

結(jié)果如圖4?？梢?jiàn)奶山羊糞便中主要優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）。經(jīng)飼喂唾液乳桿菌，奶山羊腸道中微生物類群在門水平上顯著升高，厚壁菌門的相對(duì)含量有所增加，擬桿菌門的相對(duì)含量顯著降低。

2.4" 唾液乳桿菌對(duì)奶山羊乳汁菌群的影響

2.4.1" 乳汁微生物Alpha多樣性指數(shù)

對(duì)飼喂唾液乳桿菌前、后的乳汁樣本進(jìn)行微生物菌群測(cè)序，結(jié)果如圖5，M.AF的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)明顯高于M.BF，表明飼喂唾液乳桿菌可使乳汁菌群多樣性升高。

2.4.2" 乳汁微生物共有OTU分析結(jié)果

依據(jù)乳汁菌群測(cè)序結(jié)果計(jì)算乳汁微生物的OTU數(shù)量，將各組樣本共有的OTU和獨(dú)有的OTU之間的關(guān)系通過(guò)Venn圖展示。結(jié)果見(jiàn)圖6，圖中每個(gè)圓代表一組樣本，重疊區(qū)域表示各組所共有的OTU，每個(gè)區(qū)域的數(shù)字表示該區(qū)域所對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)量。由圖可見(jiàn)，飼喂唾液乳桿菌后乳汁微生物所獨(dú)有的OTU數(shù)量大于飼喂前。

2.4.3" 乳汁微生物門水平菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

對(duì)乳汁微生物在門水平的組成及分布進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7。奶山羊乳汁中主要優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。飼喂唾液乳桿菌后乳汁微生物菌群在門水平上的微生物類群數(shù)顯著升高，變形菌門的相對(duì)豐度顯著降低，厚壁菌門和藍(lán)藻菌門的相對(duì)豐度顯著升高。

3" 討" 論

細(xì)胞因子在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，Th1細(xì)胞釋放引起炎癥和抗病毒作用的細(xì)胞因子，如IL-1、IL-2、TNF-α、TNF-β和IFN-γ等，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)；Th2細(xì)胞可產(chǎn)生促進(jìn)體液免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子，如IL-4，IL-5，IL-6，IL-10和IL-13等［18］。正常情況下，Th1和Th2兩類細(xì)胞有一定的比例，兩者協(xié)調(diào)，使人體免疫保持平衡。但機(jī)體發(fā)生功能異常時(shí)，常表現(xiàn)出平衡偏向其中一方，一旦Th1/Th2之間的平衡狀態(tài)被打破，會(huì)導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。菌株對(duì)炎癥的益處是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和平衡來(lái)介導(dǎo)的，而這種調(diào)節(jié)可以通過(guò)細(xì)胞因子血清水平的測(cè)量結(jié)果來(lái)顯示［19］。研究發(fā)現(xiàn)，唾液乳桿菌對(duì)TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子具有抑制作用，并使抑炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的表達(dá)增加［20］。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)奶山羊發(fā)生隱性乳腺炎時(shí)，血液中TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-6等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，而IL-10的相對(duì)表達(dá)量顯著降低。飼喂唾液乳桿菌后，血液中IL-17、IL-6和IL-1β等的相對(duì)表達(dá)量降低，IL-10的相對(duì)表達(dá)量升高。以上研究表明，唾液乳桿菌對(duì)機(jī)體具有免疫調(diào)節(jié)作用。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，在乳腺疾病期間可能存在腸道-乳腺軸［21］，腸道微生物群在宿主防御乳腺炎過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Zhao等［22］研究顯示，腸道菌群的失調(diào)促進(jìn)了志賀桿菌在腸-乳腺軸上的易位，正常情況下，腸道處于嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，有利于厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）等專性厭氧細(xì)菌的生存。然而，腸道炎癥或微生物生態(tài)失調(diào)引起的腸道通透性增加增加了腸道內(nèi)的氧含量，使兼性厭氧菌如變形桿菌茁壯成長(zhǎng)。代謝產(chǎn)物如硝酸鹽和亞硝酸鹽等也可以為腸桿菌科提供生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)［23］。因此，腸道炎癥或生態(tài)失調(diào)可能有利于腸桿菌科等在腸道中的生長(zhǎng)，并隨后轉(zhuǎn)移到乳腺。Hu等［24］也研究了瘤胃微生物群對(duì)牛乳腺炎的影響，結(jié)果表明外源性致病微生物和內(nèi)源性致病因素共同引起乳腺炎，瘤胃菌群失調(diào)所導(dǎo)致的瘤胃脂多糖的含量升高，脂多糖通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入乳腺，破壞血乳屏障，進(jìn)而誘發(fā)奶牛的乳腺炎癥。研究腸道菌群在宿主防御金黃色葡萄球菌感染引起的乳腺炎中的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群失調(diào)小鼠的血乳屏障通透性增加，致病菌的豐度顯著增加，而產(chǎn)生短鏈脂肪酸的細(xì)菌門（如厚壁菌門）的相對(duì)豐度顯著降低，加快了金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)乳腺炎的進(jìn)程，進(jìn)行菌群移植后可減輕致病菌對(duì)乳腺組織的損傷［25］。本研究經(jīng)飼喂唾液乳桿菌，發(fā)現(xiàn)奶山羊腸道中微生物類群在門水平上顯著升高，厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)含量有所增加，擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)含量顯著降低，說(shuō)明唾液乳桿菌能夠幫助恢復(fù)腸道微生物的平衡。同時(shí)，改變的乳腺微環(huán)境有利于致病菌的生存［26］。因此本研究也對(duì)乳汁菌群進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)飼喂唾液乳桿菌后乳汁微生物菌群在門水平上的微生物類群數(shù)顯著升高，變形菌門的相對(duì)豐度顯著降低，厚壁菌門和藍(lán)藻菌門的相對(duì)豐度顯著升高，顯現(xiàn)出唾液乳桿菌飼喂對(duì)乳汁菌群的調(diào)節(jié)能力。

本研究將唾液乳桿菌分別飼喂患有隱性乳腺炎的奶山羊和未患隱性乳腺炎的奶山羊，探究唾液乳桿菌對(duì)奶山羊隱性乳腺炎的防治效果。通過(guò)CMT試驗(yàn)對(duì)奶山羊乳汁進(jìn)行隱性乳腺炎發(fā)病率的檢測(cè)，結(jié)果顯示，飼喂唾液乳桿菌28 d后，奶山羊隱性乳腺炎的檢測(cè)率顯著降低，空白對(duì)照組隱性乳腺炎的檢測(cè)率有微弱上升趨勢(shì)。隨后為了探究唾液乳桿菌對(duì)隱形乳腺炎產(chǎn)生影響的方式，又檢測(cè)了山羊血液中炎癥因子的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)患有隱性乳腺炎的奶山羊經(jīng)飼喂唾液乳桿菌，血液中促炎因子的相對(duì)表達(dá)量顯著降低、抑炎因子的相對(duì)表達(dá)量顯著升高。之后將奶山羊隱性乳腺炎治療組的糞便與乳汁樣本進(jìn)行菌群檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，飼喂唾液乳桿菌前、后奶山羊的糞便和乳汁菌群均發(fā)生了顯著差異。與飼喂前相比，飼喂唾液乳桿菌后的奶山羊腸道和乳汁菌群Alpha多樣性升高，這說(shuō)明唾液乳桿菌可以改變腸道和乳汁菌群的物種分布，從而使菌落多樣性顯著提高。與飼喂前相比，腸道和乳汁微生物在門水平上的類群數(shù)量均顯著升高。表明唾液乳桿菌具有調(diào)節(jié)腸道和乳汁的菌群組成的功能，對(duì)奶山羊隱性乳腺炎具有較好的治療效果。

4" 結(jié)" 論

奶山羊飼喂唾液乳桿菌后，隱性乳腺炎的檢測(cè)率顯著下降，隱性乳腺炎奶山羊血液中促炎因子的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，表明唾液乳桿菌對(duì)隱性乳腺炎有較好的防治效果?；加须[性乳腺炎的奶山羊飼喂唾液乳桿菌后，糞便和乳汁微生物菌群多樣性顯著增加，糞便中厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)含量有所增加，擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)含量顯著降低，乳汁中厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度增加，擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度降低，表明唾液乳桿菌能夠調(diào)節(jié)腸道和乳汁的菌群組成。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］" 趙興緒.獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)［M］.第3版.北京：農(nóng)業(yè)出版社，2002.

ZHAO X X.Veterinary obstetrics［M］.3rd ed.Beijing：China Agriculture Press，2002.（in Chinese）

［2］" PUGGIONI G M G，TEDDE V，UZZAU S，et al.Relationship of late Lactation milk Somatic cell count and cathelicidin with intramammary infection in small ruminants［J］.Pathogens，2020，9（1）：37.

［3］" 彭" 群.奶山羊隱性乳房炎病原菌分離鑒定及滅活疫苗免疫效果評(píng)估［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2021.

PENG Q.Isolation and identification of pathogenic bacteria of recessive mastitis in dairy goats and evaluation of immune effect of inactivated vaccine［D］.Yangling：Northwest Aamp;F University，2021.（in Chinese）

［4］" 顏余同.山羊乳汁體細(xì)胞中抗菌肽S100A7與乳房炎的關(guān)系研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2021.

YAN Y T.Study on the relationship between antibacterial peptide S100A7 in goat milk somatic cells and mastitis［D］.Yangling：Northwest Aamp;F University，2021.（in Chinese）

［5］" RAINARD P，RIOLLET C.Innate immunity of the bovine mammary gland［J］.Vet Res，2006，37（3）：369-400.

［6］" RUEGG P L.Making antibiotic treatment decisions for clinical mastitis［J］.Vet Clin North Am：Food Anim Pract，2018，34（3）：413-425.

［7］" ALEKISH M O，ISMAIL Z B，AWAWDEH M S，et al.Effects of intramammary infusion of sage （Salvia officinalis） essential oil on milk somatic cell count，milk composition parameters and selected hematology and serum biochemical parameters in Awassi sheep with subclinical mastitis［J］.Vet World，2017，10（8）：895-900.

［8］" 田" 琛.黃芪中藥組合方劑對(duì)奶牛乳房炎的治療效果［J］.中獸醫(yī)學(xué)雜志，2021（7）：8-9.

TIAN C.Therapeutic effect of astragalus combined with traditional Chinese medicine on mastitis in dairy cows［J］.Chinese Journal of Traditional Veterinary Science，2021（7）：8-9.（in Chinese）

［9］" 郭子記，趙湖北，王" 平，等.復(fù)合納米抗菌肽防治奶山羊乳房炎效果的研究［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2022，43（11）：114-117.

GUO Z J，ZHAO H B，WANG P，et al.Preventing and treating effects of composite Nano antibacterial peptides on dairy goat mastitis［J］.Progress in Veterinary Medicin，2022，43（11）：114-117.（in Chinese）

［10］" LI K，YANG M，JIA L，et al.The prevention effect of Lactobacillus plantarum 17-5 on Escherichia coli-induced mastitis in mice［J］.Probiotics Antimicrob Proteins，2023，15（6）：1644-1652.

［11］" PADUCH J H，LCKING J，MANSION-DE VRIES E，et al.Prevention of intramammary infections by prepartum external application of a teat dip containing Lactic acid bacteria with antimicrobial properties in dairy heifers［J］.Pathogens，2020，9（4）：288.

［12］" KOZAKOVA H，SCHWARZER M，TUCKOVA L，et al.Colonization of germ-free mice with a mixture of three lactobacillus strains enhances the integrity of gut mucosa and ameliorates allergic sensitization［J］.Cell Mol Immunol，2016，13（2）：251-262.

［13］" BERGSTROM K S B，XIA L J.Mucin-type O-glycans and their roles in intestinal homeostasis［J］.Glycobiology，2013，23（9）：1026-1037.

［14］" GRANADO-SERRANO A B，MARTN-GAR M，SNCHEZ V，et al.Faecal bacterial and short-chain fatty acids signature in hypercholesterolemia［J］.Sci Rep，2019，9（1）：1772.

［15］" 蔡賽波.唾液乳桿菌微膠囊制備工藝的研究［D］.昆明：昆明理工大學(xué)，2021.

CAI S B.Study on preparation technology of Lactobacillus salivarius microcapsule［D］.Kunming：Kunming University of Science and Technology，2021.（in Chinese）

［16］" 趙燕清.奶山羊隱性乳腺炎的流行病學(xué)調(diào)查及S.aureus感染小鼠乳腺后Th細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2015.

ZHAO Y Q.Epidemiological Investigation of subclinical mastitis in dairy goats and research on immune response mechanisms of t helper cells to infection with Staphylococcus aureus in murine mammary gland［D］.Yangling：Northwest Aamp;F University，2015.（in Chinese）

［17］" 同娟珍.山羊羊口瘡及乳房炎病程中腸道菌群改變及其對(duì)免疫功能影響的研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2021.

TONG J Z.Study on the changes of intestinal flora and its effects on immune function during ORF and mastitis in goats［D］.Yangling：Northwest Aamp;F University，2021.（in Chinese）

［18］" 朱彤波.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］.四川：四川大學(xué)出版社，2017.

ZHU T B.Medical immunology［M］.Sichuan：Sichuan University Press，2017.（in Chinese）

［19］" HOLOWACZ S，BLONDEAU C，GUINOBERT I，et al.Lactobacillus salivarius LA307 and Lactobacillus rhamnosus LA305 attenuate skin inflammation in mice［J］.Benefic Microbes，2018，9（2）：299-309.

［20］" WANG C H，YEN H R，LU W L，et al.Adjuvant Probiotics of Lactobacillus salivarius subsp.salicinius AP-32，L.johnsonii MH-68，and Bifidobacterium animalis subsp.lactis CP-9 attenuate glycemic levels and inflammatory cytokines in patients with type 1 diabetes mellitus［J］.Front Endocrinol，2022，13：754401.

［21］" PARIDA S，WU S G，SIDDHARTH S，et al.A procarcinogenic colon microbe promotes breast tumorigenesis and metastatic progression and concomitantly activates Notch and β-catenin axes［J］.Cancer Discov，2021，11（5）：1138-1157.

［22］" ZHAO C J，BAO L J，QIU M，et al.Commensal cow Roseburia reduces gut-dysbiosis-induced mastitis through inhibiting bacterial translocation by producing butyrate in mice［J］.Cell Rep，2022，41（8）：111681.

［23］" CHANIN R B，WINTER M G，SPIGA L，et al.Epithelial-derived reactive oxygen species enable AppBCX-mediated aerobic respiration of Escherichia coli during intestinal inflammation［J］.Cell Host Microbe，2020，28（6）：780-788.e5.

［24］" HU X Y，GUO J，ZHAO C J，et al.The gut microbiota contributes to the development of Staphylococcus aureus-induced mastitis in mice［J］.ISME J，2020，14（7）：1897-1910.

［25］" HU X Y，LI S，MU R Y，et al.The rumen microbiota contributes to the development of mastitis in dairy cows［J］.Microbiol Spectr，2022，10（1）：e0251221.

［26］" SOTO-PANTOJA D R，GABER M，ARNONE A A，et al.Diet alters entero-mammary signaling to regulate the breast microbiome and tumorigenesis［J］.Cancer Res，2021，81（14）：3890-3904.

（編輯" 范子娟）