摘 要：為探究優(yōu)化超聲輔助提取大蒜素的工藝條件，為大蒜的深加工提供依據，以大蒜素含量為檢測指標，在傳統(tǒng)乙醇溶劑浸提的基礎上，采取超聲波輔助萃取技術，探究乙醇體積分數(shù)、超聲時間、超聲功率3個因素對大蒜素含量的影響，并在此基礎上開展3因素3水平的正交試驗，借助極差分析和方差分析，得出最佳的超聲輔助萃取工藝。結果表明，3個因素對大蒜素含量的影響均存在極顯著差異，3個因素對大蒜素含量的影響大小排序為超聲功率＞超聲時間＞乙醇體積分數(shù)，同時得出了最佳提取工藝參數(shù)組合，即超聲輔助功率1 000 W、超聲萃取時間35 min、乙醇體積分數(shù)75%。

關鍵詞：大蒜素；有機溶劑；超聲輔助；正交試驗

Study on Ultrasonic Assisted Extraction of Allicin

LI Wenhui， LYU Zhiyuan

（Xinjiang Huachun bio-pharmaceutical Co.， Ltd.， Urumqi 830000， China）

Abstract： In order to explore the optimization of the technological conditions of ultrasonic-assisted extraction of allicin and provide a basis for the deep processing of garlic， the content of allicin is taken as the detection index， and on the basis of traditional ethanol solvent extraction， ultrasonic assisted extraction technology is adopted to explore the influence of three factors： ethanol volume fraction， ultrasonic time and ultrasonic power on the content of allicin. On this basis， the orthogonal test of three factors and three levels is carried out， and the best ultrasonic-assisted extraction process is obtained by means of range analysis and variance analysis. The results show that the effects of the three factors on the content of allicin are significantly different， the order of influence of three factors on the content of allicin is ultrasonic power＞ultrasonic time＞ethanol volume fraction， and the optimal extraction parameters are obtained， that is， ultrasonic auxiliary power of 1 000 W， ultrasonic extraction time of 35 min and ethanol volume fraction of 75%.

Keywords： allicin; organic solvent; ultrasonic assisted; orthogonal experiment

大蒜（Allium sativum L.）性溫、味辛，是餐桌上最常見的食物之一，其可賦予食物辛辣氣味，同時其具有調節(jié)胰島素、抗癌、降低血脂和抗炎殺菌等功效，亦可入藥，是一種典型的食藥兩用植物[1]。

大蒜素（Allicin）是天然存在于大蒜鱗莖中的一種有機硫化合物，是蒜氨酸在蒜氨酸酶的催化下生成的硫代亞磺酸酯類化合物，為淡黃色油狀液體，學名為二烯丙基硫代亞磺酸酯。大蒜素是大蒜的重要生物活性物質之一，且具有大蒜特有的辛辣刺激氣味，是國際公認的具有保健作用和藥用價值的生物活性成分[2]?，F(xiàn)如今，國內外學者對大蒜素藥理作用的研究越來越廣泛和深入。大量的科學研究表明，大蒜素易透過紅細胞膜及磷脂雙分子層，然后進入細胞內，與部分胞內的巰基化合物發(fā)生反應，發(fā)揮其獨特的藥理作用[3]。大蒜素對于細菌、真菌和病毒等多種病原性微生物有不同程度的抑制或殺滅作用，是一種廣譜抑菌藥，具有消炎殺菌、降壓降脂、防止動脈硬化、提高機體免疫力等生物學功能[4]。此外，大蒜素可應用于水產養(yǎng)殖和畜牧業(yè)，可以有效降低動物發(fā)病率，提高其生產性能，降低死亡率，提高生產養(yǎng)殖效益[5]。

目前，國內外有關大蒜素的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2萃取法、雙水相萃取法和有機溶劑浸提法[6]。然而，這些方法各自都存在一些缺陷，如水蒸氣蒸餾法由于高溫提取導致蒜氨酸酶失去活性或被破壞，從而影響大蒜素的產率及產物中有效成分的含量；超臨界CO2萃取法則存在萃取產物與CO2分離困難等缺陷；傳統(tǒng)有機溶劑浸提法存在提取率低、提取時間長等缺點[7]。

為了克服傳統(tǒng)提取方法的局限性，有研究者使用超聲波作為大蒜提取物的輔助提取工具[8]。因超聲波能夠有效地破碎植物組織細胞壁結構，加速細胞裂解，促使細胞內容物釋放，使破碎更加徹底，同時加快擴散速度，從而大大提高萃取效率[9]。因此，本研究在傳統(tǒng)乙醇溶劑浸提的基礎上，采取超聲波輔助萃取技術提取大蒜素，優(yōu)化提取工藝，得到最佳輔助提取條件，為大蒜的深加工及大蒜素新產品的開發(fā)提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

市售新鮮大蒜；無水乙醇、二硫代硝基苯甲酸、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、L-半胱氨酸，均為分析純。試驗中所用試劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 儀器與設備

數(shù)顯恒溫水浴鍋，型號BHS-1，福州泰美實驗儀器有限公司；電子分析天平，型號BSA323S，賽多利斯儀器（北京）有限公司；組織搗碎機，型號JJ-2，常州市萬豐儀器制造有限公司；紫外分光光度計，型號756PC，上海菁華科技有限公司；臺式高速離心機，型號3H16RI，湖南赫西儀器裝備有限公司；超聲清洗儀，型號BILCN10-250，上海比朗儀器制造有限公司。

1.3 大蒜素含量檢測方法

1.3.1 乙醇萃取大蒜素的工藝流程

乙醇萃取大蒜素的工藝流程為鮮蒜去皮處理→低溫搗碎→制得蒜泥→恒溫酶解→有機溶劑（乙醇）萃取→離心分離→取上清液→減壓濃縮→蒜素粗提取液。具體操作為將市場購買的新鮮大蒜去皮洗凈，用組織搗碎機制成蒜泥，再將搗碎的蒜泥放置在恒溫水浴鍋，在38 ℃的恒溫條件下酶解20 min，之后用65%乙醇溶液作為萃取劑，以1∶4（g∶mL）的料液比，在30 ℃的恒溫環(huán)境中萃取40～60 min[10]。萃取結束后，取其上層有機相，放入離心機，在溫度30 ℃、轉速6 000 r·min-1的條件下離心10 min。離心完成取得上清液，設置旋轉蒸發(fā)儀參數(shù)，在0.01 MPa、蒸餾溫度50 ℃、轉速70 r·min-1的條件下進行減壓濃縮，最終制得大蒜素粗提取物[11]。

1.3.2 鮮蒜中大蒜素含量測定

（1）定量檢測原理（分光光度法）。將L-半胱氨酸溶液置于大蒜素粗提取液中，大蒜素可與L-半胱氨酸進行反應，反應結束后剩余的L-半胱氨酸再與5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）進行反應，并生成呈色（淡黃色）物質二硫代硝基苯甲酸[12-13]。該物質在412 nm處有最大吸收波長。因此，可使用紫外可見分光光度計測定呈色物質二硫代硝基苯甲酸在反應前后于波長412 nm處吸光值的變化，由此得出L-半胱氨酸的減少量，從而計算大蒜素的含量[14]。

（2）測定方法。用移液槍準確吸取5 mL濃度為10 mmol·L-1的L-半胱氨酸溶液于試管中，加入1 mL去離子水，充分混勻后吸取1 mL，將其稀釋100倍，定容至100 mL容量瓶中備用。準確吸取4.5 mL上述制得的L-半胱氨酸稀釋液于試管中，同時加入濃度為1.5 mmol·L-1的5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）溶液0.5 mL，充分混勻后將樣液放置在恒溫水浴鍋中，26 ℃下恒溫水浴20 min，使體系充分反應（試驗所用試劑現(xiàn)用現(xiàn)配）。反應結束后用分光光度計測得其在412 nm處的吸光值（A0），即L-半胱氨酸溶液的初始吸光值[15-16]。

用移液槍準確吸取5 mL濃度為10 mmol·L-1的L-半胱氨酸溶液于試管中，加入1 mL上述制得的大蒜素粗提取液，充分混勻后吸取1 mL，將其稀釋100倍，定容至100 mL容量瓶中備用。準確吸取4.5 mL上述制得的稀釋后混合液于試管中，同時加入濃度為1.5 mmol·L-1的5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）溶液0.5 mL，充分混勻后將樣液放置在恒溫水浴鍋中，26 ℃下恒溫水浴20 min，使體系充分反應（試驗所用試劑現(xiàn)用現(xiàn)配）。反應結束后用分光光度計測得其在412 nm處的吸光值（A），即與大蒜素（硫代亞磺酸酯）反應后L-半胱氨酸溶液的吸光值[16]。

大蒜素含量的計算公式[17]為

C=（A0-A）×d×162.26/（2×14 150）（1）

式中：C為大蒜素（硫代亞磺酸酯）的含量，mg·mL-1；A為與大蒜素發(fā)生反應后L-半胱氨酸的吸光值；A0為L-半胱氨酸初始吸光值；d為L-半胱氨酸溶液總稀釋倍數(shù)；162.26為大蒜素相對分子質量；14 150為5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）與L-半胱氨酸反應后生成的二硫代硝基苯甲酸在1 cm光徑下的摩爾消光系數(shù)。

1.4 超聲輔助提取大蒜素工藝研究

1.4.1 單因素試驗

采用超聲輔助提取大蒜素的工藝研究，重點探究乙醇體積分數(shù)、超聲輔助功率和超聲提取時間這3個主要因素對大蒜素含量的影響[18]。

（1）乙醇體積分數(shù)對大蒜素含量的影響。將鮮蒜用組織搗碎機制成蒜泥，準確稱量5份樣品，每份5 g，然后向這5份樣品中以1∶4（g∶mL）的料液比分別加入體積分數(shù)為55%、65%、75%、85%和95%的乙醇溶液。將各組樣液均放置在溫度30 ℃下自然酶解30 min，結束后進行超聲輔助提取，超聲清洗儀參數(shù)設置為工作2 s，間歇1 s；超聲功率800 W；輔助提取時間35 min。超聲輔助提取結束后，離心取上清液，再進行減壓濃縮，根據1.3.2（2）大蒜素的含量測定方法，測定吸光值，每個水平重復3次，計算大蒜素的含量[19-20]。

（2）超聲時間對大蒜素含量的影響。將鮮蒜用組織搗碎機制成蒜泥，準確稱量5份樣品，每份5 g，然后在這5份樣品中以1∶4（g∶mL）的料液比加入體積分數(shù)為75%的乙醇溶液，將各組樣液均放置在溫度30 ℃下自然酶解30 min，結束后進行超聲輔助提取，設置本組樣液的超聲輔助提取時間分別為5 min、15 min、25 min、35 min和45 min，其他參數(shù)設置為工作2 s，間歇1 s；超聲功率800 W。超聲輔助提取結束后，離心取上清液，再進行減壓濃縮，根據1.3.2（2）大蒜素的含量測定方法，測定吸光值，每個水平重復3次，計算大蒜素的含量。

（3）超聲功率對大蒜素含量的影響。將大蒜用搗碎機制成蒜泥，準確稱量5份均為5 g的樣品，然后在這5份樣品中以1∶4（g∶mL）的料液比加入體積分數(shù)為75%的乙醇溶液，將各組樣液在30 ℃下酶解30 min，然后進行超聲輔助。本組樣品超聲功率依次設定為200 W、400 W、600 W、800 W和1 000 W，其他參數(shù)設置為工作2 s，間歇1 s；輔助提取時間35 min。超聲輔助提取結束后，離心取上清液，再進行減壓濃縮，根據1.3.2（2）大蒜素的含量測定方法，測定吸光值，每個水平重復3次，計算大蒜素的含量[21]。

1.4.2 正交試驗

為取得更加可行的工藝參數(shù)，在上述單因素試驗結果的基礎上，選擇乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間和超聲輔助功率這3個對大蒜素含量影響較為顯著的因素，每個因素分別選取3個較優(yōu)水平，對大蒜素含量進行3因素3水平的正交試驗，最終得出最佳的超聲輔助提取工藝參數(shù)[22]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對大蒜素含量的影響

由圖1可知，在超聲輔助提取大蒜素的試驗過程中，當乙醇體積分數(shù)在55%～75%時，大蒜素含量呈直線上升趨勢，乙醇體積分數(shù)為75%時大蒜素含量達到最高；當乙醇體積分數(shù)在75%～85%時，大蒜素含量則隨著乙醇體積分數(shù)的增加呈直線下降趨勢；當乙醇體積分數(shù)提高到85%甚至更高后，大蒜素含量則呈緩慢下降趨勢。造成這一結果的原因可能是，過高的乙醇體積分數(shù)會影響樣品的酶解作用，或者對大蒜素分子產生了破壞分解的作用，導致大蒜素含量下降。

2.1.2 超聲時間對大蒜素含量的影響

由圖2可知，在超聲輔助提取大蒜素的試驗過程中，超聲提取時間在5～35 min時大蒜素含量呈現(xiàn)穩(wěn)步上升趨勢；當提取時間達到35 min時，提取效果最好，大蒜素含量最高；當提取時間超過35 min后，大蒜素含量隨著時間的延長而呈下降趨勢。這可能是由于在超聲波環(huán)境下機體產生熱量，時間越長，產生的熱量越多，對反應體系的影響也就越大。

2.1.3 超聲功率對大蒜素含量的影響

由圖3可知，在超聲輔助提取大蒜素的試驗過程中，超聲功率在200～600 W時大蒜素含量呈先提高后下降的趨勢。這可能是在超聲過程中大蒜素分解所致，也可能是操作過程中對于機器沒有完全散熱就進行提取所致。超聲功率在600～800 W時，大蒜素含量呈明顯上升趨勢，并且超聲功率在800 W時大蒜素含量達到最高。之后將超聲功率提高到1 000 W時，大蒜素含量則呈現(xiàn)下降趨勢。造成這一結果的原因可能是過高的功率致使部分大蒜素分子被破壞[23]。

2.2 正交試驗

正交試驗的因素水平表如表1所示，極差分析結果如表2所示。由表2可知，由K值得到的最優(yōu)組合為A2B3C3，該組合未出現(xiàn)在正交試驗表中。故進行驗證試驗，得到A2B3C3組合下的大蒜素含量為0.152 mg·mL-1，低于正交試驗表中A2B2C3組合（0.157 mg·mL-1）。因此，最優(yōu)組合為A2B2C3。由極差值可得，3個因素對大蒜素含量的影響大小排序為超聲功率＞超聲時間＞乙醇體積分數(shù)。

以大蒜素含量為檢測指標，通過方差分析做進一步驗證，結果得出乙醇體積分數(shù)、超聲時間和超聲功率3個因素對大蒜素含量的影響均存在極顯著差異（P＜0.01）（表3）。

3 結論

本試驗采用超聲波輔助有機溶劑（乙醇）萃取大蒜素，進行單因素試驗，探究乙醇體積分數(shù)、超聲時間、超聲功率3個因素對大蒜素含量的影響，并在此基礎上開展3因素3水平的正交試驗，借助極差分析和方差分析，得出最佳的超聲輔助萃取工藝。結果表明，3個因素對大蒜素含量的影響均存在極顯著差異，3個因素對蒜素含量的影響大小排序為超聲功率＞超聲時間＞乙醇體積分數(shù)；最佳提取工藝參數(shù)組合為超聲輔助功率1 000 W、超聲提取時間35 min、乙醇體積分數(shù)75%。需要注意的是，在此次試驗過程中由于超聲波的作用，使得反應體系的溫度難以把控，會一定程度上影響大蒜素含量，使得試驗結果產生誤差，這一問題有待進一步探討、解決。

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